Ćwiczenie nr 12: Chromatografia
cienkowarstwowa.
Chromatografia cienkowarstwowa jest metodą rozdzielania w układzie ciecz- ciało stałe lub ciecz- ciecz, przeprowadzanego na sproszkowanej fazie stałej w postaci warstwy nałożonej na gładką płytkę ze szkła lub masy plastycznej. Warstwę pokrywającą może stanowić materiał odpowiedni do cieczowej chromatografii kolumnowej. Aby zapewnić dobre przyleganie do płytki, stosuje się dodatek substancji wiążącej jak skrobia lub siarczan wapniowy. Substancja ta nie powinna maskować właściwości adsorbentu.
Kroplę badanej próbki nanosi się w niewielkiej odległości od brzegu płytki i odparowuje rozpuszczalnik. Następnie płytkę umieszcza się pionowo w zamykanej komorze, przy czym dolna krawędź płytki zanurzona jest w rozpuszczalniku rozwijającym. Rozpuszczalnik wznosi się po płytce dzięki działaniu sił kapilarnych. Rozdzielanie zostaje zatrzymane przez wyjęcie płytki, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do jej górnego brzegu. Składniki próbki nie przechodzą przez detektor, jak w odmianie kolumnowej, lecz pozostają na płytce w postaci szeregu oddzielnych plam.
Jeśli składniki są barwne, można je łatwo zlokalizować, lecz częściej są niewidoczne i położenie ich należy ustalać innymi metodami. W licznych związkach następuje wzbudzenie fluorescencji przez naświetlenie promieniami nadfioletowymi. Inną możliwość daje przygotowanie wstępne płytki przez impregnację barwnikiem fluorescencyjnym; obecność związku absorbującego w nadfiolecie spowoduje wytworzenie ciemnej plamy po wystawieniu na światło nadfioletowe, gdyż związek wygasza fluorescencję barwnika. Jeśli tego postępowania nie można zastosować, płytkę można spryskiwać odczynnikiem wytwarzającym zabarwienie lub fluorescencję i uzyskiwać plamki widzialne. Po ustaleniu położenia plam można je oddzielać, jeśli substancja jest potrzebna do dalszych badań. Robi się to przez zeskrobanie proszku z płytki ostrym narzędziem i następnie wymycie substancji rozpuszczalnikiem. W innych metodach natężenie zabarwienia plamy można mierzyć na płytce stosując specjalnie skonstruowany do tego celu absorpcjometr lub fluorymetr: płytkę umieszcza się w świetle nadfioletowym lub widzialnym i mierzy energię promieniowania przepuszczonego lub emitowanego jako fluorescencja. Rozpraszanie światła przez powleczoną płytkę nie pozwala na taką dokładność przyrządów, jakiej można by od nich wymagać, lecz do wielu celów, łącznie z analizą jakościową, wyniki są zadowalające.
W sprzedaży są płytki do chromatografii cienkowarstwowej powleczone już warstwą fluorescencyjną lub warstwą innego typu. Często jednak lepsze wyniki daje pokrycie płytki bezpośrednio przez użytkownika. Do tego celu służą dostarczane przez wielu producentów, specjalne urządzenia do równomiernego rozprowadzania adsorbentu lub substancji wiążącej na płytce. Operacja ta jest bardzo ważna, szczególnie jeśli wymagane jest ilościowe porównanie płytek. Z wyjątkiem bardzo małych płytek (jak szkiełka mikroskopowe), zwykle na tej samej płytce wykonuje się kilka chromatogramów obok siebie. Ułatwione to jest przez nacięcie na płytce równoległych rowków, z których usuwa się powłokę. Nacięcia w odległości 1 cm zapobiegają rozszerzaniu się plam i nakrywaniu z sąsiednimi plamami.
W przypadku chromatogramów wielokrotnych próbki należy nakładać na płytkę w sposób powtarzalny, jeśli chodzi o miejsce i objętość. Korzystne do tego celu może być użycie prowadnicy znakowania lub szablonu, jak również skalibrowanej strzykawki.
Wyniki:
Nośnik: celuloza
Skład rozpuszczalnika: etanol; butanol-1; amoniak
Droga rozpuszczalnika: 113 mm;
Czas rozwijania chromatogramu: 1h 15min.
Substancja nanoszona |
Wartość Rf mierzona od środka plamki |
Czerwień fenolowa |
77 mm |
Czerwień Kongo |
17 mm |
Zieleń bromokrezolowa |
90 mm |
Błękit bromofenolowy |
76 mm |
Błękit tymolowy |
95 mm |
Roztwór badany |
17 mm; 89 mm; 96 mm; |
Skład roztworu badanego: Czerwień Kongo; Zieleń bromokrezolowa; Błękit tymolowy.
Wnioski:
Z kolorowych plamek roztworu badanego zmierzyłyśmy wartość Rf od środków plamek. Porównując je z wartościami Rf roztworów wzorcowych ustaliłyśmy jego skład: Czerwień Kongo, Zieleń bromokrezolowa, Błękit tymolowy.
Chromatografia cienkowarstwowa może służyć jako metoda analizy rozpoznawczej w celu ustalenia optymalnych warunków do dalszego rozdzielania w kolumnie. Dogodniej i szybciej jest badać różne adsorbenty i rozpuszczalniki na płytce, niż w bardziej skomplikowanym urządzeniu. Do wielu celów, łącznie z analizą jakościową wyniki są zadowalające.
3