Podstawy biotechnologii żywności

Ćwiczenie 9

Hodowla biomasy komórkowej

Cel doświadczenia: Porównanie przyrostu biomasy komórkowej : glonów, bakterii, grzybów strzępkowych oraz drożdży w hodowli wgłębnej.

Materiał

Sprzęt:

• Kolby o objętości 250ml z odpowiednim podłożem (100ml podłoża),

• Waga techniczna o dokładności do 0,01g

• Waga analityczna o dokładności do 0,000[1]g

• Zlewki na 250ml,

• Szalki Petriego

• Zestaw do sączenia

• Krążki bibuły filtracyjnej o średnicy 90mm

• Komora Thoma

• Komora Fuchs - Rosenthala

• Pipety miarowe jałowe na 1ml i 10ml

• Probówki jałowe zawierające 9ml płynu fizjologicznego

• Mikroskop

Podłoża hodowlane:

1. Podłoże sacharozowe:

• 100 g sacharozy

• 3 g (NH₄)₂SO₄ i

• 1g MgSO₄ x 7 H₂O

• 1 g KH₂PO₄

pH - 6,52

2. Podłoże Knopa

• Ca(NO₃)₂ 0,25g

• MgSO₄ 0,06g

• K₂HPO₄ 0,06g

• KCL lub KNO₃ 0,03g

• Fe₂Cl₆ 1 kropla 1% rozt.

• H₂O 1000 ml

3. Bulion odżywczy

• Pepton bakteriologiczny tryptonowy 5

• Ekstrakt drożdżowy 2,5

• Glukoza 1

• pH 7,2 - 7,4

4. Bulion YGC

• Ekstrakt drożdżowy 5

• Glukoza 20

• Chloramphenikol 0,1 (rozpuszczony w 6ml acetonu)

• pH 6,5 - 6,6

• Sterylizacja 121^OC/15 minut.

Część praktyczna

1. Przeprowadzić obserwacje struktur mikroskopowych następujących organizmów:

1. Pediastrum sp.

2. Bacillus sp.

3. Aspergillus sp.

4. Saccharomyces serevisiae (lub Candida sp.)

1. Oznaczenie liczebności organizmów do produkcji biomasy wyrażone w ilości komórek na 1ml zawiesiny (w 0,9% NaCl) wg schematu 1:

Schemat 1:

Glon	Bakteria	Grzyb strzępkowy	Drożdże
Liczenie organizmów w komorze Fuchs'a - Rosenthala'a	Wyliczenie CFU/1ml metodą z użyciem skali McFarlanda	Liczenie strzępek, zarodników w komorze Thoma	Liczenie komórek w komorze Thoma
Zależnie od liczebności organizmów w pojedynczej komórce komory rozcieńczyć hodowlę, następnie policzyć minimum 100 organizmów	Wykonać pomiar absorbancji hodowli nierozcieńczonej przy A^600nm , jeśli wartość A przekracza 1,5 wykonać rozcieńczenie hodowli	Zależnie od liczebności zarodników, strzępek w pojedynczej komórce komory rozcieńczyć hodowlę, następnie policzyć minimum 100 komórek	Zależnie od liczebności komórek drożdży w pojedynczej komórce komory rozcieńczyć hodowlę, następnie policzyć minimum 100 komórek drożdży ***
Wyliczyć liczbę organizmów w 1 ml hodowli uwzględniając całkowitą objętość komory = 3,2mm^3, liczba wszystkich najmniejszych kwadracików wynosi - 256	Z przygotowanej wcześniej krzywej zależności biomasy [g] od absorbancji A^600nm wyliczy liczbę jednostek tworzących kolonie na 1ml hodowli	Wyliczyć liczbę zarodników, strzępek w 1 ml hodowli uwzględniając całkowitą objętość komory = 0,064mm^3, liczba wszystkich najmniejszych kwadracików wynosi - 256	Wyliczyć liczbę komórek drożdży w 1 ml hodowli uwzględniając całkowitą objętość komory = 0,064mm^3, liczba wszystkich najmniejszych kwadracików wynosi - 256
Podać ilość organizmów (glonów) w 1ml hodowli	Podać ilość komórek bakterii w 1ml hodowli	Podać ilość zarodników, strzępek w 1ml hodowli	Podać ilość komórek drożdży w 1ml hodowli

*** - organizmów przypadku liczenia komórek drożdży można wcześniej wybarwić komórki błękitem metylenowym. Pobrać 1 ml zawiesiny komórek, dodać 1 ml roztworu barwnika, pozostawić na 5 minut. Następnie napełnić komorę Thoma organizmów zliczyć tylko żywe komórki, tj. niezabarwione.

2. Przygotowanie organizmów do zaszczepienie podłoża hodowlanego, schemat 2:

Glon	Bakteria	Grzyb strzępkowy	Drożdże
Podać ilość organizmów (glonów) w 1ml hodowli	Podać ilość komórek bakterii w 1ml hodowli	Podać ilość zarodników, strzępek w 1ml hodowli	Podać ilość komórek drożdży w 1ml hodowli
Porównać liczebność wszystkich organizmów
Uszeregować liczebność poszczególnych organizmów od najmniejszej do największej na 1 ml hodowli
Wykonać szereg 10 krotnych - rozcienczeń (9ml 0,9% NaCl + 1ml zawiesiny komórek) każdego organizmu tak aby uzyskać rząd wielkości organizmu najmniej licznego
1 ml otrzymanej zawiesiny komórek organizmów zaszczepić 100 ml podłoża hodowlanego wg Knopa	1 ml otrzymanej zawiesiny komórek bakterii zaszczepić 100 ml podłoża hodowlanego bulion odżywczy	1 ml otrzymanej zawiesiny zarodników, strzępek zaszczepić 100 ml podłoża hodowlanego sacharozowego	1 ml otrzymanej zawiesiny komórek drożzy zaszczepić 100 ml podłoża hodowlanego bulion YGC
Optymalne warunki hodowli: Naświetlenie Temperatura - pokojowa Czas - 7 dni	Optymalne warunki hodowli: Brak naświetlenia Temperatura - 37°C Czas - 7 dni	Optymalne warunki hodowli: Brak naświetlenia Temperatura - 37°C Czas - 7 dni	Optymalne warunki hodowli: Brak naświetlenia Temperatura - 37°C Natlenianie (mieszanie) Czas - 7 dni

3. Sprawdzenia czystości mikrobiologicznej,

Wyznaczyć ilość komórek drobnoustrojów mogących stanowić zanieczyszczenie prowadzonej hodowli i wyliczyć ich ilość w jednostkach CFU na 1 ml przesączu. W tym celu wykonać posiew mikrobiologiczny metodą Kocha, tarty [0,1 ml hodowli] wg schematu 3:

Organizm produkujący biomasę	Posiew na podłoże: Agar odżywczy + actidion	Posiew na podłoże: YGC
Glon
Bakteria
Grzyb strzępkowy
Drożdże

4. Oznaczenie biomasy komórkowej organizmów testowych

1. Hodowlę glonów i grzybów strzępkowych przesączyć przez zważony i wysuszony do suchej masy sączek bibułowy, suszyć w wagosuszarce w 80°C do suchej masy.

b) Oznaczenie biomasy bakterii metodą turbidymetryczną:

• Wykonać pomiar absorbancji hodowli nierozcieńczonej dla A^540nm

• Jeśli wynik pomiaru A przekracza 1,5 wykonać ponowny pomiar absorbancji ale hodowli rozcieńczonej: 1:1, 1:2, itd.

• Odczytać wynik zależności ilości biomasy [g s.m.] od absorbancji A600nm

3. Hodowlę drożdży odwirować przy 3,5 tys. obrotów na minutę, osad komórek drożdży przenieść ilościowo na zważoną na wadze analitycznej szalkę Petriego, suszyć w 80°C do suchej masy.

Organizm testowy	Sucha masa krążka/szalki [g]	Sucha masa krążka/szalki z biomasą [g]	Sucha biomasa komórkowa drobnoustroju [g s.m.] w 100ml podłoża
Glon
Bakteria
Grzyb
Drożdże

6. Przygotować zestawienie wyników wg schematu (4)

	Ilość wyprodukowanej biomasy [g s.m] / 100 ml podłoża po 7 dniach inkubacji	Czystość mikrobiologiczna hodowli [CFU/100 ml podłoża hodowlanego], czysta/skażona
Organizm nr1 ………………
Organizm nr2 …………………
Organizm nr3 …………………
Organizm nr 4 …………………

W opracowaniu wykorzystano materiały pochodzące z następujących stron;

1.www.witko.com.pl/sklep/60098e7796d1d68c93fe8f873dd216b2,Komory_zliczeniowe_FuchsRosenthala,element.html

2. web/pages/Komora-Thoma-2-r_jpg.

Komora zliczeniowa Fuchs - Rosenthala

Komora zliczeniowa Thoma

---