Laboratorium 6 - Instrukcja - PCR, Semestr II, biologia MO, Laboratorium 6


Ćwiczenie VI

REAKCJA ŁAŃCUCHOWA POLIMERAZY (Polymerase Chain Reaction - PCR).
Wstęp teoretyczny.

Jest to metoda umożliwiająca wybiórcze powielenie żądanego fragmentu DNA bez konieczności jego oddzielenia od innych sekwencji. Główną zasadą metody jest polimeryzacja DNA przy pomocy odpowiednio dobranych starterów (primerów) DNA, w taki sposób, że powieleniu ulega jedynie fragment DNA zlokalizowany pomiędzy parą („forward” i „reverse”) starterów. Taki wynik otrzymuje się w odpowiednio dobranym środowisku (ważne jest stężenie substratów oraz kationów jedno- i dwuwartościowych), istotnym warunkiem jest dobranie odpowiedniej temperatury i czasu trwania poszczególnych etapów reakcji PCR. Niezwykle istotne jest też dobranie starterów o właściwych parametrach.

Głównymi etapami reakcji są:

Etapy te powtarzane są cyklicznie, co powoduje wykładniczy wzrost produktu reakcji (każdy produkt reakcji stanowi matrycę w kolejnym cyklu PCR). Po 25 cyklach powielania DNA
z jednej kopii można uzyskać 106 cząsteczek wybranego fragmentu DNA.

Startery (primery)

Sekwencja nukleotydowa starterów jest komplementarna do początkowego fragmentu namnażanej nici DNA (forward) oraz zgodna z końcowym fragmentem namnażanej nici DNA (reverse). Startery powinny mieć długość 15-25 nukleotydów, ważne jest, żeby ich sekwencja nukleotydowa była unikalna, tzn. nie powtarzała się w badanym genomie. Startery powinny zawierać 40-60% nukleotydów G i C, i nie powinny zawierać odwróconych powtórzeń. Temperatura topnienia (Tm) podwójnoniciowej cząsteczki utworzonej przez oba startery
z matrycą powinna być podobna (różnica Tm <50C), na końcu powinien być nukleotyd G lub C, ale nie więcej niż jeden. Startery nie powinny być komplementarne względem siebie
(max. 3 kolejne nukleotydy mogą być komplementarne), ani zawierać ciągów puryn
lub pirymidyn.

Wyznaczanie Tm dla starterów:

Tm = 2(NA+NT) + 4(NG+NC),

gdzie : NA - ilość nukleotydów adeninowych,

NT - ilość nukleotydów tymidynowych,

NG - ilość nukleotydów guaninowych,

NC - ilość nukleotydów cytozynowych,

Składniki mieszaniny reakcyjnej :

  1. Matryca DNA, pojedynczo- lub podwójnoniciowa, najczęściej liniowa.

  2. Startery (oligonukleotydy) o odpowiedniej sekwencji

  3. Trójfosforany deoksynukleotydów (dNTPs) - mieszanina równych ilości (po 200-250 μM); dATP, dTTP, dCTP, dGTP.

  4. Kationy II-wartościowe - Mg+2. Ponieważ kationy te są wiązane przez DNA
    i nukleotydy (poprzez grupy fosforanowe), dla każdej reakcji dobiera się optymalne stężenie Mg+2, zwykle 1.5 mM

  5. 10 mM bufor, najczęściej Tris-HCl, pH 8.3 - 8.8, w temperaturze 720C pH wynosi
    ok. 7,2.

  6. Kationy I-wartościowe 50-100 mM KCl

  7. Termostabilna polimeraza DNA, najczęściej używana jest polimeraza izolowana
    z Termophilus aquaticus (Archea) - polimeraza Taq.

Warunki reakcji PCR

  1. Denaturacja: używa się maksymalnej temperatury, tolerowanej przez polimerazę. Dla polimerazy Taq wynosi ona 94-950C. Jest to temperatura wystarczająca do całkowitej denaturacji matryc o zawartości G+C do 55%. Matryce bogate w pary GC wymagają polimeraz odpornych na wyższe temperatury, np. polimerazy izolowanej z Pyrococcus woesei (Pwo) lub Pyrococcus furiosus (Pfu). Średni czas denaturacji wynosi 30 sekund.

  2. Przyłączanie starterów (annealing): używa się temperatury niższej o 3-50C
    od skalkulowanej Tm dla starterów (jeśli startery mają różne temperatury Tm, wybiera się niższą z nich). Dokładną temperaturę przyłączania starterów wyznacza się doświadczalnie testując reakcję w granicach 2-100C poniżej Tm. Standardowy czas przyłączania starterów to 30 sekund.

Zbyt wysoka temperatura przyłączania starterów powoduje silne obniżenie wydajności reakcji,
zbyt niska prowadzi do powstania niespecyficznych produktów reakcji (proszę się zastanowić
, dlaczego?).

  1. Wydłużanie łańcucha DNA (elongacja): Zachodzi w temperaturze optymalnej dla używanej polimerazy. W przypadku polimerazy Taq jest to 72-780C. Wydajność polimeraz jest różna, w przypadku polimerazy Taq wynosi 2000 nt/min. Czas wydłużania łańcucha dla polimerazy wylicza się na podstawie długości powielanego fragmentu DNA przyjmując (dla polimerazy Taq) 1 minutę na każde 1000 nt.

Ilość cykli denaturacji/przyłączania starterów/elongacji wyznacza się tak, aby uzyskać jak największą ilość specyficznego produktu (a więc zanim wyczerpie się jeden z substratów). Ilość ta zależy min. od dokładności polimerazy. Dla polimerazy Taq stosuje się co najmniej 25, do 30 cykli.

Ćwiczenie VI

I. Składanie reakcji PCR dla genu mtTFA (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A)

Odczynniki:

H2O dejonizowana

Bufor do PCR II (Perkin Elmer) 10x

MgCl2 25 mM

dNTPs (mieszanina) 5 mM

starter F 25 pM/μl

starter R 25 pM/μl

polimeraza Taq 5U/μl

DNA komórkowe 50 ng/μl

Mieszanina reakcyjna zawiera w 50 μl objętości końcowej:

Bufor do PCR II (Perkin Elmer) 1x

MgCl2 w stężeniu 1,5 mM

dNTPs (mieszanina) w stężeniu 200 μM

starter F 50 pM

starter R 50 pM

DNA komórkowe 100 ng

Polimeraza Taq 2 U

H2O dejonizowana

Razem: 50 μl

Wykonanie:

Odczynniki bardzo dokładnie mieszać przez pipetowanie po każdym dodaniu kolejnych składników. Pamiętać o właściwym pipetowaniu prób (przy pobieraniu nie dociskać tłoczka do końca, a tylko do pierwszego oporu!). Wszystkie odczynniki należy od razu po pobraniu odkładać do naczynia z lodem. Po zakończeniu pipetowania próby zworteksować, zwirować
i odpipetować 25 µl do probówek o objętości 200 µl. Wstawić do termocyklera zaprojektować reakcję PCR ustawiając warunki:

  1. Denaturacja 1 10 min.

  2. cykl 1

    1. Denaturacja 940C, 30 sek.

    2. Annealing 640C, 30 sek.

    3. Elongacja 720C, 1 min.

  3. 35 cykli

  4. Elongacja końcowa 720C, 10 min.

  5. Koniec, 40C

Produkty reakcji zostaną rozdzielone w żelu agarozowym 1.5%, a wyniki dostępne będą
w internecie.

II. Ćwiczenie teoretyczne

Obliczanie Tm dla podanych starterów, wybranie właściwej pary starterów do podanego genu (mtTFA)

Sekwencja eksonów szczurzego genu mtTFA

(mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A)

GGCATGATAACAAGCCCCTGGAGTACCCACGCGGGTTTCGTGGCTGTGTGTAGGCACAGTGTCGCGTGGGACGAACCGGACGGCGCCGGGCCTATAGTCGTCGGCCCGAGGGATGGCGCTGTTCCGGGGAATGTGGGGCGTGCTAAGAACACTGGGGCGCACGGGGGTCGAGATGTGCGCGGGCTGCGGGGGCCGCATACCCTCGCCTGTCAG

CCTTATCTGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCTTGGGTAATTATCCAAAGAAACCTATGAGTTCATACCTTCGATTTTCTACAGAACAGCTACCCAAATTTAAAGCTAAACACCCAGATGCAAAAGTTTCAGAACTGATTAGAAAAATTGCAGCCATGTGGAGGGAGCTTCCGGAAGCAGAAAAAAAGGTGTATGAAGCGGATTTTAAAGCTGAGTGGAAGGTGTACAAAGAAGCTGTGAGCAAGTATAAAGAGCAGCTAACTCCAAGTCAGCTGATGGGCTTAGAGAAGGAAGCCCGGCAGAAACGCCTAAAGAAGAAAGCACAAATCAAGAGGAGAGAATTAATTTTGCTTGGAAAACCAAAAAGACCTCGGTCAGCATATAACATTTACGTATCTGAAAGCTTCCAGGAGGCTAAGGATGAGTCAGCTCAGGGGAAATTGAAGCTTGTAAATCAGGCTTGGAAAAATCTGTCTCATGATGAAAAGCAGGCATATATTCAGCTTGCTAAAGATGATAGAATTCGTTATGACAATGAAATGAAGTCTTGGGAAGAGCAAATGGCTGAAGTTGGGCGAAGTGATCTCATCCGTCGCAGTGTGAAGCGACCCCCGGGAGACATCTCTGAGAATTAAGATTGAAGACAGAGTTGTCATTGGGATTGGGCACAA

GAAGCTGGTTAAGTCTCAAAGCCTTAAGTTGTCAAACTTGAAAGGATAAAGGGGTTAACCTTTGACACTCAGTTCATTTTTCTGTAGCCCATGGACTTCTGCCCACTGAATGCATTTCTGTTGACCTTTTGAGCCTTGACAGTAGATCATGACGAGTTCTGCCGTTTGCTTAAGAACTGGAATCAAGACTGTGCGTGCATCTGCATGCAGTGGTGAATTGTTCTGCATTTGATGGTGTAGACAGACTGAAGTGACTTTCACACTGGTGACAGTTTCGTGCGGGTTTGTGAAGTTCTTACACTGATGGCCATTACATGTGGGTGCCCCCTTGTCCCAGGCCCAGAGCTGCTCACAGCTGTGGCAGAGCCATTGCAGTTTCTAAGAACCTTCCGGGCTTTACTAGATGACGTGGTTTCTAGACATAATCATGTGTAGAGTTGATGTTTGTACACAATAAGTGATCATCGATGTCCTAACAGCATTTTATAGTAGGAGAGATTTACAAGTCTTTCTCAAATTAAGAAATTATGTACCAGGTCTATGCATATGTTTTTATTGCATAGAATAAAAACTCTAATTTTCCAAAC

Na żółto zaznaczone sekwencje odpowiadające starterom F lub R

1

ATTACCCAAGCTGGAAAAACACTT

2

GAGTACCCACGCGGGTTTCG

3

TGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCTT

4

TGTGCCCAATCCCAATGACA



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Laboratorium 2 - Instrukcja - Obserwacja komorek zwierzecych w mikroskopie swietlnym, Semestr II, bi
Laboratorium 4 - Instrukcja - Trawienie DNA faga za pomoca enzymu restrykcyjnego EcoRI, Semestr II,
Laboratorium 3 - Instrukcja - Izolacja DNA z hodowanych komórek eukariotycznych, Semestr II, biologi
Kolokwium - zagadnienia, Semestr II, biologia MO, Laboratorium 5
Plan ćwiczeń II semestr I rok 2008, Semestr II, biologia MO, Laboratorium 1
Sprawozdanie - BMiGO - Cwiczenie 4 - Andrzej Michalski - Sekcja 2 - ocenione, Semestr II, biologia M
przebieg, PSYCHOLOGIA, I ROK, semestr II, biologiczne mechanizmy zachowania II.mózgowe mechanizmy fu
Notatki ostatni wykład, Licencjat, Semestr II, Biologia komórki
TEST I, IŚ PW semestr II, biologia i ekologia, egzamin
biola zestaw 2, IŚ PW semestr II, biologia i ekologia, egzamin
MAPC w leczeniu ran skóry, Licencjat, Semestr II, Biologia komórki
EGZAMIN I, IŚ PW semestr II, biologia i ekologia, egzamin
biologia i ekologia wykłady, Inyznieria srodowiska, Semestr II, biologia środowiska i ekologia

więcej podobnych podstron