Ekstrakcja DNA

• Podczas ekstrakcji DNA ważny etap stanowi prawidłowe pobranie materiału biologicznego, a także jego izolacja i przechowywanie.

• Bardzo ważny jest etap izolacji, który powinien zapewnić wysoką jakość DNA w celu wykonania dalszych analiz.

• Materiałem najczęściej wykorzystywanym do izolacji DNA należy krew obwodowa (w przypadku człowieka i zwierząt), zaś w przypadku roślin są to liście i młode siewki.

• Istnieje wiele różnych metod izolacji kwasów nukleinowych; ciągle opracowywane są nowe procedury.

• Celem jest dostarczenie DNA lub RNA w jak największej ilości, a także najlepszej  czystości i jakości.

• Nowe metody izolacji mają być efektywne, szybkie, wydajne i tanie !

• Jedną z najbardziej uznanych metod izolacji jest metoda z użyciem mieszany fenol:chloroform.

Etapy ekstrakcji DNA

• rozbicie komórek i uwolnienie DNA

• usunięcie tłuszczy z błon poprzez dodanie detergentu

• wytrącenie DNA z użyciem alkoholu (DNA nie rozpuszcza się w używanych alkoholach i utworzy osad (pelet) po zwirowaniu)

• Wyizolowane DNA może przetrwać przez lata jeśli jest przechowywane w szczelnym pojemniku i wytrącone w alkoholu.

• Mikroskop nie umożliwia obserwacji struktury DNA w postaci podwójnej helisy, stąd wyizolowane DNA będzie widoczne jako masa zbitych cząsteczek.

• Krystalografia z użyciem promieni X pozwala utrwalić obraz cząsteczki DNA (tak jak to robiła Rosalind Franklin).

• Techniką wykorzystywaną do wizualizacji totalnego DNA jest elektroforeza w żelu.

Ilość DNA

• Komórka diploidalna człowieka zawiera 6 pg DNA

• W 1 ml krwi znajduje się 5 - 10 x 10⁶ białych krwinek, więc teoretycznie uzyskamy 30-60 ng DNA w 1 ul krwi

• Sperma zawiera 3 pg DNA

Ilość DNA potrzebna do analizy

• Do RFLP potrzeba minimum 50 ng dwuniciowego DNA - 2 ul krwi lub 20000 plemników.

• Do PCR potrzeba 1 ng of DNA (jedno lub dwuniciowego) - 1/20 ul krwi lub 350 plemników.

• Wiele komercyjnych zestawów (kitów) daje wydajność poniżej 1 ng DNA (100-250 pg).

Najczęściej używane metody ekstrakcji DNA

• organiczna (fenol-chloroform)

• nieorganiczna (wysalanie)

• chelex

• kulki magnetyczne

• kolumienki filtracyjne

• papierek FTA

EKSTRAKCJA ORGANICZNA

• jest to podstawowa metoda wykorzystywana w biologii molekularnej

• kluczowym etapem jest usunięcie białek z użyciem fenolu lub mieszaniny fenolu
  i chloroformu

1. Za pomocą buforu lizującego komórki (detergentu) rozbijane są błony komórkowe, a jądra pozostają nietknięte w postaci osadu.

2. Dodanie SDS i proteinazy K prowadzi do lizy błon jądrowych i strawienia białek.

3. DNA zostaje uwolnione do płynu, a białka tworzą osobną fazę przy użyciu mieszaniny fenol-chloroform.

4. DNA wytrącane jest z fazy wodnej przez dodanie 95% etanolu i soli. DNA przemywane jest 70% etanolem, suszone i rozpuszczane w TE.

• Bufor lizujący komórki:

- detergent, sól, bufor, EDTA - lizują błony komórkowe, ale nie naruszają błon jądra.

• Proteinaza K - usuwa większość białek; ma 10 x wyższą aktywność na zdenaturowanych białkach. Białka można denaturować poprzez użycie SDS (dodecylosiarczan sodu) lub wysokiej temperatury.

• Fenol/chloroform - usuwa białka z roztworu; zwykle używany jest raz fenol, potem mieszanina 1:1 fenolu i chloroformu i na koniec chloroform.

Precypitacja DNA alkoholem

• Precypitacja DNA alkoholem zachodzi w obecności kationów (sól np. Na+), następnie przeprowadza się wirowanie i rozpuszczenie w buforze (TE - stosowany najczęściej  do elucji i długotrwałego przechowywania  DNA, złożony z TRIS i EDTA).

• Technika jest szybka i można uzyskać nawet nanogramy DNA.

• Wytrącanie małych cząsteczek DNA (<200 pz) etanolem jest niewydajne.

• Izopropanol może być używany zamiast etanolu; jest mniej lotny i trudniejszy do usunięcia w dalszych etapach.

zalety:

• czyste, wysokocząsteczkowe DNA

• DNA dwuniciowe - można zrobić RFLP

wady:

• czasochłonnne

• wymaga wielokrotnego przenoszenia do probówek - zwiększa ryzyko zanieczyszczenia

• toksyczne odczynniki

Ekstrakcja nieorganiczna

1. Liza błon komórkowych.

2. Liza błon jądrowych i trawienie białek proteinazą K (65 stopni, 2 h).

3. Usuwanie białek przez wysolenie np. LiCl (2.5 M).

4. Białka w osadzie, DNA w roztworze - przeniesienie do nowej probówki.

5. DNA wytrącane alkoholem, przemywane 70% etanolem, suszone i rozpuszczane w TE.

Ekstrakcja DNA przy użyciu kolumienek filtracyjnych

• odzyskanie DNA z próby > 95%

• DNA wiąże się z filtrem i jest oczyszczane z białek itd.

Kulki magnetyczne

• Magnetyczne kulki są opłaszczone przeciwciałami wiążącymi DNA

• Zalety: szybka metoda, czyste DNA, doskonała do krwi

• Wady: nie może być użyta na plamę, bardzo droga

Ekstrakcja Chelex^®

• Chelex^® 100 (BioRad) - żywica chelatująca o wysokiej czystości, wolna od enzymów, nie kolidująca z PCR

• zapewnia kompletne usunięcie inhibitorów PCR

• Chelex denaturuje ds DNA na ss DNA, więc nie nadaje się do RFLP

• ekstrakcja wykonywana w 1 probówce, eliminująca ryzyko zanieczyszczenia

• ważne jest usunięcie Chelex z ekstraktu DNA, aby nie zaburzyć PCR

• zalety: szybka metoda, może być użyta bezpośrednio (plamy na ubraniach), minimalizuje zanieczyszczenia, usuwa inhibitory PCR

• wady: uzyskujemy ss DNA

Papierek FTA^®

• szybka ekstrakcja i przechowywanie DNA z krwi i innych prób biologicznych

• mieszanina: buforów, związków denaturujących białka, związków chelatujących; absorbująca UV

• odczynniki zaimpregnowane w celulozowym filtrze (Whatman BFC180 lub 31ET paper)

• zabija patogeny krwi, chroni DNA przed degradacją, zapewnia długotrwałe przechowywanie w temp. pokojowej

Ekstrakcja różnicowa

• zmodyfikowana wersja organicznej metody (Gill et al. 1985, Guisti et al. 1986)

• wykorzystywana jest do izolacji DNA z komórek żeńskich i męskich w kryminalistyce

• żeńskie kom. epitelialne rozbijane są poprzez inkubację w mieszaninie SDS i proteinazy K

• plemniki lizowane są w mieszaninie SDS, proteinazy K i DTT (ditiotreitol - redukuje mostki disiarczkowe w główce plemnika)

• następnie żeńska i męska frakcja oczyszczane są fenolem i chloroformem, a DNA wytrącane jest etanolem

ekstrakcja domowa http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/

← faza fenolowa (białka)

← faza wodna (kwasy nukleinowe)

---