Metoda RT-PCR - stosowana do badań poziomu transkrypcji, a zate i poziomu ekspresji genów
Etapy metody:1.synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA przy udziale enzymy odwrotnej transkyptazy. 2.amplifikacja badanego fragmentu DNA metodą PCR
Synteza cDNA
A)przy użyciu heksamerów - wszystkie rodzaje RNA ulegają przepisaniu na cDNA (rRNA, t RNA i mRNA) i dopiero PCR zze specyficznymi starterami dla badanego genu Dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu
B) przy użyciu oligo (dT)
- bardziej specyficzna systeza z zastosowaniem oligo (dT). Który hybrydyzuje z poliadenylowymi końcami 3' mRNA
- ilość cDNA jest mniejsza niż w przypadku syntezy na matrycy całkowitego RNA (mRNA to ok. 5% całkowitego RNA)
C) przy użyciu startera specyficznego do analizowanego genu
- najbardziej specyficzna synteza cDNA
- czasami pojawiają się problemy z uzyskaniem cDNA
Syteza cDNA z losowymi heksamerami (random hexametric primers) etapy: 1) przygotować mieszaninę) całkowity RNA 5μl. Losowe hesamery 3μl, woda dest. 4μl 2)Inkubować 10min 70°C 3)dodać 8μl mieszaniny buforu, MgCl2, dNTP, 0,1M MdTT i RT 4)inkubacja 50min w 42°C 5) Dodać Rnazy 6) inkubacja 20min w 37°C 7) Schłodzić do 4° -> PCR lub zamrozić
Metoda RT-PCR - stosowana do badań poziomu transkrypcji, a zate i poziomu ekspresji genów
Etapy metody:1.synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA przy udziale enzymy odwrotnej transkyptazy. 2.amplifikacja badanego fragmentu DNA metodą PCR
Synteza cDNA
A)przy użyciu heksamerów - wszystkie rodzaje RNA ulegają przepisaniu na cDNA (rRNA, t RNA i mRNA) i dopiero PCR zze specyficznymi starterami dla badanego genu Dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu
B) przy użyciu oligo (dT)
- bardziej specyficzna systeza z zastosowaniem oligo (dT). Który hybrydyzuje z poliadenylowymi końcami 3' mRNA
- ilość cDNA jest mniejsza niż w przypadku syntezy na matrycy całkowitego RNA (mRNA to ok. 5% całkowitego RNA)
C) przy użyciu startera specyficznego do analizowanego genu
- najbardziej specyficzna synteza cDNA
- czasami pojawiają się problemy z uzyskaniem cDNA
Syteza cDNA z losowymi heksamerami (random hexametric primers) etapy: 1) przygotować mieszaninę) całkowity RNA 5μl. Losowe hesamery 3μl, woda dest. 4μl 2)Inkubować 10min 70°C 3)dodać 8μl mieszaniny buforu, MgCl2, dNTP, 0,1M MdTT i RT 4)inkubacja 50min w 42°C 5) Dodać Rnazy 6) inkubacja 20min w 37°C 7) Schłodzić do 4° -> PCR lub zamrozić
Metoda RT-PCR - stosowana do badań poziomu transkrypcji, a zate i poziomu ekspresji genów
Etapy metody:1.synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA przy udziale enzymy odwrotnej transkyptazy. 2.amplifikacja badanego fragmentu DNA metodą PCR
Synteza cDNA
A)przy użyciu heksamerów - wszystkie rodzaje RNA ulegają przepisaniu na cDNA (rRNA, t RNA i mRNA) i dopiero PCR zze specyficznymi starterami dla badanego genu Dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu
B) przy użyciu oligo (dT)
- bardziej specyficzna systeza z zastosowaniem oligo (dT). Który hybrydyzuje z poliadenylowymi końcami 3' mRNA
- ilość cDNA jest mniejsza niż w przypadku syntezy na matrycy całkowitego RNA (mRNA to ok. 5% całkowitego RNA)
C) przy użyciu startera specyficznego do analizowanego genu
- najbardziej specyficzna synteza cDNA
- czasami pojawiają się problemy z uzyskaniem cDNA
Syteza cDNA z losowymi heksamerami (random hexametric primers) etapy: 1) przygotować mieszaninę) całkowity RNA 5μl. Losowe hesamery 3μl, woda dest. 4μl 2)Inkubować 10min 70°C 3)dodać 8μl mieszaniny buforu, MgCl2, dNTP, 0,1M MdTT i RT 4)inkubacja 50min w 42°C 5) Dodać Rnazy 6) inkubacja 20min w 37°C 7) Schłodzić do 4° -> PCR lub zamrozić
Metoda RT-PCR - stosowana do badań poziomu transkrypcji, a zate i poziomu ekspresji genów
Etapy metody:1.synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA przy udziale enzymy odwrotnej transkyptazy. 2.amplifikacja badanego fragmentu DNA metodą PCR
Synteza cDNA
A)przy użyciu heksamerów - wszystkie rodzaje RNA ulegają przepisaniu na cDNA (rRNA, t RNA i mRNA) i dopiero PCR zze specyficznymi starterami dla badanego genu Dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu
B) przy użyciu oligo (dT)
- bardziej specyficzna systeza z zastosowaniem oligo (dT). Który hybrydyzuje z poliadenylowymi końcami 3' mRNA
- ilość cDNA jest mniejsza niż w przypadku syntezy na matrycy całkowitego RNA (mRNA to ok. 5% całkowitego RNA)
C) przy użyciu startera specyficznego do analizowanego genu
- najbardziej specyficzna synteza cDNA
- czasami pojawiają się problemy z uzyskaniem cDNA
Syteza cDNA z losowymi heksamerami (random hexametric primers) etapy: 1) przygotować mieszaninę) całkowity RNA 5μl. Losowe hesamery 3μl, woda dest. 4μl 2)Inkubować 10min 70°C 3)dodać 8μl mieszaniny buforu, MgCl2, dNTP, 0,1M MdTT i RT 4)inkubacja 50min w 42°C 5) Dodać Rnazy 6) inkubacja 20min w 37°C 7) Schłodzić do 4° -> PCR lub zamrozić
Metoda RT-PCR - stosowana do badań poziomu transkrypcji, a zate i poziomu ekspresji genów
Etapy metody:1.synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA przy udziale enzymy odwrotnej transkyptazy. 2.amplifikacja badanego fragmentu DNA metodą PCR
Synteza cDNA
A)przy użyciu heksamerów - wszystkie rodzaje RNA ulegają przepisaniu na cDNA (rRNA, t RNA i mRNA) i dopiero PCR zze specyficznymi starterami dla badanego genu Dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu
B) przy użyciu oligo (dT)
- bardziej specyficzna systeza z zastosowaniem oligo (dT). Który hybrydyzuje z poliadenylowymi końcami 3' mRNA
- ilość cDNA jest mniejsza niż w przypadku syntezy na matrycy całkowitego RNA (mRNA to ok. 5% całkowitego RNA)
C) przy użyciu startera specyficznego do analizowanego genu
- najbardziej specyficzna synteza cDNA
- czasami pojawiają się problemy z uzyskaniem cDNA
Syteza cDNA z losowymi heksamerami (random hexametric primers) etapy: 1) przygotować mieszaninę) całkowity RNA 5μl. Losowe hesamery 3μl, woda dest. 4μl 2)Inkubować 10min 70°C 3)dodać 8μl mieszaniny buforu, MgCl2, dNTP, 0,1M MdTT i RT 4)inkubacja 50min w 42°C 5) Dodać Rnazy 6) inkubacja 20min w 37°C 7) Schłodzić do 4° -> PCR lub zamrozić
Metoda RT-PCR - stosowana do badań poziomu transkrypcji, a zate i poziomu ekspresji genów
Etapy metody:1.synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA przy udziale enzymy odwrotnej transkyptazy. 2.amplifikacja badanego fragmentu DNA metodą PCR
Synteza cDNA
A)przy użyciu heksamerów - wszystkie rodzaje RNA ulegają przepisaniu na cDNA (rRNA, t RNA i mRNA) i dopiero PCR zze specyficznymi starterami dla badanego genu Dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu
B) przy użyciu oligo (dT)
- bardziej specyficzna systeza z zastosowaniem oligo (dT). Który hybrydyzuje z poliadenylowymi końcami 3' mRNA
- ilość cDNA jest mniejsza niż w przypadku syntezy na matrycy całkowitego RNA (mRNA to ok. 5% całkowitego RNA)
C) przy użyciu startera specyficznego do analizowanego genu
- najbardziej specyficzna synteza cDNA
- czasami pojawiają się problemy z uzyskaniem cDNA
Syteza cDNA z losowymi heksamerami (random hexametric primers) etapy: 1) przygotować mieszaninę) całkowity RNA 5μl. Losowe hesamery 3μl, woda dest. 4μl 2)Inkubować 10min 70°C 3)dodać 8μl mieszaniny buforu, MgCl2, dNTP, 0,1M MdTT i RT 4)inkubacja 50min w 42°C 5) Dodać Rnazy 6) inkubacja 20min w 37°C 7) Schłodzić do 4° -> PCR lub zamrozić