Biologia Molekularna W. 13 19.01.07r
Sposoby badania modyfikacji posttranslacyjnych:
1. znakowanie metaboliczne
Najbardziej klasyczna, podstawowa i najczęściej stosowana. Metoda często stosowana przy fosforylacji; wystarczy podać komórkom, czy organizmowi radioaktywny fosfor i wtedy można sprawdzić, jak fosfor przyłącza się do białka.
2. przeciwciała
Istnieją przeciwciała, które są swoiste w stosunku do białek zmodyfikowanych w określony sposób. Znowu klasycznym przykładem są przeciwciała specyficzne w stosunku do ufosforylowanej tyrozyny. W ten sposób można identyfikować, czy białko w tej formie występuje, czy nie.
3. chromatografie powinowactwa
Niektóre modyfikacje, znowu wracam do fosforylacji, mają większe powinowacto, np. do różnego rodzaju schelatowanych atomów metali, np. żelaza. Można przy pomocy takich właśnie chromatografii, gdzie mamy nośnik, którym jest chelatowane żelazo, wyłapywać białka, które posiadają grupy fosforanowe.
4. chemiczne modyfikacje modyfikacji posttranslacyjnych
Przekształcanie chemiczne tych modyfikacji posttransacyjnych, dzięki czemu można takie modyfikacje śledzić.
5. spektrometria masowa
Daje najbardziej dokładne informacje, w tym sensie, że potrzeba najmniej próbki do tego rodzaju wykrywania modyfikacji.
Mieli państwo podstawy spektrometrii mas, wobec tego wiedzą państwo, że ma zastosowanie do białek i polega na tym, że białko jest trawione przy pomocy enzymów proteolitycznych na poszczególne, małe peptydy i te peptydy potem, w zależności od tego jaki jest stosunek masy do ładunku ,są rozdzielane. Ponieważ jest to metoda, która śledzi stosunek masy do ładunku, a po pewnych przekształceniach tych wyników można to odnieść bezpośrednio do masy, no to łatwo zauważyć, że wprowadzenie np. grupy fosforanowej powoduje zwiększenie masy takiego peptydu, w obrębie którego znajduje się ufosforylowany aminonokwas o ok.70 Da. To jest dość łatwo wykrywalne jako przesunięcie piku w widmie spektrometrii mas. Jest to metoda bardzo owocna jeśli idzie o śledzenie modyfikacji posttranslacyjnych. Szczególnie w zastosowaniu do fosforylacji i do glikozylacji.
6. elektroforeza
Na slajdzie elektroforeza dwukierunkowa. To jest taka elektroforeza, gdzie dzielimy mieszaniny białek w ten sposób, że w jednym kierunku ta mieszanina jest rozdzielana na podstawie tzw. izoelektroogniskowania, na podstawie ładunku, jaki niesie dane białko. Położenie danego białka związane jest z jego punktem izoelektrycznym - pI. W drugim kierunku mamy rozdzielenie na podstawie masy.
Metodami elektroforetycznymi jest dość trudno odróżnić różnicę masy rzędu 70 kDa, tak jak jest to tutaj pokazane w przypadku fosforylacji, wobec tego w tym kierunku takie białka nie wędrują z różną szybkością, natomiast jeżeli idzie o ładunek to widać różnicę, dlatego że wprowadzenie każdej grupy fosforanowej powoduje, że ten ładunek zwiększa się o wartość jednostkową. Wobec tego, jeżeli mamy jakieś białko ufosforylowne w kilku miejscach, to obraz elektroforetyczny w takiej elektroforezie dwukierunkowej jest taki, że w jednym kierunku ono się lokuje na tym samym poziomie, natomiast w drugim kierunku mamy takie koraliki, które się pojawiają i taki charakterystyczny obraz koralików na dwukierunkowej elektroforezie mówi o tym, że mamy do czynienia z modyfikacją polegającą na fosforylacji danego białka.
Teraz szczegółowo omówimy te modyfikacje, które są dla nas bardziej interesujące.
Ze względu na funkcje, jakie te modyfikacje pełnią, istotne są takie 3 elementy:
powszechność modyfikacji
odwracalność modyfikacji - bardzo istotne; są modyfikacje prosto odwracalne, np. fosforylacja, acetylacja i one mają bardzo określone miejsce w systemie regulacyjnym. Są także takie modyfikacje jak np. obróbka proteolityczna, które są nieodwracalne, białko może tylko raz zostać zmodyfikowane w ten sposób i już nie może wrócić do tego stanu, w którym było wcześniej
swoistość - mechanizmy przy pomocy których ten aparat enzymatyczny, który służy do tego, żeby modyfikacje wprowadzać lub usuwać, uzyskuje swoistość w stosunku do grupy, czy do aminokwasu, który jest w danym białku np. fosforylowany.
Modyfikacje posttranslacyjne
1. obróbka proteolityczna
Białko jest syntetyzowane w postaci niższej(?) lub też innej niż ta, która jest później funkcjonalną formą tego białka. Obróbka polega na tym, że enzymy proteolityczne przecinają w określonym miejscu i albo usuwają fragment białka, albo powodują pofragmentowanie białka na mniejsze kawałki.
Najprostszym sposobem tego rodzaju modyfikacji jest usuwanie pierwszej metioniny z łańcucha polipeptydowego.
Synteza łańcucha polipeptydowego zaczyna się zawsze od metioniny (lub formylometioniny u bakterii) i w ok. 50% białek ten pierwszy aminokwas jest usuwany. Są reguły, które mówią o tym, w jakim wypadku on jest usuwany, a w jakim nie. Małe aminokwasy faworyzują usuwanie metioniny, większe powodują, że ta metionina zostaje w tej ostatecznej formie i wraz z tą metioniną to białko funkcjonuje.
To ma takie praktyczne efekty, jeżeli się pracuje potem z białkami, korzysta się z baz danych, często się zdarza, że numeracja aminokwasów w danym białku jest w różnych bazach inna. To zwykle jest przesunięcie o ten jeden aminokwas i chodzi zwykle o tę pierwszą metioninę. Białka, które mają usuniętą pierwszą metioninę, zaczynają swoją numerację od pierwszego aminokwasu, białka które zostały wprowadzone do baz strukturalnych, jako białka, których struktura została odtworzona na podstawie rekombinowanego białka, które ma tą metioninę, mają jeden aminokwas więcej z przodu. To jest taka praktyczna rzecz, o której warto wiedzieć, ponieważ jest to dość częsty przypadek, kiedy tam numeracja aminokwasów jest inna.
Tyle jeśli idzie o metioninę.
Następny przykład to jest bardziej skomplikowana obróbka. To jest przykład białka, które nazywa się Pro-opiomelanokortyną (POMC). Jest ono syntetyzowane w przysadce w postaci długiego łańcucha polipeptydowego i w zależności od tego, w którym z miejsc jest syntetyzowane, od tego zależy jakiego rodzaju produkty tutaj powstają.
Z całego łańcucha polipeptydowego po pierwsze:
jest usuwana pierwsza część tego łańcucha,
po drugie: z pozostałej części może powstać wiele różnych elementów, to mogą być po prostu białka, czy też aktywne biologicznie peptydy.
(przyp. skryby: na slajdzie był jeden długi łańcuch podzielony na kilka odcinków i zdaje się, że chodziło o to, że zależnie który odcinek zostanie usunięty, powstaję białko o danej funkcji)
I jeszcze jedna taka terminologiczna kwestia. PRAPTER? to jest sposób obróbki proteolitycznej, który polega na tym, że odcinamy zwykle mniejszą część łańcucha polipeptydowego. Ma odniesienie do wielu różnych procesów, właściwie takich podstawowych. Jednym z nich jest taki jak ten, kiedy mamy białko syntetyzowane w postaci dużego niefunkcjonalnego łańcucha, które jest potem przycinane do tego łańcucha funkcjonalnego i takie białka nazywają się probiałkami lub proproteinami.
W odróżnieniu od innych białek, gdzie również mamy do czynienia z odcięciem fragmentu łańcucha, ale jest to fragment, który pełnił swoje funkcje. Mówię tutaj o białkach, które w komórkach eukariotycznych są transportowane do różnych organelli komórkowych.
Transport do organelli polega na tym, że w obrębie białka znajdują się pewne sekwencje, które są sekwencjami leaderowymi, które kierują to białko do danej organelli. W niektórych wypadkach, jak w przypadku jądra komórkowego te sekwencje pozostają na stałe w łańcuchu peptydowym, ale w wielu innych wypadkach, jak np. w przypadku mitochondriów czy chloroplastów, takie sekwencje są odcinane.
Wobec tego, w odróżnieniu od tych probiałek, gdzie mieliśmy łańcuch niefunkcjonalny przekształcany na łańcuch niefunkcjonalny, te białka z sekwencjami sygnałowymi nazywane są prebiałkami. Często się zdarza tak jak w przypadku insuliny, która jest syntetyzowana i wydzielana na zewnątrz, a więc jest prebiałkiem, a jednocześnie jest obrabiana z nieaktywnego łańcucha do aktywnego, jest więc także probiałkiem. Zatem często mamy do czynienia z preprobiałkami, czyli takimi białkami, które przechodzą przez te 2 sposoby obróbki.
Na slajdzie przykład insuliny, widziamy jak ta proinsulina, która jest wyeksportowana jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy, odtwarzają się tutaj mostki disiarczkowe wewnątrz tego łańcucha polipeptydowego, a następnie mamy obróbkę proteolityczną, która prowadzi do tego, że pojawiają się dwa łańcuchy polipeptydowe. Mówiliśmy, że struktura IV-rzędowa jest wtedy kiedy mamy 2 łańcuchy polipeptydowe, które tworzą jedno funkcjonalne białko, te 2 łańcuchy są syntetyzowane oddzielnie. Tu mamy inną sytuację, mianowicie taką, że w zasadzie to był jeden łańcuch polipeptydowy, ale z tego jednego łańcucha powstały 2, które są utrzymywane przez te mostki disiarczkowe. Tutaj redukcja tych mostków disiarczkowych prowadzi do rozdzielenia tych dwóch łańcuchów - to jest proces nieodwracalny, ponieważ ta struktura, która istniała, jest pochodną informacji, która była zapisana w tej cząsteczce białka.
Slajd: bardziej nieschematyczny sposób pokazania jak wygląda obróbka proteolityczna.
Także mamy przekształcenie proinsuliny w insulinę. To na co chcę zwrócić uwagę, to jest sposób uzyskiwania funkcjonalności, on się pojawia w wielu przypadkach, jeśli idzie o białka. Jeśli państwo przyjrzą się tym fragmentom, które tworzą ostatecznie funkcjonalną cząsteczkę insuliny, to ich struktura jest inna, tej proinsluiny niż ostatecznej insuliny. Innymi słowy usunięcie tego 24-aminokwasowego fragmentu prowadzi do powstania takich zmian w konformacji cząsteczki, które nadają jej aktywność. To jest taki dość powszechny mechanizm w przypadku enzymów proteolitycznych.
Bardzo wiele enzymów proteolitycznych jest syntetyzowanych w postaci proenzymów.
Państwo doskonale wiecie, że mamy do czynienia z chymotrypsynogenem i trypsynogenem, które są odpowiednio przekształcane w chymotrypsynę i trypsynę. Zazwyczaj usunięcie fragmentu polipeptydowego jest związane z pojawieniem się grupy aminowej na końcu łańcucha polipeptydowego i ten ładunek, który się w tym miejscu pojawia, indukuje zachodzenie takich zmian, które prowadzą do uaktywnienia tych enzymów proteolitycznych.
Kolejnym przykładem jest proces krzepnięcia krwi. To jest wieloetapowy proces. W krwi jest wiele różnych czynników i zachodzi wiele różnych zjawisk. To, na co chcę zwrócić uwagę, że w tym temacie, który jest bardzo złożony, mamy tutaj takie 2 elementy, gdzie mamy probiałko - protrombinę, która przez proteolityczną obróbkę jest przekształcana w aktywny enzym proteolityczny - trombinę, która z kolei przekształca inne białko, które jest probiałkiem, czyli fibrynogen w fibrynę. Ten ostatni etap krzepnięcia krwi jest ściśle związany z tymi dwoma etapami.
Kolejny przykład zastosowania obróbki proteolitycznej to jest działanie kaspaz. Kaspazy to są takie enzymy proteolityczne, które są zaangażowane w degradację białek podczas apoptozy.
Cały problem z kaspazami jest taki, że one istnieją w komórce. To nie jest tak, że są syntetyzowane w momencie pojawienia się sygnału, tylko istnieją w komórce cały czas, wobec tego muszą być trzymane na smyczy, muszą być tak unieaktywnione, żeby dopiero w jakiś bardzo kontrolowany sposób można było tą aktywność uruchomić. Znowu tutaj mamy do czynienia z obróbką proteolityczną. Mamy duży proenzym, który jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym, a tym egzekutorem, czyli formą, która jest aktywna, jest dimer, który jest budowany z dwóch fragmentów tego łańcucha polipeptydowego i to przekształcenie jest związane z przecięciem tego łańcucha i możliwością wytworzenia tego dimeru.
Jest jeszcze drugi mechanizm - taki, gdzie wytworzenie tego dimeru jest blokowane przez inne białko i również obróbka proteolityczna jest w stanie tę blokadę zdjąć odcinając fragment, który jest swoisty do tego drugiego białka blokującego.
Istotne, że obróbka proteolityczna jest nieodwracalna. To jest taki rodzaj modyfikacji, gdzie białko przez te wszystkie cykle odcinania może przejść raz, ale wrócić już do tej poprzedniej formy nie jest w stanie.
2. składanie białek (splicing peptydowy)
Podobna modyfikacja jeśli idzie o filozofię, zupełnie inna jeśli idzie o mechanizm. Filozofia jest taka sama jak w przypadku splicingu RNA. Mamy łańcuch polipeptydowy, który jest długi - w momencie, kiedy jest on syntetyzowany, część znajdująca się w środku zostaje wycięta, a te dwie zewnętrzne części są połączone. Przez analogię do eksonów i intronów, te części, które są usuwane nazywane są internami, te części które są łączone ze sobą nazywane są eksternami.
Jest to interesująca modyfikacja ze względy na jej biochemię, tzn. ze względu na mechanizm, który jest w to zaangażowany, z tego względu, że te wszystkie operacje, które odbywają się na łańcuchu polipeptydowym, to są operacje, które przebiegają bez udziału energii, czyli, innymi słowy, istotą tego mechanizmu składania białek jest przejściowe magazynowanie energii, która jest zawarta w wiązaniu peptydowym. Ona opiera się na tym, że jeśli się spojrzy na sekwencje, które są konserwowane w obrębie tych intein, a także na końcu tych łączonych ze sobą łańcuchów polipeptydowych, to mamy na początku intein albo cysteinę albo serynę, w rzadkich wypadkach alaninę. Natomiast podobny układ: cysteina, seryna albo treonina występuje na początku eksteiny i tutaj również na końcu inteiny znajduje się albo asparagina albo glutamina. (przyp. skryby: czyli idąc od lewej mamy: eksteinę, inteinę i eksteinę. I inteina od lewej zaczyna się od Cys, Ser lub Ala, a kończy na Asp lub Glu, a druga eksteina zaczyna się od Cys, Ser lub Thr).
To wszystko biochemia składania łańcucha polipeptydowego, którego istota polega na tym, że ta część C-końcowa tego składanego fragmentu łańcucha polipeptydowego, która tworzyła wiązanie peptydowe, jest przenoszona na serynę w ten sposób, że tworzy wiązanie estrowe albo na cysteinę tworząc wiązanie tioestrowe, a następnie jest przenoszona z tego wiązania estrowego na serynę albo treoninę albo cysteinę, która znajduje się w tej drugiej części, która ma zostać złożona. Wreszcie przekształcenie - taka cyklizacja asparaginy czy glutaminy, która znajduję się na końcu wycinanej inteiny pozwala na to, żeby to wiązanie estrowe, które jest już w tej części C-końcowej eksteiny zostało rozbite i żeby ta grupa karboksylowa z powrotem zeskoczyła z tą grupą aminową w wiązanie peptydowe.
Jest jeszcze drugi mechanizm, który polega na tym, że nie mamy tego pierwszego wiązania estrowego, które powstaje po tej N-końcowej stronie inteiny, a to wiązanie peptydowe, które ma zostać rozbite, jest przenoszone bezpośrednio na Cys, Ser lub Thr, które znajdują się w tej C-końcowej części składanej inteiny. Dalszy przebieg składania jest bardzo podobny. W tym wypadku te sekwencje, które wyznaczają końce inteiny w wypadku tego drugiego mechanizmu zamiast cysteiny i seryny, które są w stanie przyjąć na siebie grupę karboksylową przejściowo tego łańcucha polipeptydowego, znajduje się alanina, która takiej możliwości nie ma, ponieważ nie ma ani grupy serynowej, ani grupy tiolowej.
Inteiny są wyznaczane nie tylko przez te sekwencje, które warunkują mechanizm, o którym mówiłem przed chwilą, jest jeszcze kilka innych elementów, które są konserwowane w obrębie tego fragmentu inteinowego. Wiele intein zawiera jeszcze taką endonukleazę w łańcuchu polipeptydowym, która jest swoista do bezinteinowego połączenia w obrębie DNA, do takiego połączenia, które straciło tę inteinę, wobec tego jest to taka aktywność, która eliminuje komórki, takie wypadki, kiedy fragment inteinowy został …..???.
Jest to rzadka modyfikacja, aczkolwiek niesłychanie interesująca właśnie przez swoją analogię do składania RNA. Jest to rzadka modyfikacja i poza tym jest stara, w związku z tym te białka, które są składane, to są białka podstawowe - w niektórych bakteriach to jest polimeraza DNA, czy polimeraza RNA, czy jakieś białka podstawowego metabolizmu, czy proteazy - czyli są to takie białka, które gdzieś tam w ewolucji musiały powstawać bardzo wcześnie.
Składania białek nie obserwuje się w jakichś bardziej współczesnych białkach.
3. acetylacja i deacetylacja (np. histonów)
Powszechna, odwracalna, ważna z punktu widzenia funkcjonowania białek komórkowych.
Acetylacja polega na dołączeniu grupy acetylowej (-COCH3) do grupy aminowej lizyny, czy grupy guanidynowej argininy. Donorem grupy acetylowej jest acetylo-CoA. Istnieje grupa enzymów - acetylaz, które przeprowadzają tę modyfikację i grupa enzymów - deacetylaz, które usuwają tę modyfikację.
Na przeźroczu mamy acetylację grupy ε-aminowej lizyny, ale w białkach cytoplazmatycznych bardzo powszechne jest acetylowanie grupy α-aminowej, która znajduje się na końcu łańcucha polipeptydowego. Także nie jest to tylko taka modyfikacja, która służy do zmian funkcjonowania histonów.
Efekty takiej modyfikacji są dwa:
1. likwidacja ładunku, który znajduje się na lizynie, czyli znika dodatni ładunek, który w tym miejscu łańcucha polipeptydowego znajdował się;
2. zmiana powinowactwa do innych białek lub do cząsteczki DNA.
Ta część, która dotyczy ładunku, dotyczy głównie histonów. Histony składają się z części globularnej i ogonka, w którym jest bardzo dużo Lys i Arg, dlatego gęstość ładunku jest bardzo duża. Acetylacja tych zasadowych końców histonów, które biorą udział w stabilizowaniu struktur nukleosomowych przez oddziaływanie z fosforanami cząsteczki DNA, powoduje, że to wiązanie zostaje osłabione, wobec czego struktura w tym miejscu zostaje rozluźniona.
W przypadku innych białek, takich jak np. białko p53, które również ma wiele reszt Lys acetylowanych, też wiele czynników transkrypcyjnych - w tych innych przypadkach mamy do czynienia z tym drugim efektem, tzn. z takim, gdzie jest wpływ acetylacji na płaszczyznę oddziaływania z cząsteczką DNA i mamy do czynienia z takim paradoksalnym zjawiskiem, jeżeli pamiętamy o tym co dzieje się w histonach, że w przypadku niektórych czynników transkrypcyjnych acetylacja powoduje zwiększenie oddziaływania z DNA, a nie osłabienie.
***
Jeszcze zniknęły mi z pamięci dwie sprawy. Istnieją modyfikację, które są związane z obróbką proteolityczną i operowaniem aminokwasami. Jedna modyfikacja to jest taka, którą się spotyka czasami u wirusów, ona jest trochę podobna do przecinania łańcucha polipeptydowego. Dzieje się tak, że jest syntetyzowany długi łańcuch polipeptydowy, który jest krojony na drobne części i powstają jakieś mniejsze białka.
Kolejna modyfikacja jest bardzo interesująca, aczkolwiek bardzo rzadka. Polega na dodawaniu aminokwasów do łańcucha polipeptydowego w niektórych regenerujących tkankach, w tkance nerwowej, po uszkodzeniu do niektórych białek do N-końcowej części dodawana jest Arg.
To tyle dla pamięci.
4. hydroksylacja
Od strony biochemicznej jest dość złożona. Hydroksylacji ulega Pro i Lys, także mamy hydroksyprolinę i hydroksylizynę. Ta reakcja wymaga udziału tlenu, α-ketoglutaranu i askorbinianu, który bierze udział nie w samej reakcji, a w regeneracji tej hydroksyalzy prolinowej, która wprowadza te modyfikacje do cząsteczki proliny. Ta reakcja hydroksylacji proliny była uważana przez długi czas jako taka istotna z punktu widzenia funkcjonowania organizmu, ale mało interesująca ze względu na to, że dotyczyła przede wszystkim jednego białka - kolagenu. W kolagenie jest bardzo wiele reszt prolinowych i niektóre te reszty są hydroksylowane i to właśnie ta hydroksylacja jest odpowiedzialna za to, że kolagen przyjmuje ostateczną, dojrzałą formę. Szkorbut jest efektem braku askorbinianu, brak tej reakcji hydroksylacji proliny hamuje dojrzewanie kolagenu.
Kilka lat temu okazało się, że hydroksylacja proliny bierze udział również w procesach regulacyjnych. Na slajdzie system, który powoduje, że takie białko, czynnik transkrypcyjny, który jest zaangażowany w uruchamianie genów związanych z hipoksją - poprzez hydroksylację proliny jest sensorem stężenia tlenu w komórce. To jest struktura ukazująca oddziaływanie tego czynnika, który nazywa się HIFα. Jego oddziaływanie z innym białkiem jest związane z obecnością hydroksylowanych form proliny. Chodzi o konkretną prolinę, która znajduje się w sekwencji aminokwasowej łańcucha polipeptydowego.
Cała rzecz polega na tym, że to jest taka hydroksylacja, w obrębie której działają bardziej nieswoiste hydroksylazy, to nie są te hydroksylazy prolinowe, które hydroksylują kolagen, one są inaczej rozmieszczone. Hydroksylazy prolinowe, które hydroksylują proliny w kolagenie znajdują się w retikulum endoplazmatycznym. Tutaj mamy cały proces, który przebiega w jądrze komórkowym. Jest taka hydroksylaza, która się nazywa EGLN1. Jej powinowactwo do tlenu zmienia się dość raptownie w pewnym zakresie. Zatem jeśli tego tlen jest mało, w komórkach jest hipoksja, to ta hydroksylaza nie przeprowadza reakcji hydroksylacji; ta prolina, która znajduje się w tym miejscu nie jest hydroksylowana, w efekcie ten czynnik transkrypcyjny działa tak, jak został do tego przeznaczony, czyli oddziałuje z DNA i uruchamia transkrypcję tych genów, które są związane z hipoksją. Natomiast w momencie, kiedy tego tlenu jest dużo, to ta hydroksylaza powoduje przekształcenie tej proliny w hydroksyprolinę.
Jeszcze jest druga hydroksylaza, która też działa w trochę niższych stężeniach tlenu, która przekształca asparaginę, która też znajduje się w łańcuchu polipeptydowym tego białka w hydroksyasparaginę. W efekcie mamy oddziaływanie tego białka z drugim białkiem i to drugie białko to jest nic innego, jak takie białko, które jest jednym z pierwszych etapów wprowadzania innej modyfikacji, o której będę mówił za chwilę, czyli ubikwityny podczas ubikwitynylacji. I oddziaływanie tej proliny z tym białkiem wprowadza w efekcie ubikwitynę do tego czynnika HIFα i dalej ten czynnik będzie degradowany. To jest bardzo ładny mechanizm, oparty o taką modyfikację, której nikt nawet nie podejrzewał, że taką funkcję może pełnić. Mechanizm prowadzi do tego, że w wysokim stężeniu tlenu, geny, które są związane z hipoksją są nieaktywne, a przy niskim stężeniu tlenu tej hydroksylacji nie ma, degradacji tego czynnika także nie ma i te geny są wtedy nieaktywne.
5. poliADP-rybozylacja
Niezbyt powszechna, ale bardzo istotna, odwracalna.
To, co dołącza się do łańcucha polipeptydowego, to jest reszta ADP-rybozy. Substratem dla tej reakcji jest NAD+. Ta reakcja polega na przeniesieniu adeniny i dwóch reszt cukrowcowych, dwóch cząsteczek rybozy, które są połączone ze sobą równikowym wiązaniem pomiędzy dwoma fosforanami, na cząsteczkę białka z uwolnieniem amidu kwasu nikotynowego. Modyfikacja ta jest odwracalna, tzn. istnieją enzymy, które wprowadzają, czy budują łańcuchy poliADP-rybozy, one nazywają się polimerazami ADP-rybozy, takim najbardziej istotnym enzymem jest polimeraza ADP-rybozy I. Są również enzymy, które są hydrolazami poliADP-rybozy, które odcinają te łańcuchy od cząsteczki białka.
Mówię o łańcuchach z tego względu, że w białkach jądrowych (bo ta modyfikacja dotyczy przede wszystkim białek jądrowych) to nie jest wprowadzenie pojedynczej reszty ADP-rybozy, tylko wprowadzenie wielu takich reszt - dołączanie jednej reszty do drugiej, w taki sposób, że do tej cząsteczki w efekcie jest dołączony długi łańcuch, on jest często rozgałęziony. On może dochodzić do ok. 200 podjednostek w jednej cząsteczce białka. Trzeba sobie zdać sprawę z tego, że to jest zupełnie co innego, niż wprowadzenie pojedynczej reszty acetylowej podczas acetylacji, czy gr. metylowej podczas metylacji. To jest wprowadzenie do łańcucha polipeptydowego ogromnego łańcucha, który swoimi własnościami fizyko-chemicznymi przypomina trochę DNA czy RNA, ponieważ ma bardzo dużo fosforanów, więc jest mocno naładowany, ma dużo cukrowców, dużo cząsteczek rybozy, czyli jest mocno polarny. A więc jest to modyfikacja, która w istotny sposób zmienia właściwości takiego modyfikowanego białka.
Jak mówiłem, to są białka jądrowe. Polimeraza ADP-rybozy I znajduje się w jądrze komórkowym. I jednym substratem jest ona sama, tzn. ona poliADP-rybozyluje się sama, ale jest szereg innych białek związanych albo ze strukturą albo z metabolizmem DNA, które także są poliADP-rybozylowane. Przykład histonu H1, który może być ADP-rybozylowany. Zarówno w części globularnej, jak i w tych koniuszkach histon H1 ma takie ogonki i w tych ogonkach mogą być reszty poliADP-rybozylowe.
Funkcja fizjologiczna poliADP-rybozylacji jest bardzo ściśle określona. To jest taki pierwszy efekt, który pojawia się kiedy w eukariotycznym DNA występują uszkodzenia DNA. Te uszkodzenia powodują natychmiast masową poliADP-rybozylację zarówno samej tej polimerazy poliADP-rybozy, jak i innych białek, które znajdują się w jądrze komórkowym. I tutaj efekty, jakie powoduje poliADP-rybozylacja są wielorakie. Po pierwsze, co może nie jest tak ściśle związane z samą poliADP-rybozylacją, ale w pierwszym momencie, kiedy powstają uszkodzenia DNA, sama polimeraza poliADP-rybozy dołącza się do cząsteczki DNA.
Ponieważ jest to białko, które oddziałuje z wieloma innymi białkami, rekrutuje wiele innych białek do cząsteczki DNA, niektóre z tych białek biorą udział w naprawie.
Drugi efekt jest taki, że kiedy ona sama się upoliADP-rybozyluje, to rekrutuje inne białka, które mają powinowactwo do samej polimerazy poliADP-rybozy, czyli rekrutacja białek w miejsce uszkodzenia poprzez poliADP-rybozę.
Trzeci efekt jest taki, że szereg innych białek jest poliADP-rybozylowanych i one bardzo często wtedy nie oddziałują z cząsteczką DNA.
To jest dość logiczne, dlatego że ta cząsteczka poliADP-rybozy jest bardzo podobna do DNA, głównie ze względu na ładunek, wobec tego ona konkuruje trochę z cząsteczką DNA. Jeżeli mamy do czynienia z wyłapywaniem jakiegoś białka, to bardzo często DNA przegrywa, to białko jest oddysocjowywane.
I wreszcie kolejny efekt, który powoduje poliADP-rybozylacja, to jest inaktywacja wielu enzymów. To jest taki mechanizm związany z nieprzekształcaniem jednoniciowych nacięć z cząsteczce DNA w nacięcia dwuniciowe. W cząsteczkach DNA bardzo często powstają takie nacięcia jednoniciowe, one są stosunkowo łatwo naprawialne, o wiele trudnej jest naprawić pęknięcia, które zachodzą w obu niciach.
W cząsteczkach DNA jest taki enzym topoizomeraza I. Ten enzym jest związany z topologią cząsteczki DNA, ale jego mechanizm działania polega na tym, że wprowadza do cząsteczki DNA pojedyncze nacięcia. Otóż łatwo sobie wyobrazić, że jeżeli mamy cząsteczkę DNA dwuniciową, gdzie powstało pęknięcie jednoniciowe, to jeżeli naprzeciwko tego nacięcia pojawi się cząsteczka, która normalnie działa niegroźnie, tzn. też wprowadza nacięcie jednoniciowe, które potem preferuje, potem odtwarza, jeżeli ten enzym wprowadzi tutaj nacięcie jednoniciowe, no to wtedy nic nie trzyma tych dwóch kawałków DNA, powstaje nacięcie dwuniciowe, które jest o wiele groźniejsze.
PoliADP-rybozylacja powoduje inaktywację zdolności topoizomerazy do nacinania.
To się odnosi także do innych enzymów, których aktywność może być w ten sposób modulowana.
Także efekty epigenetyczne poliADP-rybozylacji są wielorakie, aczkolwiek wszystkie one w jakiś sposób są związane z uszkodzeniem DNA.
Jest jeszcze inny mechanizm, który jest dość niezwykły, mianowicie: jeżeli uszkodzenia w cząsteczce DNA są bardzo powszechne, tzn. jest ich bardzo dużo, to ta poliADP-rybozylacja jest bardzo intensywna. Gdy mamy zachodzące na ogromną skalę poliADP-rybozylowanie, następuje wyczerpanie puli NAD+, które jest substratem dla tej reakcji i wtedy taka komórka obumiera nekrotycznie. Czyli w jakiś sposób ta poliADP-rybozylacja masowa ma związek z kierowaniem komórki na drogę nekrozy.
I jeszcze jeden efekt, który jest związany z poliADP-rybozylacją, to jest udział w utrzymywaniu długości telomerów. Telomery znajdują się na końcach chromosomów, to są powtórzenia takiej krótkiej sekwencji 6-nukleotydowej, gdzie występują 3 guaniny i głównym sposobem odtwarzania tych powtórzeń jest telomeraza. Aktywność telomerazy jest regulowana przez wiele czynników, ale m.in. przez takie 2 białka, które nazywają się TRF-1 i TRF-2. Ich zdolność do hamowania, wydłużania telomerów, która jest związana ze zdolnością dołączenia się do telomerowego DNA jest zależna od poliADP-rybozylacji na końcach chromosomów w tych obszarach telomerowych, gdzie mamy takie swoiste polimerazy poliADP-rybozy, które nazywamy tankyrazami. Tankyrazy w ten sposób, poprzez poliADP-rybozylacje tych białek, które regulują aktywność telomerazy, wpływają na długość telomerów.
6. fosforylacja
Najistotniejsza modyfikacja, szczególnie dla komórek eukariotycznych. Znajduje wykorzystanie w procesach regulacyjnych, w procesach przekazywania sygnałów, etc.
Trzy reszty aminokwasowe ulegają fosforylacji, to jest Ser, Thr i Tyr, czyli wszystkie te, które mają grupy -OH, które mogą zostać zmodyfikowane. Nieco inaczej jest u bakterii, tu mamy do czynienia z takimi wiązaniami histydynowymi i ta fosforylacja jest katalizowana przez kinazy histydynowe, ale ja nie będę ich omawiał, służą przekazywaniu sygnałów w komórkach bakterii.
Fosforylacja białek jest odwracalna. Mamy grupę enzymów, które nazywają się kinazami białkowymi, które fosforylują białka i grupę enzymów - fosfataz, które usuwają grupy fosforanowe, czyli taka idealna para do regulacji tego procesu. Donorem fosforanów jest w ogromnej większości ATP, w niektórych wypadkach jest GTP.
Mamy przykład bardzo znany, gdzie pokazana jest fosforylaza glikogenu, której aktywność jest regulowana poprzez fosforylację.
Ufosforylowany enzym jest aktywny, nieufosforylowany jest nieaktywny. Regulacja odbywa się w różny sposób.
Częstym sposobem jest, … tu znowu taki prosty przykład regulacji kinaz …, takim prostym sposobem jest istnienie w funkcjonalnej kinazie białek, dwóch rodzajów łańcuchów polipeptydowych, których część ma właściwości katalityczne, a część regulatorowe.
To jest przykład kinazy białkowej A, czyli PKA, która składa się z 4 podjednostek, 2 są katalityczne, 2 regulatorowe. W takim tetramerze kinaza jest nieaktywna, dołączenie cAMP do jednostek regulatorowych uwalnia katalityczne podjednostki i pozwala tej kinazie działać.
Ale jest jeszcze jeden sposób, mianowicie działanie poprzez istnienie tych podjednostek regulatorowych może się odbywać również bez oddzielnych mechanizmów.
Tutaj jest pokazany przykład dla trzech rodzajów kinaz. Ta pierwsza to jest ta, o której mówiłem przed chwilą, gdzie kinaza w kompleksie z podjednostkami regulatorowymi jest nieaktywna, ale są inne kinazy jak np. kinazy cyklu komórkowego, które są aktywne wtedy kiedy nie są połączone z regulatorowymi podjednostkami. Dopiero kompleks tej katalitycznej podjednostki z podjednostką regulatorową daje aktywny enzym.
I wreszcie, dość niezwykły sposób, który występuje w przypadku takiej dość powszechnej kinazy o plejotropowym zakresie działania, kinazy CK2. Mamy tu dwie podjednostki katalityczne: α i α' i dwie podjednostki regulatorowe: 2 podjednostki β. Aktywne są zarówno samodzielnie żyjące podjednostki katalityczne, jak i kompleks, który zawiera podjednostki katalityczne i regulatorowe. Ta regulacja polega tutaj na tym, że te podjednostki regulatorowe tworzą formy, do której mogą się dołączać te podjednostki katalityczne, ale także inne białka, jakieś substraty, albo jakieś inne elementy systemu, w którym działa ta kinaza. Ten sposób regulacji poprzez podjednostki jest dość częsty, ale jest różnorodny.
Tabela. Swoistość sekwencyjna niektórych kinaz.
Ten problem, który chcę tutaj omówić, to jest problem swoistości. To jest niesłychanie ważna rzecz w przypadku działania kinaz białkowych z tego względu, że te procesy regulacyjne, które tu zachodzą podczas fosforylacji lub defosforylacji, są związane z obecnością tej grupy fosforanowej w określonym miejscu. Jest tak, że np. jest taki czynnik transkrypcyjny, który jest uaktywniany przez działanie kinazy THA(?) i teraz on jest obserwowany w wielu miejscach, ale fosforylacja jednej seryny powoduje to, że on jest aktywny, a defosforylacja, że jest nieaktywny. Ten element swoistości działania kinaz jest niesłychanie istotny. Jeżeli ta fosforylacja jest związana z regulacją tak ogromnej liczby procesów zachodzących w komórce, to jest to czynnik kluczowy, który pozwala na wyłapanie odpowiedniego białka i odpowiedniej grupy, która ma zostać zmodyfikowana.
Są takie 3 elementy, które kolejno omówię.
Pierwszy element to jest motyw rozpoznawalny przez kinazy. Może jeszcze coś bardziej ogólnego, to jest swoistość w stosunku do reszty aminokwasowej, która jest fosforylowana. Ta swoistość nie jest jakaś bardzo rozbudowana, ale generalnie rzecz biorąc kinazy białkowe dzielą się na dwie grupy:
kinazy serynowo-treoninowe
takie które katalizują fosforylację seryny lub treoniny
kinazy tyrozynowe
katalizują fosforylację tyrozyny
One rzadko się nakładają, tzn. jest niewiele kinaz, które są w stanie fosforylować zarówno serynę jak i tyrozynę. W obrębie tych kinaz Ser-Thr zazwyczaj jest tak, że Ser jest chętniej fosforylowanym aminokwasem.
Także w obrębie tych kinaz Ser-Thr istnieją 3 grupy kinaz:
- kinazy zasadowe - w sąsiedztwie fosforylowanej seryny mają aminokwasy zasadowe
- kinazy kwaśnie - stosunkowo niewielka grupa, w sąsiedztwie aminokwas kwaśny
- kinazy prolinowe - najczęściej w pozycji +1 w stosunku do fosforylowanej Ser lub Thr mają prolinę.
W obrębie tych grup mamy całe morze różnych swoistości, przykładowo kinaza PKA musi mieć w pozycji -2 i -3 argininy, czasem jest tolerowana lizyna, tych różnych wariantów jest bardzo dużo.
Dla kinaz prolinowych też mamy różnego rodzaju swoistości, ich wspólną cechą jest to, że w pozycji +1 znajduje się prolina, ale oprócz tego znajdują się inne determinanty, które wyznaczają tą swoistość.
Wreszcie kinazy kwaśne, np. CK2 czy CK1, które mają aminokwas kwaśny w sąsiedztwie ufosforylowanej seryny.
Ten obraz, który państwu pokazałem jeśli idzie o swoistość w stosunku do tego motywu jest niesłychanie uproszczony. Takim przykładem dobrym jest kinaza CK2 - ona ma bardzo ściśle określony kanoniczny motyw - jest nim obecność kwaśnego aminokwasu w pozycji +3. Czyli w 3 pozycji po prawej stronie Ser lub Thr, która jest fosforylowana, powinna się znajdować albo kwas asparaginowy, albo kwas glutaminowy, albo powinna się znajdować ufosforylowana Ser, Thr lub Tyr.
Tutaj jeszcze mamy kinazy tyrozynowe, tutaj ta specyficzność jest też zaznaczona, ale jest trochę mniejsza niż w przypadku kinaz Ser-Thr.
Teraz wracając do tego o czym zacząłem mówić. Te dodatkowe determinanty, to jest to, że obecność różnych aminokwasów, jeśli chodzi o te właściwości kanoniczne, w istotny sposób zmienia parametry enzymatyczne tej kinazy.
Tabela. Zależność aktywności CK2 od kontekstu aminokwasowego.
kinaza |
peptyd |
Vmax |
KM |
CK2 |
SEEEEE |
100 |
270 |
|
SEAEEE |
74 |
1950 |
|
RRRADDSDDDDD |
100 |
15 |
Widzimy tutaj w przypadku tej kinazy CK2, gdzie mamy serynę, która ma wiele podstawników reszt kwasu glutaminowego E i przyjmiemy jako jakąś tam wartość wyjściową, to zobaczymy, że wprowadzenie w pozycji +2 alaniny, która nie jest pozycją kanoniczną, tzn. że ona nie powoduje, że ta kinaza nie fosforyluje, ale jednak powoduje nieznaczne zmniejszenie szybkości i ogromne zmniejszenie powinowactwa. Z kolei wprowadzenie po prawej stronie dodatkowych grup kwaśnych nie wpływa na szybkość katalizowania, ale w sposób istotny zwiększa powinowactwo tego enzymu do takiego motywu.
Innymi słowy możemy powiedzieć, że jeżeli idzie o motyw, to mamy pewne kanony, pewien zestaw aminokwasów, które w tej tabeli są przedstawione, ale tak naprawdę decyduje kompleks aminokwasowy, w skład którego wchodzi o wiele więcej aminokwasów niż jest tam podane w tabeli.
Jeszcze oprócz determinant pozytywnych istnieją determinanty negatywne, np. w przypadku tej kinazy CK2 wprowadzenie w pozycję +1 lub +2 lub -1 jakiejś reszty zasadowej, czyli reszty o zupełnie innym charakterze niż ta, która jest tutaj w pozycji +3 powoduje, że takie motywy pomimo, że ten kanon zostaje zachowany, to w praktyce nie są fosforylowane.
W tabeli mamy determinanty pozycyjne, one są rozmieszczone dla tej kinazy CK2 w miejscach, które są poza tą seryną, zarówno z prawej jak i z lewej strony.
Slajd: Mamy różne aminokwasy, to jest cała dwudziestka, i mamy takie górki w pewnych miejscach. W motywie kanonicznym te górki są bardzo ściśle określone, to jest kwas glutaminowy i kwas asparaginowy w pozycji trzeciej, ale jak widzimy w tych pozycjach -1, +1, +2, +4, +5 również znajdują się aminokwasy, które powodują, że ta fosforylacja jest bardziej efektywna, a są takie, które powodują, że ona prawie nie zachodzi.
Jeszcze jedna rzecz, która dotyczy tych motywów i która dotyczy tej kinazy, której dużo czasu poświęciłem: zjawisko wielokrotnej (lawinowej) fosforylacji.
Jeśli mamy taki motyw:
S X X S X X S X X E
Mamy kwas glutaminowy, dwa dowolne, seryna, dwa dowolne, seryna. Takie motywy się zdarzają. Wprowadzenie grupy fosforanowej tutaj, czyli fosforylacja S, powoduje wygenerowanie kanonicznego motywu dla następnej seryny S i też jej fosforylację, a to z kolei spowoduje wygenerowanie motywu dla seryny S i także jej fosforylację, itd. Może być taka lawina.
Jeśli idzie o motyw, te kinazy mają różnego rodzaju wymagania.
Są takie kinazy, które mają stosunkowo szerokie spektrum substratów i motywów, które są rozpoznawane, ale są także takie kinazy, które rozpoznają tylko bardzo określone sekwencje.
Przykładem takiej kinazy jest kinaza Aurora, która fosforyluje histon H1. Jest bardzo ściśle określona sekwencja 4 aminokwasów, która jest rozpoznawana. To jest taka fosforylacja, która jest skorelowana z mitozą.
Drugi rodzaj kinaz, które rozpoznają bardzo swoiste motywy, to są kinazy, które fosforyzują czynniki splicingowe. Bardzo często mają powtórzenia Ser, Arg (SRSRSRSR). Formowanie się spliceosomu jest często związane albo z koniecznością fosforylowania tych seryn, albo wręcz odwrotnie, koniecznością defosforylacji. To jest taki proces, który zawiera jeden i drugi element w zależności od tego, z jakim etapem formowania tego spliceosomu mamy do czynienia.
Kinazy SRPK1 oraz Clk/Sty - wykazują wyłączną swoistość do takich powtarzających się motywów Ser, Arg i które są w związku z tym zaangażowane wyłącznie w fosforylację tego rodzaju motywów.
Czynniki splicingowe najczęściej są gromadzone na terenie jądra komórkowego, w postaci ziarnistości, które są nierozpuszczalne i niefunkcjonalne. Procesem, który powoduje uwolnienie tych czynników z ziarnistości i umożliwia wykorzystanie białek splicingu jest właśnie fosforylacja. Te kinazy biorą udział w właśnie tego rodzaju procesie.
Kinaza DNA-PKCS - jej aktywność zależna od obecności DNA. Tak naprawdę od obecności wolnych końców DNA. Bierze ona udział w niehomologicznej naprawie DNA.
Jeżeli pojawi się pęknięcie dwuniciowe w DNA, to komórka ma sposoby, żeby naprawiać tego rodzaju uszkodzenia. Jeśli idzie o komórki ssacze, dominującym sposobem jest naprawa przez rekombinację niehomologiczną, która polega na łączeniu cząsteczek, które mają wolne końce. Ta kinaza DNA-PK jest czynnikiem, która bierze w tym udział.
Kinaza ta ma swoistość do motywu: seryna lub treonina, po której występuje glutamina, czyli taką słabą stosunkowo swoistość, ale generalnie ta swoistość jest determinowana właśnie przez obecność tych wolnych końców, tutaj łączą się takie dwie podjednostki regulatorowe do tych wolnych końców, potem ta część katalityczna i ta kinaza fosforyzuje siebie, a potem takie białko Artemis, które bierze udział w dalszych etapach naprawy.
To dotyczy naprawy, ale także występuje przy tworzeniu się przeciwciał (przy tasowaniu się genów).
To przejście do tego drugiego elementu, elementu strukturalnego, który wyznacza swoistość kinaz białkowych, ale o tym za tydzień.
9