Laboratorium 18 O Z N A C Z A N I E F I Z J O L O G I C Z N Y C H S K Ł A D N I K Ó W

M O C Z U

Ćwiczenie 1. Reakcja mocznika z kwasem azotowym (V).

Zasada:

Mocznik, reagując z kwasem azotowym (V), tworzy trudno rozpuszczalny azotan (V) mocznika.

Wykonanie:

Do probówki odmierz 1 mL roztworu mocznika i dodaj 2 krople stężonego roztworu HNO₃^-. Zaobserwuj wytrącające się kryształy azotanu (V) mocznika.

Ćwiczenie 2. Wykrywanie kreatyniny.

1. metoda Weyla

Do 2 mL moczu dodaj 4 krople roztworu nitroprusydku sodu i 1 mL 2 M roztworu NaOH. Zaobserwuj pojawienie się czerwonej barwy, która znika natychmiast po zakwaszeniu 20% roztworem kwasu octowego (przy nieobecności acetonu w moczu).

2. metoda Jaffe'go

Do 1 mL moczu dodaj 1 mL wody destylowanej oraz 1 mL nasyconego roztworu kwasu pikrynowego. Następnie dodaj 4-5 kropli 2 M roztworu NaOH w celu zalkalizowania roztworu. Zaobserwuj pojawienie się pomarańczowo-czerwonego zabarwienia.

Ćwiczenie 3. Wykrywanie indykanu metodą Denigesa.

Do 2 mL moczu dodaj 1 mL chloroformu, 2 mL stężonego roztworu HCl oraz 3-4 krople KMnO₄. Silnie wytrząśnij zawartość probówki. W przypadku obecności indykanu w moczu, pojawi się niebieskie zabarwienie warstwy chloroformowej (błękit indygo).

Ćwiczenie 4. Reakcja Ehrlicha na urobilinogen.

Do 4 mL moczu dodaj 0,5 mL odczynnika aldehydowego Ehrlicha. W przypadku dużej zawartości urobilinogenu, roztwór zabarwi się na czerwono już na zimno. Przy prawidłowym stężeniu urobilinogenu zabarwienie pojawia się dopiero po podgrzaniu, dlatego wstaw próbę na 3-4 minuty do wrzącej łaźni wodnej. Następnie probówkę należy ostudzić, dodać 1 mL chloroformu i wytrząsać przez 2 minuty. Jeżeli barwnik przejdzie do warstwy chloroformowej, to oznacza, że pochodzi głównie z urobilinogenu.

Ćwiczenie 5. Użycie testu paskowego do szybkiej oceny ogólnych właściwości fizykochemicznych moczu.

Za pomocą wieloparametrowych pasków testowych można ocenić obecność w moczu takich składników, jak: leukocyty, bakterie (azotyny), erytrocyty, białka (albuminy), glukoza, ciała ketonowe (acetooctan), bilirubina, urobilinogen i kwas askorbinowy oraz pH i ciężar właściwy moczu.

W celu wykonania oznaczenia, zanurz wieloparametrowy pasek testowy w próbce moczu na około 30 sekund. Porównując barwy na polach testowych paska z barwną skalą, dokonaj półilościowej analizy poszczególnych parametrów.

Ćwiczenie 6. Oznaczanie stężenia kwasu δ-aminolewulinowego w moczu.

Zasada:

Kwas δ-aminolewulinowy zawarty w moczu reaguje w podwyższonej temperaturze z acetyloacetonem. Powstaje związek pirolowy, który w reakcji z aldehydem p-dimetyloaminobenzoesowym (zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha) w środowisku kwaśnym daje barwny kompleks oznaczany spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 550 nm. Prawidłowe stężenie kwasu δ-aminolewulinowego w moczu wynosi do 10,5 ng/L.

Wykonanie:

Przygotuj 2 probówki. Do pierwszej (próba badana) dodaj 0,5 mL moczu, 1 mL acetyloacetonu oraz 3,5 mL buforu octanowego o pH 4,6. Do drugiej probówki (próba ślepa) dodaj 0,5 mL moczu i 4,5 mL buforu octanowego (pH 4,6). Obie probówki wymieszaj, zakorkuj, wstaw do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut, a następnie ostudź. Przygotuj kolejne dwie probówki, do których przenieś po 1 mL odpowiednio próby badanej i próby ślepej. Następnie dodaj do tych probówek po 1 mL zmodyfikowanego odczynnika Ehrlicha, wymieszaj i odstaw na 15 minut. Po upływie tego czasu zmierz absorbancję próby badanej względem próby ślepej przy długości fali λ = 550 nm. Na podstawie otrzymanej absorbancji odczytaj z krzywej kalibracyjnej stężenie kwasu δ-aminolewulinowego.

Ćwiczenie 7. Oznaczanie stężenia mocznika w surowicy krwi.

Zasada:

Stężenie mocznika oznacza się przy użyciu metody enzymatycznej - sprzężony test Warburga.

mocznik + 2 H₂O → 2 NH₄⁺ + CO₃^2- E: ureaza

NH₄⁺ + α-ketoglutaran + NADH → L-glutaminian + NAD⁺ + H₂O E: dehydrogenaza glutaminianowa

Wykonanie:

Oznaczenie stężenia mocznika w surowicy krwi wykonaj zgodnie z załączoną instrukcją.

Ćwiczenie 8. Oznaczanie stężenia kreatyniny w surowicy krwi.

Zasada:

Stężenie kreatyniny oznacza się przy użyciu modyfikacji metody Jaffe'go. W wyniku reakcji pikrynianów z kreatyniną w środowisku alkalicznym powstaje pochodna 2,4,6-trinitro-cykloheksadienu o zabarwieniu żółtoczerwonym, którego intensywność jest wprost proporcjonalna do stężenia kreatyniny.

Wykonanie:

Oznaczenie stężenia kreatyniny w surowicy krwi wykonaj zgodnie z załączoną instrukcją.

---