Aneta Kosińska, Aleksandra Lemiesz

Sprawozdanie

Fluorymetryczne oznaczanie tryptofanu w białkach

Celem ćwiczenia było zapoznanie się ze zjawiskiem fluorescencji. Polega ono na emitowaniu światła przez wzbudzony atom lub cząsteczkę. Zjawisko uznaję się za fluorescencję, gdy po zaniku czynnika pobudzającego następuje szybki zanik emisji w czasie około 10⁻⁸ s. Gdy czas zaniku jest znacznie dłuższy, to zjawisko jest uznawane za fosforescencję. Poza omówionym wcześniej zagadnieniem, celem ćwiczenia było fluorymetryczne oznaczenie zawartości tryptofanu w białku. Fluorymetryczne właściwości reszt tryptofanu są uzależnione od otoczenia chromoforu, w tym przede wszystkim od lokalizacji w łańcuchu polipeptydowym oraz ładunku sąsiednich reszt aminokwasowych. Poza tym zastosowanie wewnętrznego standardu pozwala na ilościowe oznaczenie tryptofanu w białkach zawierających ugrupowania pochłaniające w zakresie 290-370 nm, takie jak nukleotyd flawinowy, hem lub fosforan pirydoksalu.

Urządzeniem do pomiaru fluorescencji jest spektrofluorymetr, zasada jego działania jest następująca: promieniowanie elektromagnetyczne z odpowiedniego źródła światła (lampa) dostaję się do monochromatora wzbudzającego (pryzmat lub siatka dyfrakcyjna). Z monochromatora wiązka światła o konkretnej długości przechodzi przez kuwetę zawierającą substancję badaną (mającą właściwości fluorescencyjne) i wchodzi do monochromatora emisyjnego, który analizuję wiązkę światła, emitowanego przez wzbudzone cząsteczki, prostopadle do wiązki światła wzbudzającego. Fluorescencja dla wydzielonej długości fali mierzona jest za pomocą detektora natężenia promieniowania (fotopowielacz).

Metody fluorescencyjne znajdują zastosowanie w dziedzinach: farmacji (badania metabolizmu), medycyny i analizy klinicznej (oznaczanie witamin, enzymów), biochemii (detekcja i oznaczanie śladowych enzymów, lipidów), detekcji śladowych komponentów w produktach spożywczych, analiza organiczna i nieorganiczna (oznaczanie wszelkich substancji fluoryzujących).

1.Tabele z wartościami dotyczące wykresów widm:

Tabela dotycząca wykresu 1		Tabela dotycząca wykresu 2		Tabela dotycząca wykresu 3
Długość fali [nm]	Absorbancja [A]	Długość fali [nm]	Emisja fluorescencji [j.u]	Długość fali [nm]	Emisja fluorescencji [j.u]
240,13	0,30186	230	44,4618	320	65,5548
245,10	0,31887	240	196,4522	330	137,3176
250,08	0,38669	250	227,6452	340	202,5944
255,05	0,50185	260	170,7091	350	249,4725
260,02	0,63243	270	124,011	360	265,616
265,11	0,75244	280	111,3181	370	242,1294
270,09	0,82477	290	185,2384	380	196,8724
275,06	0,83319	300	173,4827	390	150,3547
280,03	0,83885	310	15,4824	400	111,447
285,01	0,70377	320	2,2140	410	78,2626
290,10	0,5190			420	53,4236
295,07	0,20162
300,04	0,0799
305,02	0,036295
310,11	0,021999
315,08	0,016509
320,05	0,012177

2.Wykonanie widm L-tryptofanu:

a) absorpcyjnego (stężenie tryptofanu 0,5 mM, pomiar wykonany w kuwetach kwarcowych kwarcowych w zakresie długości fali 240-320 nm)

Wykres 1

b) wzbudzenia (3 ml roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w buforze fosforanowym pH=7, wzbudzenie (excitation) w zakresie 230-320 nm oraz emisję (emission) λ=354 nm)

Wykres 2

Wartość maksimum wzbudzenia fluorescencji wynosi 229,143 j.u, dla długości fali 249,07 nm

c) fluorescencji (3 ml roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w buforze fosforanowym pH=7, wzbudzenie (excitation) w zakresie 320-420 nm oraz emisję (emission) λ=295 nm)

Wykres 3

Wartość maksimum emisji fluorescencji wynosi 265,616 j.u, dla długości fali 360 nm

3.Wyznaczanie zależności natężenia fluorescencji I_fl od stężenia dodanego do roztworu białka tryptofanu (3 ml buforu fosforanowego, 6x10 µl roztworu tryptofanu o c=0,5 mM w buforze fosforanowym o pH=7, wzbudzenie λ=295 nm, emisja w zakresie 320-460 nm).

a) Obliczanie stężenia końcowego tryptofanu bez korekcji:

Dane:

V_buforu = 3ml C_try=n_try/ V_try C_k1=0,5mMx15^-3ml/3ml=2,5 µM

C_try = 0,5mM n_try=C_tryxV_try

V_try1 = 15 µl = 0,015ml C_k1=n_try/V_buforu

Korzystając z tych wzorów otrzymujemy stężenia końcowe bez korekcji dla pozostałych danych.

b) obliczanie stężenia końcowego tryptofanu z korelacją:

Dane:

V_try1 = 15 µl = 0,015ml C_końcowe=n_try/V_c

V_c=V_buforu+V_try C_k1=0,5mMx15^-3ml/3,015ml=2,4876 µM

Korzystając z tych wzorów otrzymujemy stężenia końcowe z korekcją dla pozostałych danych.

c) krzywa wzorcowa emisji fluorescencji

Dodana objętość roztworu tryptofanu 0,5mM [µl]	Emisja fluorescencji dla λ=354 [j.u]	Stężenie końcowe tryptofanu bez korekcji [µM]	Stężenie końcowe tryptofanu z korekcją [µM]	Pole(RFU^2)
15	59,25	2,5	2,4876	4421,6
30	213,8038	5	4,9505	15692
45	261,6212	7,5	7,3892	18950
60	404,6461	10	9,8039	29361
75	547,2466	12,5	12,1951	39622
90	672,7351	15	14,5631	48430

d) Wykres zależności natężenia fluorescencji od skorygowanego stężenia tryptofanu

e) wyznaczanie metodą najmniejszych kwadratów prostą opisującą zależność natężenia fluorescencji od skorygowanego natężenia tryptofanu

Przy użyciu funkcji REGLINP:

y=ax+b

a_w=49,79573 b=-66,6116 r=0,987277

∆a=2,826456 ∆b=26,8691

f) wykres zależności pola od skorygowanego stężenia tryptofanu

4. Wyznaczanie zależności intensywności fluorescencji białka - BSA od ilości dodawanego wzorca wewnętrznego - tryptofanu. Oznaczanie zawartości tryptofanu w białku (3 ml białka o stężeniu 0,05 g/l, 6x10 µl roztworu tryptofanu o c=0,05mM w buforze fosforanowym o pH=7, wzbudzenie λ=295 nm, emisja w zakresie 310-460 nm)

a)Emisja fluorescencji roztworu białka o stężeniu 0,05 g/l (roztwór wodny w 6M chlorowodorku guanidyny) z wzorcem wewnętrznym (tryptofanem).

Dodana objętość roztworu tryptofanu 0,5mM [µl]	Emisja fluorescencji dla λ=354 [j.u]	Stężenie końcowe tryptofanu bez korekcji [µM]	Stężenie końcowe tryptofanu z korekcją [µM]	Pole(RFU^2)
0	89,837	O	0	7345,9
10	111,9602	1,667	1,661	8903,7
20	133,6106	3,333	3,311	10484
30	153,3053	5	4,95	11922
40	177,1049	6,667	6,579	13635
50	199,656	8,333	8,197	15291
60	222,6727	10	9,804	16924

b)wykres zależności natężenia fluorescencji od dodanego do roztworu białka tryptofanu

c)obliczanie liniowej regresji przy użyciu funkcji REGLINP:

a_oz=13,493

b=88,946 r=0,9993

d)Wykres zależności pola od skorygowanego stężenia tryptofanu

5. Korzystając z krzywej wzorcowej, wyznaczam stężenie tryptofanu w białku BSA.

I_fl=aC_Tr+b

I_BSA=88,946

I_BSA=49,796C_tryptofanu-66,61

Ctryptofanu=3,124[µM]

6. Koryguję otrzymaną wartość, mnożąc ją przez empiryczny współczynnik proporcjonalności równy a_w/a_oz:

a_w/a_oz=49,796/13,493=3,6905

C_tryptofanu=11,529[µM]

7. Wyznaczam liczbę reszt tryptofanu Rtr przypadających na jedną cząsteczkę BSA, korzystając z zależności: R_tr=C_tr/C_BSA:

M_BSA=66430[g/mol]

R_tr=11,529µM/0,05x66430=3,47x10^-12 reszt tryptofanu

8.Charakterystyka białka:

BSA (albumina surowicy bydlęcej) - białko, pozyskiwane na dużą skalę z krwi wołowej (także krowiej i podobnych). Używana w biochemii i biologii molekularnej jako białko neutralne, nie reagujące i nie zaburzające większości przeprowadzanych reakcji. Nie wykazuje własnej aktywności enzymatycznej. Oczyszczone białko jest wolne od przeciwciał i innych zanieczyszczeń organicznych.

Zastosowania BSA:

• stabilizowanie pracy enzymów,

• środek stabilizujący w buforach do przechowywania enzymów,

• białko wzmacniające oddziaływania specyficzne w reakcjach z przeciwciałami,

• białko do sporządzania krzywych standardowych, białko kontrolne, odnośnikowe, do "prób ślepych",

• składnik odżywczy w hodowlach komórkowych.

Właściwości BSA:

• Liczba aminokwasów: 583

• Masa molowa: 66 430

8. Wnioski:

Natężenie emisji fluorescencji jest proporcjonalne do stężenia BSA. Tryptofan posiada grupę indolową (C₈H₇N), która jest źródłem promieniowania UV i emisji w proteinach. Emisja tryptofanu jest najbardziej wrażliwa na lokalne otoczenie, tryptofan jest więc najczęściej stosowany w celu dostarczania informacji o elementach strukturalnych białek.

---