+Badanie aktywności wybranych oksydoreduktaz

Łańcuch oddechowy jest jednym z głównych źródeł reaktywnych form tlenu (jak anionorodnik ponadtlenkowy - O₂^-Ⴗ, nadtlenek wodoru - H₂O₂, czy rodnik hydroksylowy - OH^Ⴗ ). Ponieważ powstawanie reaktywnych form tlenu jest procesem nieuniknionym i zachodzącym w warunkach fizjologicznych we wszystkich komórkach aerobowych, organizmy aerobowe wykształciły system obrony, aby uniknąć toksycznych skutków metabolizmu tlenowego. W skład tego systemu wchodzi zarówno układ enzymatyczny, jak i cały szereg niskocząsteczkowych związków o działaniu antyoksydacyjnym (jak glutation - GSH, witaminy A, C, E, melatonina itd.). Enzymatyczny układ antyoksydacyjny człowieka składa się z kilku enzymów współdziałających ze sobą w celu zneutralizowania reaktywnych form tlenu, zanim dojdzie do uszkodzenia ważnych struktur komórkowych. Do enzymów tych należą:

1. dysmutaza ponadtlenkowa (SOD; EC 1.15.1.1):

O₂^-Ⴗ + O₂^-Ⴗ + 2 H⁺ H₂O₂ + O₂

2. 
   katalaza (CAT; EC 1.11.1.6):

H₂O₂ + H₂O₂ 2H₂O + O₂

3. peroksydaza glutationowa (GSH-Px; EC 1.11.1.9):

H₂O₂ + 2GSH H₂O + H₂O + GSSG

lub

ROOH + 2GSH ROH + H₂O + GSSG

4. reduktaza glutationowa (GR; EC 1.6.4.2):

GSSG + NADPH + H⁺ 2GSH + NADP⁺

Pierwszym enzymem obrony antyoksydacyjnej organizmu jest dysmutaza ponadtlenkowa, przekształcająca w reakcji dysmutacji anionorodnik ponadtlenkowy w mniej toksyczny dla komórki nadtlenek wodoru i cząsteczkę O₂. W organizmie człowieka znajdują się trzy rodzaje SOD: dwa enzymy zawierające w cząsteczce miedź i cynk: cytozolowy (Cu,ZnSOD) i pozakomórkowy (EC-SOD), oraz enzym zawierający w cząsteczce mangan (MnSOD), występujący w matrix mitochondrialnym. SOD, współpracując z CAT i GSH-Px, które z kolei rozkładają H₂O₂, zapobiega powstawaniu najgroźniejszego dla organizmu rodnika hydroksylowego - OH^Ⴗ.

Katalaza przeprowadza reakcję dysmutacji nadtlenku wodoru do cząsteczki H₂O i O₂. Enzym ten jest obecny we wszystkich tkankach i narządach; jest metaloproteiną, zawierającą w swojej cząsteczce żelazo - w centrum aktywnym posiada ugrupowanie hemowe.

Peroksydazy glutationowe katalizują redukcję nadtlenku wodoru, a także ponadtlenków organicznych (ROOH) przy udziale zredukowanego glutationu (GSH), który w reakcji ulega utlenieniu do diglutationu (GSSG). Peroksydazy glutationowe są selenobiałkami, zawierają bowiem w swoim centrum aktywnym aminokwas - selenocysteinę.

Reduktaza glutationowa katalizuje redukcję utlenionego glutationu, który powstaje w wielu różnych reakcjach enzymatycznych. Enzym zawiera silnie związaną cząsteczkę FAD w centrum aktywnym - GR jest flawoenzymem, zużywającym NADPH do redukcji GSSG.

Laboratorium 11 Ł A Ń C U C H O D D E C H O W Y I

U K Ł A D A N T Y O K S Y D A C Y J N Y

Ćwiczenie 1: Wykrywanie aktywności oksydazy cytochromowej

Zasada:

Występowanie oksydazy cytochromowej w tkankach można wykazać przy pomocy reakcji z odczynnikiem NADI (p-fenylenodiamina z α-naftolem, zmieszane w stosunku 1:1). W obecności oksydazy cytochromowej zachodzi utlenienie p-fenylenodiaminy - powstaje fioletowa barwa roztworu.

Wykonanie:

1. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj odczynnik NADI, mieszając p-fenylenodiaminę z α-naftolem w stosunku 1:1 (1 mL + 1 mL).

2. Do 4 probówek odmierz podane w tabelce objętości poszczególnych roztworów.

Zawartość probówki nr 4 przed dodaniem NADI należy zagotować (wstawić na 5 min. do wrzącej łaźni wodnej), a następnie ostudzić!

probówka nr	wyciąg z ziemniaka [mL]	0,1 M bufor fosforanowy pH 7,4 [mL]	woda dest. [mL]	roztwór NaCN	NADI [mL]
1	2,0	2,0	0	0	0,2
2	2,0	2,0	0	3 krople	0,2
3	2,0	2,0	0,2	0	0
4	2,0	2,0	0	0	0,2
		zagotuj i ostudź

UWAGA: NaCN to silna trucizna!

3. Zawartość probówek wymieszaj starannie i zostaw w temperaturze pokojowej na 20 min.

4. Zaobserwuj i zanotuj wyniki doświadczenia oraz sformułuj wnioski.

Ćwiczenie 2: Wykrywanie aktywności katalazy

Zasada:

Tlen, powstający w wyniku rozkładu nadtlenku wodoru przez katalazę, wydziela się z roztworu powodując jego silne pienienie.

Wykonanie:

1. Do 3 probówek dodaj podane w tabelce objętości poszczególnych roztworów.

Zawartość probówki nr 3 przed dodaniem H₂O₂ należy zagotować (wstawić na 5 min. do wrzącej łaźni wodnej), a następnie ostudzić!

probówka nr	hemolizat [mL]	0,1 M bufor fosforanowy pH 7,4 [mL]	roztwór NaCN	3% roztwór nadtlenku wodoru
1	0,1	2,0	0	10 kropli
2	0,1	2,0	3 krople	10 kropli
3	0,1	2,0	0	10 kropli
		zagotuj i ostudź

UWAGA! NaCN to silna trucizna!

2. Zaobserwuj i zanotuj wyniki doświadczenia oraz sformułuj wnioski.

Ćwiczenie 3: Oznaczanie aktywności peroksydazy glutationowej

Zasada:

Metoda jest oparta na reakcji przebiegającej w dwóch etapach. W etapie I peroksydaza glutationowa (GSH-Px) reaguje z nadtlenkiem tert-butylu (t-BOOH) i zredukowanym glutationem (GSH), w wyniku czego GSH ulega utlenieniu do formy GSSG. Etap drugi polega na redukcji GSSG do GSH przez enzym - reduktazę glutationową (GR) - przy udziale NADPH+H⁺ jako reduktora. Utlenianie NADPH+H⁺ powoduje spadek absorbancji przy długości fali 340 nm, co jest mierzone spektrofotometrycznie. Aktywność GSH-Px oblicza się na podstawie ubytku zredukowanej formy koenzymu w czasie (sprzężony test Warburga).

reakcja 1: t-BOOH + 2 GSH t-BOH + GSSG

reakcja 2: GSSG + NADPH + H⁺ 2 GSH + NADP⁺

Wykonanie:

1. Wykonaj próbę odczynnikową - do kuwety dodaj kolejno:

1200 μL buforu fosforanowego o pH 7,0, zawierającego 5 mM EDTA

50 μL wody dest.

100 μL roztworu GSH

100 μL roztworu NADPH

5 μL roztworu GR

Po wymieszaniu próbę inkubuj przez 5 min. w temp. pokojowej. Następnie dodaj 50 μL roztworu t-BOOH, znowu wymieszaj i mierz zmiany absorbancji co minutę przez 5 min. przy długości fali λ = 340 nm. Pomiary wykonuj względem buforu fosforanowego (próba ślepa).

2. Wykonaj próbę badaną - do kuwety dodaj kolejno:

1200 μL buforu fosforanowego o pH 7,0, zawierającego 5 mM EDTA

50 μL osocza

100 μL roztworu GSH

100 μL roztworu NADPH

5 μL roztworu GR

Po wymieszaniu próbę inkubuj przez 5 min. w temp. pokojowej. Następnie dodaj 50 μL roztworu t-BOOH, znowu wymieszaj i mierz zmiany absorbancji co minutę przez 5 min. przy długości fali λ = 340 nm. Pomiary wykonuj względem buforu fosforanowego (próba ślepa).

3. Oblicz aktywność peroksydazy glutationowej w osoczu, korzystając z poniższego wzoru:

GSH-Px [U/L] = (Δ A - Δ A_odcz) × 4839

Δ A - średnia zmiana absorbancji próby badanej na minutę

Δ A_odcz - średnia zmiana absorbancji próby odczynnikowej na minutę

4839 - współczynnik kalibracji, uwzględniający objętość mieszaniny inkubacyjnej, molowy współczynnik absorbancji i przeliczenie jednostek na wymagane w międzynarodowej jednostce enzymatycznej

ĆWICZENIE 4. Oznaczanie aktywności ceruloplazminy metodą Ravina.

Ceruloplazmina (Cp) jest miedzioproteiną wykazującą aktywność oksydoreduktazy żelazo (II): O₂. Enzym ten katalizuje przenoszenie 4 elektronów na cząsteczkę O₂, przy czym powstaje bezpośrednio cząsteczka H₂O. Cp jest główną oksydazą występującą w osoczu krwi i jej fizjologicznymi substratami w organizmie są adrenalina, noradrenalina, dihydroksyfenyloalanina i kwas askorbinowy. Cp wykazuje aktywność ferrooksydazy, katalizującej utlenianie żelaza w organizmie.

Zasada:

Dobrym substratem dla ceruloplazminy jest p-fenylenodiamina (PPD). W pierwszym etapie reakcji powstaje kompleks enzym-substrat dzięki połączeniu miedzi enzymu z elektonami π pierścienia aromatycznego PPD. Następnie dochodzi do przeniesienia elektronów z substratu na enzym, przy czym Cu (II) zostaje zredukowana do Cu (I), a z PPD powstaje wolny rodnik. Cu (I) w Cp jest utleniana przez tlen, a rodnik powstały z PPD ulega dalszym przemianom, tworząc barwny fioletowy produkt, utworzony z 3 cząsteczek substratu (zasada Bandrowskiego).

Wykonanie:

1. Przygotuj 2 ponumerowane probówki i postępuj zgodnie z poniższą tabelą:

	próba badana	próba kontrolna
1.	dodaj po 4 mL buforu octanowego o pH 5,5
2.	preinkubuj przez 15 min. w łaźni wodnej o temp. 37°C
3.	-	dodaj 0,5 mL 0,5% azydku sodu (NaN2)
4.	dodaj po 50 μL surowicy
5.	dodaj po 0,5 mL 0,5% roztworu PPD, dokładnie wymieszaj
6.	inkubuj przez 60 min. w łaźni wodnej o temp. 37°C
7.	dodaj 0,5 mL 0,5% azydku sodu, dokładnie wymieszaj	-

2. Zmierz absorbancję próby badanej przy długości fali λ = 530 nm względem próby kontrolnej (próba ślepa).

3. Oblicz aktywność ceruloplazminy według wzoru:

Cp [U/L] = A_530nm ×2644

2644 - współczynnik kalibracji, uwzględniający objętość mieszaniny inkubacyjnej, molowy współczynnik absorbancji i przeliczenie jednostek na wymagane w międzynarodowej jednostce enzymatycznej

GR

GSH-Px

GSH-Px

CAT

SOD

peroksydaza

glutationowa

reduktaza

glutationowa

---