MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA

WYKŁAD 29.04.2010

Większość szczepów przemysłowych to szczepy ulepszone.

Najczęściej stosowanym zabiegiem są modyfikacje genotypu szczepów doskonalące ich cechy technologiczne poprzez poprawienie ich ukierunkowanej wydajności metabolicznej (zmiany metaboliczno-fizjologiczne).

Dokonuje się tego na drodze mutagenizacji i selekcji mutantów oraz rekombinacji genetycznych (fuzji protoplastów, klonowania genów).

W procedurze tej uwzględnia się oba typy zmienności mikroorganizmów:

• genotypową

• fenotypową

Mutacja – nagłe pojawienie się komórki o zmienionym (nowym) genotypie, zdolnej do przekazywania zmienionych cech swemu potomstwu.

Forma o zmienionym genotypie to mutant, jego powstanie (związane z tym zmiany w genotypie) to mutacja, a proces prowadzący do mutacji to mutageneza.

Mutacja może się wiązać z nabyciem nowej cechy (np. oporność na antybiotyki) lub utratą wcześniej posiadanej (utrata zdolności produkcji jakiegoś enzymu, co wiąże się z utratą pewnych zdolności metabolicznych).

Powstające zmiany fenotypowe wynikają z modyfikacji genotypu w pierwszorzędowej strukturze DNA.

Mutacje dzielimy na:

1. Spontaniczne – częstość mniejsza niż 10^-5, w przypadku niekorzystnych zmian mogą stanowić poważny problem technologiczny, zwłaszcza w hodowlach ciągłych, możliwość ich wystąpienia zmusza do ciągłej reselekcji szczepów (mutacje spontaniczne mogą prowadzić do tzw. rewersji mutacji, którą otrzymaliśmy wcześniej)

2. Indukowane – wywoływane czynnikami zewnętrznymi

Szczepu słabo podatne na mutacje spontaniczne, a bardziej podatne na indywidualne są pożądane w biotechnologii.

Mutacje indukowane – mutacje indukowane czynnikami mutagennymi (zwiększającymi ich częstotliwość od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy), powstałe mutanty to mutanty indukowane

Rodzaje mutacji indukowanych:

- mutacje punktowe:

• Tranzycja (puryna na purynę, pirymidyna na pirymidynę)

• Transwersja (puryna na pirymidynę, pirymidyna na purynę)

• Delecje i insercja prowadzące do przesunięcia ramki odczytu (ang. frame shift)

(kod genetyczny jest zdegenerowany, pozycja tolerancji – trzecia zasada w kodonie jest zmienna)

Czynniki mutagenne:

• Analogi zasad:

  - 5-bromouracyl (BU) – zastępuje tyminę i tworzy parę z guanidyną

  - 2–aminopuryna (AP) – zastępuje adeninę i tworzy parę z cytozyną

• Kwas azotowy – deaminacja zasad azotowych, przekrzyżowanie nici

• Hydroksyloamina – hydroksylacja cytozyny

• Etylometanosulfonian – alkilacja puryn, tranzycja

• N-metylo-N’-nitro-N-nitroguanina (MNNG) – czynnik etylujący, synteza metyloguaniny podczas replikacji, tranzycie i inne typy mutacji

• Oranż akrydyny – mutacje zmieniające ramkę odczyty powodowane interkalacją

• Promieniowanie UV ( λ = 254 – 265 nm) – dimery pirymidyny (dimery tyminy albo tymina z cytozyną), błędy w replikacji, dodatkowo może zachodzić hydroksylacja zasad pirymidynowych i sieciowanie dsDNA

• Promieniowanie X ( λ = 5 nm) – pęknięcie jedno i dwuniciowego DNA, aberracje chromosomalne

Brak jednoznacznej korelacji pomiędzy miejscem i rodzajem wywołanej mutacji DNA, a typem otrzymanego mutanta i ostatecznym efektem fizjologicznym mutacji uzasadnia stosowanie wielokrotnej mutagenizacji i różnych mutagenów.

Optymalizacja polega na:

• doborze odpowiedniego rodzaju i dawki mutagenów

• umiejscowieniu czasu ich działania w określonej fazie replikacji DNA

• opracowanie kryteriów najbardziej efektywnej selekcji pożądanych mutantów

Dlaczego UV?

• Ogólna dostępność i łatwość użycia

• Łatwość dozowania dawek poprzez dobór odpowiedniej mocy lampy, czasu działania i odległości od naświetlanego obiektu

• Łatwość odtwarzania warunków mutegenizacji

• Przewaga efektu mutacyjnego nad letalnym

• Możliwość uzyskania wszystkich typów mutantów

• Możliwość wywołania mutacji w komórkach wegetatywnych i spoczynkowych (np. sporach)

W hodowlach zsynchronizowanych MNNG zastosowane w odpowiedniej fazie replikacji DNA pozwala na kontrolowanie procesu mutagenezy w określonym regionie genomu, ponieważ:

• Wywołuje mutacje punktowe dotyczące pojedynczych genów

• Maksymalna efektywność działania podczas replikacji DNA

• Często powstają mutacje równoczesne skupione w jednym regionie DNA

Materiał poddawany mutagenizacji:

1. Najlepiej pojedyncze, jednojądrowe komórki haploidalne

2. Promieniowce i grzyby – najlepiej spory (komórki o grubej ścianie, formy przetrwalnikowe), przy braku sporulacji fragmenty mechaniczne rozdrobnionej grzybni wegetatywnej

Efektywność mutagenizacji zależy od:

1. Rodzaju i stężenia użytego czynnika

2. Fazy rozwoju komórki

3. Warunków hodowli przed mutagenizacją jak i w trakcie jej trwania

Etapy mutagenizacji:

1. penetracja mutagenu do komórki

2. oddziaływanie na DNA wywołujące niestabilne zmiany pierwotne

3. naprawa uszkodzeń pierwotnych z możliwością zajścia trwałych zmian wtórnych w DNA

4. stabilizacja mutacji, powodująca utrzymanie się zmian w kolejnych pokoleniach komórek

5. zmiany biochemiczne w komórce i fenotypowe ujawnienie się mutacji

Wg A. Chmiel „Biotechnologia” PWN

W pozyskiwaniu szczepów przemysłowych najbardziej przydatne są szczepu wykazujące dużą podatność na mutagenezę indukowaną ( prowadzącą do ich ulepszenia ), a równocześnie mało podatne na mutacje spontaniczne, co warunkuje ich dużą stabilność genetyczną.

Etapy selekcji mutantów:

1. wstępne testy – eliminacja szczepów mało przydatnych

2. dokładniejsza charakterystyka szczepów wyselekcjonowanych w etapie I.

3. dobór optymalnych warunków hodowli i procesu najlepszych szczepów wyselekcjonowanych w etapach poprzednich

W technologiach przemysłowych procesy selekcyjne są cykliczne. Szczepy już stosowane, sprawdzone w warunkach przemysłowych, stanowią bazę do pozyskiwania lepszych ich wariantów.