DNA - RYS HISTORYCZNY

• 1949-1950 - Powstała Reguła Chargaffa - prawidłowość dotycząca składu ilościowego zasad azotowych w dwuniciowym DNA odkryta przez Erwina Chargaffa (1905-2002). Głosi ona, że stosunki adeniny(A) do tyminy (T) oraz cytozyny (C) do guaniny (G) wynoszą zawsze ok. 1:1. Regułę tę można opisać następującymi równaniami:

•  %A/%T = %C/%G = 1

•  %A = %T i %C = %G

• 1956 Arthur Kornberg (1918-2007) odkrył polimerazę DNA. W 1959 r. otrzymał nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny za odkrycie sposobu w jaki cząsteczki DNA są reprodukowane w komórkach bakteryjnych i za odtworzenie (rekonstrukcję) go w warunkach laboratoryjnych. Jest ojcem Rogera Kornberga, który w 2006 otrzymał nagrodę Nobla w dziedzinie chemii "za badania molekularnego mechanizmu transkrypcji w komórkach eukariotycznych”.

DNA - RYS HISTORYCZNY

DNA - RYS HISTORYCZNY

DNA - RYS HISTORYCZNY

• 1957 - F. Crick sformuował Centralny dogmat biologii molekularnej, mówiący, że w procesie transkrypcji DNA zostaje „przepisane” na mRNA. Następnie na podstawie sekwencji mRNA w proceie translacji powstaje białko.

DNA - RYS HISTORYCZNY c.d.

• 1961-1966 - R.W. Holley, H.G. Khorana,H. Matthaei, M.W. Nirenberg - Kod genetyczny.

• W ustawodawstwie polskim w Ustawie z dnia 29 sierpnia 1997 r. o ochronie danych osobowych, (tekst jednolity: Dz. U. 2002 r. Nr 101 poz. 926, ze zm.), zawarto informację, że informacje o kodzie genetycznym są objęte ochroną jako dane szczególnej wrażliwości

• 1983 - K. Mullis - pierwszy raz opisał wynaleziona przez siebie reakcję łańcuchową polimerazy (PCR)

• 1990 - powołano The International Human Genome Sequencing Consortium - początek projektu poznania genomu człowieka

• 2001 - Celera, NIH (Narodowy Instytut Zdrowia) - opublikowano sekwencję nukleotydową genomu człowieka

TTTAGAGCGCGGGCGCTCGCGTTTAGGAATTGCTTTGGATATATAGAGAGAGAGGGAAGTTTTTCGCGCGCGCTCCGGATAGAGAGATGCTCGGGTTCGCTCTCGCGCGCTCGGAAAAAGAGAGATCTTCGCGCTCTTTTTAAAGGCGCGCTCTCGCGCGCTCGGAGAGATATATATCTCTCCACACATCGCTCGCTACACAGAGAAAAAAGATCGCGCTCTCTCTCTGAGAGAGAGCACAAGAGATATATACACGACACACGATATATATTTCTCGCGCGCTCGCTCGGAGACAGCTCCCCCCCCGCTGACCGTAGCGTACACAGCTCGCACAGACAGTCGCTGAGACAGTCGTGATAACGGGAGATAGGGGTTTAGATAGG

(Mały fragmernt chromosomu 21)

Co daje nam znajomość genomu?

• sama sekwencja nie daje nam zrozumienia jak funkcjonują komórki - ale niezwykle cennym narzędziem w badaniach

• sekwencja nie jest lekarstwem na choroby - ale bardzo pomaga w zrozumieniu podłoża chorób i opracowywaniu nowych terapii

STRUKTURA LUDZKIEGO GENOMU

• 3 274 571 503 pz

• ~ 2% to sekwencje kodujące

• 21 911 genów kodujących białka

• 8 483 genów kodujących RNA

• 12 599 pseudogenów

• ~ 98% to sekwencje niekodujące

• introny oraz sekwencje międzygenowe

• 23 326 320 SNPs (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu)

• ~ 8 400 regionów CNV (Copy Number Variation) (duplikacje lub delecje odcinków DNA o długości >500 zasad)

STRUKTURA LUDZKIEGO GENOMU

Co może być „źródłem” DNA do badań diagnostycznych?

• Każda komórka jądrzasta pochodząca np. z:

Ogólna procedura izolacji DNA

Etapy izolacji DNA

• Wstępne przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA

W zależności od rodzaju, jak i pochodzenia materiału, wstępne przygotowanie może obejmować oczyszczenie z różnego rodzaju zanieczyszczeń zewnętrznych, pożywki i pozostałości innych komórek, rozdrobnienie i homogenizację, a następnie zawieszenie jednolitej masy komórkowej w odpowiednim buforze.

Etapy izolacji DNA

2. Dezintegracja i liza komórek

Dezintegracje komórek prowadzi się w zależności od rodzaju komórek i tkanek, np. - poprzez homogenizację (miękkie tkanki zwierzęce),

- sonifikację (zawiesiny komórek),

- rozcieranie (komórki roślinne, bakteryjne),

- lizę detergentami (komórki z hodowli komórkowej),

- lizę enzymatyczną (komórki bakteryjne, drożdżowe).

Destrukcji błon zewnętrznych towarzyszy uwolnienie DNA oraz innych komponentów wewnątrzkomórkowych do roztworu.

Etapy izolacji DNA

3. Inaktywacja nukleaz komórkowych w celu zabezpieczenie DNA przed enzymami nukleolitycznymi

Uwalniajacy się z komórki kwas nulkeinowy narażony jest na degradujace działanie nukleaz - enzymów katalizujacych hydrolizę 1- i 2-niciowych kwasów nukleinowych (endo -, egzo -, detoksy -, rybonukleazy i in.), przecinających wiązania fosfodiestrowe. Unieczynnienie ich prowadzi się silnymi enzymami proteolitycznymi (np. proteinazą K).

Etapy izolacji DNA

4. Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów komórkowych

Celem zniesienia oddziaływań jonowych pomiędzy naładowanymi dodatnio histonami i innymi białkami a ujemnie naładowanym szkieletem DNA stosuje się różnego rodzaju detergenty oraz sole, m.in.: sól sodową siarczanu dodecylu (SDS). Wiąże się ona z białkami i nadaje im silnie anionowy charakter, a także działa jako czynnik denaturujący deoksyrybonukleazy i inne białka. Łagodnie alkaliczne środowisko (pH=8,0) zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy DNA a zasadowymi histonami i polikationowymi aminami.

Etapy izolacji DNA

Całkowite odbiałczanie roztworu, przed wytrąceniem DNA, przeprowadza się poprzez ekstrakcje rozpuszczalnikami organicznymi, np. działaniem mieszaniny:

- fenolu (powoduje denaturację białek),

- chloroformu (powoduje powierzchniową denaturację białek i stabilizuje granicę fazowa, gdzie koncentruje się białko)

- alkoholu izoamylowego (zapobiega parowaniu chloroformu), a następnie odwirowanie.

Etapy izolacji DNA

5. Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych celem uzyskanie roztworu DNA o pożądanej czystości i gęstości

Po ekstrakcji kwasy nukleinowe znajdują się w fazie wodnej, zanieczyszczonej małocząsteczkowymi związkami. Dodając rozpuszczalnik organiczny (np. etanol lub izopropanol) zmniejsza się polarność środowiska, co powoduje zmniejszenie rozpuszczalności DNA, posiadającego strukturę jonową i DNA tworzy nitkowate osady, które można zebrać przez odwirowanie.

Efektywność wytrącania kwasów nukleinowych zwiększa się poprzez dodatek soli (np. NaCl, CH₃COOH, LiCl, MgCl, CH₃COONH₄).

• Po wytrąceniu i przemyciu 70% etanolem, DNA pozostawia się do wyschnięcia i następnie zawiesza w małej objętości buforu o niskiej sile jonowej (np. bufor TE) lub w wodzie.

Standardowe metody izolacji DNA:

• izolacja DNA metodą ekstrakcja fenolowej,

• izolacja DNA z pełnej krwi z użyciem nadchloranu sodowego zamiast fenolu,

• izolacja DNA metodą odsalania białek,

• izolacja DNA z pełnej krwi metodą z użyciem Igepalu,

• izolacja DNA za pomocą kolumienek,

• Izolacja DNA automatyczna

Izolowanie DNA metodą ekstrakcja fenolowej

Przygotowanie materiału:

- tkankę stałą rozdrobnić i homogenizować w homogenizatorze nożowym w temp. 0°C,

- krew pobraną na antykoagulant odwirować, usunąć supernatant, zebrać warstwę interfazową zawierającą krwinki białe, przenieść ją do świeżej probówki i zwirować. Ponownie zebrać warstwę interfazową.

Izolowanie DNA metodą ekstrakcja fenolowej cd.

Ekstrakcja DNA:

1. Do probówki zawierającej rozdrobnioną tkankę stałą lub zawiesinę interfazową dodać bufor ekstrakcyjny (EDTA, Tris/HCl, SDS).

2. Dodać proteinazę K i mieszać przez powolne obracanie probówki a następnie inkubować w 55°C przez 12 godzin.

3. Dodać mieszaninę fenol/chloroform/alkohol izoamylowy.

4. Mieszać łagodnie zawartość probówki do chwili powstania emulsji a następnie zwirować.

- polarne grupy fosforowe szkieletu cukrowo-fosforowego DNA promują umiejscowienie DNA w fazie wodnej,

- hydrofobowe lipidy umiejscawiają się w fazie organicznej,

- białka tworzą interfazę na styku faz: organicznej i wodnej.

Izolowanie DNA metodą ekstrakcja fenolowej cd.

5. Przenieść fazę wodną do czystej probówki.

6. Dodać etanol lub izopropanol i umieścić na lodzie na 30 min.

7. Odwirować i usunąć supernatant z probówki.

8. Dodać roztwór etanolu i mieszać przez łagodne obracanie probówki. Odwirować.

9. Usunąć supernatant z probówki i przepłukać DNA.

10. Suszyć osad DNA.

11. Rozpuścić osad DNA.

Izolowanie DNA z pełnej krwi z użyciem nadchloranu sodowego zamiast fenolu

1. Do krwi pobranej na antykoagulant dodać bufor do lizy komórek (sacharoza, Tris/HCl, MgCl₂, Triton X-100) i inkubować w lodzie przez 10 min. Odwirować.

2. Otrzymany osad jader komórkowych zawiesić w buforze do lizy jąder (NaCl, EDTA,Tris/HCl).

3. Dodać roztwór RNazy i inkubować w 37°C przez 30 min.

4. Dodać SDS i inkubować w 60 °C przez 10 min.

5. Po inkubacji dodać NaClO₄ i delikatnie zamieszać.

Izolowanie DNA z pełnej krwi z użyciem nadchloranu sodowego zamiast fenolu cd.

6. Wprowadzić mieszaninę chloroform/alkohol izoamylowy i ekstrahować DNA pod wyciągiem przez 30 min. Odwirować.

7. Przenieść fazę wodną do czystej probówki.

8. Wytrącić DNA alkoholem etylowym i przepłukać DNA.

9. Suszyć osad DNA.

10. Rozpuścić osad DNA.

Izolacja DNA na kolumienkach

Automatyczna izolacja kwasów nukleinowych

• Obecnie na rynku dostępne są m.in.:

• NucliSens easyMag (BioMerieux)

• QIAcube, QIQsymphony AS, QIAxtractor EZ1 Advanced (Qiagen)

• MagNA Pure Compact (Roche)

Automatyczna izolacja kwasów nukleinowych

• W aparacie NucliSens easyMag wykorzystano metodę izolacji opracowaną przez Booma i wsp. opisaną w 1990 roku. Dwie substancje mają kluczowe znaczenie: tiocyjanian guanidyny (GuSCN) oraz krzemionka. Pierwszy związek był wcześniej znany jako bardzo efektywny czynnik do oczyszczania DNA i RNA ze względu na wysoki potencjał lityczny komórek oraz skuteczność inaktywacji nukleaz.

• W wypadku krzemionki pewne było, że wykazuje ona znaczne powinowactwo do kwasów nukleinowych, a jej dodatkową zaletą jest powszechność występowania. Boom i wsp. wykazali, że połączenie właściwości tych dwóch substancji w jednej metodzie umożliwia szybkie oczyszczenie z ludzkiej surowicy lub moczu kolistego dwuniciowego DNA liniowego dwuniciowego DNA, jednoniciowego DNA oraz rRNA. W ten sposob, w krotkim czasie, jednocześnie izolowano zarowno DNA, jak i RNA. Wydajność procedury była wysoka i pozwalała odzyskać dużą ilość kwasow nukleinowych. Wyizolowane RNA nie było zdegradowane, charakteryzowało się wysoką czystością i nadawało się do dalszej obrobki enzymatycznej.

Automatyczna izolacja kwasów nukleinowych

Automatyczna izolacja kwasów nukleinowych

• Standardowa procedura izolacji DNA/RNA z 8-24 próbek trwa około 45 minut, licząc od momentu wstawienia materiału biologicznego do aparatu. Musi być poprzedzona 15-minutowym etapem przygotowawczym oraz zakończona przeniesieniem eluatu zawierającego kwasy nukleinowe do czystej probówki. Można przyjąć, że, stosując procedurę standardową, w ciągu godziny możliwe jest uzyskanie eluatu kwasów nukleinowych nawet z 24 próbek (czyli 192 próbki w ciągu 8 godzinnego dnia pracy).

Automatyczna izolacja kwasów nukleinowych

• Porównano wyniki badań próbek kontrolnych (Program Zewnętrznej Kontroli Jakości Diagnostyki Molekularnej [Quality Control for Molecular Diagnostics] Glasgow, Szkocja 2009 rok) metodą real-time PCR (polymerase chain reaction) poprzedzoną izolacją DNA wykonaną automatycznym ekstraktorem NucliSens easyMag oraz metodą manualną z zastosowaniem kolumienek z membraną krzemionkową (NucleoSpin Blood Kit, Macherey-Nagel); DNA wirusów CMV oraz Parvo B19 (B19V) izolowano obiema metodami z tych samych próbek, a następnie amplifikowano odpowiednią metodą real-time PCR. W wypadku DNA B19V, gdy używano procedury automatycznej, sygnał fluorescencji pojawiał się wcześniej. Świadczy to o podobnej efektywności obu systemów izolacji pozwalającej uzyskać podobną czułość detekcji, z niewielką przewagą procedury automatycznej.

Obliczanie stężenia i stopnia czystości DNA

• Stężenie DNA można określić poprzez pomiar absorpcji światła UV.

• Kwasy nukleinowe jak również produkty ich metabolizmu pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie fal o długości 250-280 nm:

- adenina pochłania promienie o długości 265,5 nm,

- guanina - 249 nm,

- tymina - 265 nm,

- cytozyna - 276 nm.

• Maksimum pochłaniania dla DNA występuje przy ok. 260 nm a minimum przy ok. 230 i 290 nm.

Obliczanie stężenia i stopnia czystości DNA cd.

• Stężenie dwuniciowego DNA oblicza się wg wzoru:

C(μg/ml)= A260 x 50 x rozcieńczenie (R)

1 OD (jednostka optyczna) dla dwuniciowego DNA=50

• Absorpcja przy 260 nm jest równa 1 w przypadku dwuniciowego DNA o stężeniu 50 μg/ml oraz dla jednoniciowego DNA o stężeniu 33 μg/ml.

Obliczanie stężenia i stopnia czystości DNA cd.

• Najczęściej DNA po izolacji jest zanieczyszczone białkami, które pochłaniają promieniowanie w paśmie 280 nm.

• Stosunek wartości absorpcji A260 do A280 świadczy o stopniu czystości preparatów kwasów nukleinowych:

- wartość współczynnika A260/A280 między 1.7 - 2.0 oznacza, że preparaty są wystarczająco oczyszczone,

- wartość równa 1.5 oznacza, że w mierzonym preparacie jest 50% DNA i 50% białka.

Ocena jakości DNA

• Jedną z głównych technik służącą do identyfikacji i oceny jakości kwasów nukleinowych jest elektrofoereza, czyli ruch naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym.

• Elektroforeza może odbywać się w roztworze lub na nośnikach takich jak bibuła lub żele:

- krzemionkowy

- dekstranowy

- agarowy

- skrobiowy

- agarozowy

- poliakrylamidowy

Ocena jakości DNA cd.

Elektroforeza w żelu agarozowym:

Zakres rozdziału żeli agarozowych o różnych stężeniach.

Ocena jakości DNA cd.

• Kwasy nukleinowe wykazują zdolność reagowania ze związkami fluoryzującymi, co wykorzystuje się m.in. Do wybarwiania żeli elektroforetycznych.

• Do tych celów wykorzystuje się związki interkalujące t.j.:

- bromek etydyny,

- oranż akrydynowy,

- pironina Y,

- jodek propidyny.

• Wysokocząsteczkowe genomowe DNA powinno być widoczne na obrazie elektroforetycznym jako pojedynczy, jasny prążek. Jeśli prążek jest rozmyty i widoczna jest jasna smuga świadczy to o degradacji cząsteczki DNA.

Ocena jakości DNA cd.

Mutacje DNA

• Mutacja (łac. mutatio - zmiana) - nagłe, skokowe zmiany w sekwencji nukleotydowej.

• Przyczyny mutacji:

- mutacje spontaniczne powstałe w trakcie replikacji (polimeraza DNA syntetyzuje nową nić z prędkością ok. 1000 wiązań na sekundę, korekta błędów następuje dzięki aktywności egzonukleazowej w kierunku 3'→5'). U E.coli „potrafi” syntetyzować nić DNA z częstością błędów tylko 1 na 10⁷ dodawanych nukleotydów. Błędy te nie sa rozdzielone równomiernie między dwie cząsteczki potomne. Produkt replikacji nici opóźnionej jest narażony na ok. 20 razy więcej błędów, niż cząsteczka pochodząca z nici prowadzącej. Taka asymetria może wskazywać na o, że polimeraza DNA I, która bierze udział w replikacji nici opóźionej ma mniej skuteczne mechanizmy korekcji błędów niż polimeraza DNA III będąca głównym enzymem replikacyjnym.

Mutacje DNA

Mutacje DNA

• Nie wszystkie spośród błędów pojawiających się podczas syntezy DNA można przypisać polimerazom: niekiedy błąd występuje mimo, że polimeraza dodała właściwy nukleotyd - taki, który jest komplementarny do matrycy.

• Dzieje się tak, ponieważ każda zasada azotowa nukloetydu może występować w postaci jednego z dwóch tautomerów, czyli izomerów strukturalnych pozostających w stanie równowagi dynamicznej.

• Na przykład tymina występuje w postaci dwóch tautomerów - formy keonowej i enolowej, przy czym pojedyncze cząsteczki przechodzą niekiedy z jednej formy w drugą. Równowaga jest silnie przesunięta w stronę formy ketonowej.

• Jeśli w trakcie replikacji na nowo syntetyzowanej nici pojawi się forma enolowa tyminy, to doprowadzi to do „błędu”, ponieważ enol-tymina jest koplementarna z G, a nie z A

• Ten sam problem może wystąpić w przypadku adeniny, gdyż rzadki tautomer iminowy tej zasady najsilniej wiąże się w parę z C, oraz guaniny ponieważ enol-guanina jest komplementarna do tyminy

Mutacje DNA

Mutacje DNA

• Mutacje są również wywoływane przez mutageny chemiczne i fizyczne. (Mutagen to czynnik fizyczny lub chemiczny powodujący mutację)

Mutacje DNA

• Mutageny wywołują mutacje trzema różnym sposobami:

- Niektóre działają jako analogi zasad i są mylnie wykorzystywane jako substraty podczas syntezy nowego DNA podczas replikacji

- Niektóre reagują bezpośrednio z DNA wywołując zmiany strukturalne, które prowadzą do błędnego kopiowania nici matrycowej podczas replikacji DNA.

- Niektóre mutageny działają na DNA pośrednio. Nie wpływają same na strukturę DNA, lecz zamiast tego powodują wytwarzanie w komórce związków chemicznych takich jak nadtlenki, które mają bezpośrednie działanie mutagenne.

Mutacje DNA

• Czynniki deaminujące takie jak kwas azotawy powodują usunięcie grupy aminowej z adeniny, guaniny i cytozyny (tymina nie zawiera grupy aminowej).

• Deaminacja guaniny nie jest mutagenna ponieważ powstająca zasada - ksantyna blokuje replikacje

• Deaminacja adeniny daje hipoksantyne, która tworzy pary z C zamiast z T

• Deaminacja cytozyny daje uracyl, który tworzy pary z A zamiast z C

• Deaminacja adeniny oraz cytozyny powoduje powstanie mutacji punktowych

Mutacje DNA

• Mutageny fizyczne:

- Promieniowanie nadfioletowe (UV) indukuje dimeryzację sąsiadujących ze sobą zasad. Dimeryzacja wywołana przez UV z reguły powoduje delecję podczas kopiowania zmodyfikowanej nici

- Promieniowanie jonizujące wywiera różny wpływ na DNA zależnie od rodzaju i natężenia. Mogą wystąpić mutacje punktowe, delecje, insercje. Niektóre rodzaje promieniowania jonizującego działają bezpośrednio na DNA inne mają pośredni wpływ poprze stymulację powstawania w komórce aktywnych cząsteczek takich jak nadtlenki.

Skutki mutacji

• Mutacje ciche - zmiana sekwencji nukleotydowej w sekwencji nie kodującej, zatem 98% ludzkiego genomu może ulec mutacji bez znaczącego efektu (czy aby na pewno?)

• Mutacje punktowe w rejonach kodujących zmieniające sekwencje trinukleotydowego kodonu mogą wywołać następujące efekty:

- mutacje synonimiczna gdy nowy kodon koduje ten sam aminokwas co kodon niezmutowany

- mutacja niesynonimiczna (mutacja zmiany sensu) - mutacja powoduje, że zmutowany kodon koduje inny aminokwas niż kodon nie zmutowany. Jaki może to mieć wpływ na białko?

- mutacje nonsens - mutacja powoduje powstanie kodonu STOP (UAA, UAG, UGA). Wpływ na białko?

- mutacje zmieniające kodon STOP na kodon odpowiadający za syntezę danego aminokwasu

• Mutacje dynamiczne - mutacje polegające na zwielokrotnieniu trójek nukleotydowych w sekwencji genu (np. w chorobie Huntingtona liczba powtórzeń motywu CAG zwiększa się od 36 do 121. U osób zdrowych liczba powtórzeń wynosi od 10 do 35)

Skutki mutacji

---