SKŁAD I WŁAŚCIWOŚCI SOKÓW TRAWIENNYCH -

OKREŚLANIE OPTYMALNYCH WARUNKÓW TRAWIENIA SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH

Celem ćwiczeń jest

• zbadanie składu i właściwości soków trawiennych: śliny, sokużołądkowego, soku trzustkowego i żółci

• określenie roli enzymów przewodu pokarmowego w trawieniu składników pokarmowych, oraz

• określenie optymalnych warunków środowiska dla przebiegu enzymatycznego rozkładu składników pokarmowych

Zakres ćwiczeń obejmuje:

• wykazanie obecności enzymów trawiennych w ślinie, soku żołądkowym i soku trzustkowym

• zbadanie etapów trawienia węglowodanów złożonych, wpływu temperatury na aktywność amylazy ślinowej i amylazy trzustkowej

• określenie wpływu formy substratu (denaturacji białka) i pH środowiska na aktywność pepsyny i trypsyny

• zbadanie działania emulgującego żółci

Ćwiczenie należy wykonać zgodnie z poniższym schematem:

	grupa 1	grupa 2	grupa 3	grupa 4
	ŚLINA
	wykrywanie obecności i badanie właściwości α- AMYLAZY ŚLINOWEJ
etapy trawienia skrobi	X
wpływ temperatury na aktywność α-amylazy ślinowej	X
	SOK ŻOŁĄDKOWY
	wpływ formy substratu i pH na aktywność PEPSYNY
białko natywne		X
białko zdenaturowane		X
	SOK TRZUSTKOWY
	wpływ formy substratu i pH na aktywność TRYPSYNY
białko natywne			X
białko zdenaturowane			X
	wykrywanie obecności i badanie właściwości α- AMYLAZY TRZUSTKOWEJ
etapy trawienia skrobi				X
wpływ temperatury na aktywność α-amylazy trzustkowej				X
	wykrywanie obecności LIPAZY
	X			X
	ŻÓŁĆ
	badanie emulgującego działania żółci
badanie emulgującego działania żółci		X	X

• X zaznaczone są ćwiczenia wykonywane przez daną podgrupę:

• ĆWICZENIA, W KTÓRYCH OZNACZANA BĘDZIE AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW AMYLOLITYCZNYCH: Α-AMYLAZY ŚLINOWEJ I Α-AMYLAZY TRZUSTKOWEJ ORAZ PEPSYNY I TRYPSYNY BĘDĄ WYKONYWANE TAKIMI SAMYMI METODAMI, DLATEGO ICH METODYKA ZOSTAŁA OPISANA ŁĄCZNIE.

ENZYMY AMYLOLITYCZNE: ŚLINA/SOK TRZUSTKOWY: α-amylaza ślinowa/ α-amylaza trzustkowa

Otrzymywanie śliny

Materiał: woda destylowana, zlewka

Wykonanie: Aby otrzymać roztwór śliny, należy po wypłukaniu jamy ustnej, nabierać do ust małe porcje ciepłej (ok. 40^oC) wody i po 2 minutach opłukiwania jamy ustnej zbierać ślinę w zlewce. Czynność tę należy powtórzyć kilkakrotnie. Część zebranej śliny (ok. 20 ml) należy przelać do drugiej zlewki (opisanej: „ślina przegotowana”) i zagotować na płytce grzejnej.

Wykrywanie obecności enzymów amylolitycznych w ślinie/soku trzustkowym - etapy trawienia skrobi

Materiał: roztwór śliny/sok trzustkowy (nieprzegotowane), 1% roztwór skrobi (w buforze o pH=6.6 (w przypadku śliny) lub 7.6 (w przypadku soku trzustkowego)), płyn Lugola (roztwór jodu w jodku potasu), probówka szklana, płytka porcelanowa, pipetka plastikowa

Wykonanie: Do szklanej probówki odmierzyć 4 ml roztworu skrobi. Probówkę wstawić do łaźni wodnej o temp. 37^oC na ok. 3 minuty. W tym czasie umieścić kroplę roztworu skrobi w pierwszym zagłębieniu płytki porcelanowej i dodać 2 krople płynu Lugola. Po wyrównaniu temperatur do probówki ze skrobią dodać 2 ml roztworu śliny/soku trzustkowego. Roztwory NATYCHMIAST wymieszać i NATYCHMIAST po wymieszaniu przenieść pipetką kroplę mieszaniny do drugego zagłębienia w płytce porcelanowej, w którym uprzednio umieszczone zostały 2 krople płynu Lugola. Probówkę umieścić ponownie w łaźni wodnej. Co 30 sekund od pobrania pierwszej próbki mieszaniny trawiennej przenosić kolejne próbki mieszaniny do kolejnych zagłębień w płytce zawierających płyn Lugola (umieszczony tam tuż przed dodaniem mieszaniny trawiennej).

Należy obserwować zmieniające się zabarwienie pochodzące od barwnych produktów reakcji z jodem nierozłożonej skrobi oraz pośrednich produktów jej enzymatycznego rozkładu (dekstryn o różnej długości łańcucha tj. od 12-14 do 3 cząsteczek glukozy). Wyznaczyć punkt achromowy - czas, po jakim doszło do całkowitego rozłożenia skrobi, o czym świadczy brak barwnej reakcji (czyli moment uzyskania zabawienia zbliżonego do barwy rozcieńczonego płynu Lugola!). Produkty trawienia skrobi - głównie maltoza, nie tworzą bowiem związków barwnych z jodem.

Zadanie: obserwacje zamieścić w tabelce, zaznaczyć (np. innym kolorem) punkt achromowy:

Tabela nr … Tytuł

czas [s]	zabarwienie	czas [s]	zabarwienie	czas [s]	zabarwienie	czas [s]	zabarwienie	czas [s]	zabarwienie

Wpływ temperatury na aktywność α-amylazy ślinowej/ α-amylazy trzustkowej

Materiał: roztwór śliny/soku trzustkowego (nieprzegotowane i przegotowane), 1% roztwór skrobi (w buforze o pH=6.6 (w przypadku śliny) lub 7.6 (w przypadku soku trzustkowego)), woda destylowana, płyn Lugola (roztwór jodu w jodku potasu), 4 probówki szklane, łaźnia wodna, naczynie z lodem, płyta grzejna

Wykonanie: Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia należy zagotować część zebranej śliny/soku trzustkowego.

Do 3 ponumerowanych szklanych probówek dodać po 2 ml roztworu skrobi i po 1 ml wody, wymieszać. W naczyniu z lodem umieścić probówkę 1 oraz probówkę z ok. 3 ml śliny/soku trzustkowego (nieprzegotowanej/ego). Probówki 2 i 3 umieścić w łaźni wodnej o temp. 37^OC. Po wyrównaniu temperatur (ok. 3 minut), dodać do prób (probówek zawierających skrobię), zgodnie z poniższym schematem, po 2 ml śliny/soku trzustkowego

probówki 1 i 2 - ślina nieprzegotowana lub sok trzustkowy nieprzegotowany (do probówki 1 o temp. 0^oC, do probówki 2 - o temperaturze pokojowej)

probówka 3 - ślina przegotowana lub sok trzustkowy przegotowany

i DOKŁADNIE WYMIESZAĆ zawartość probówek. Probówki umieścić ponownie w łaźni lodowej (probówka 1) lub łaźni wodnej (probówki 2 i 3). Po 10 minutach inkubacji w łaźni lodowej (probówka 1) lub wodnej (probówki 2 i 3) probówki wyjąć, dodać do każdej kilka kropli płynu Lugola i wymieszać.

	Probówka 1	Probówka 2	Probówka 3:
1.	2 ml roztworu skrobi	2 ml roztworu skrobi	2 ml roztworu skrobi
2.	dodać 1 ml wody i wymieszać	dodać 1 ml wody i wymieszać	dodać 1 ml wody i wymieszać
3	umieścić w naczyniu z lodem	umieścić w łaźni wodnej	umieścić w łaźni wodnej
4	dodać 2 ml śliny/soku trzustkowego nieprzegotowanej/ego (wcześniej ochłodzonej/ego do temp. 0^oC) i wymieszać	dodać 2 ml śliny/soku trzustkowego nieprzegotowanej/ego i wymieszać	dodać 2 ml śliny/soku trzustkowego przegotowanej/ego i wymieszać
5	po 10 min. dodać kilka kropli płynu Lugola WYMIESZAĆ	po 10 min. dodać kilka kropli płynu Lugola WYMIESZAĆ	po 10 min. dodać kilka kropli płynu Lugola WYMIESZAĆ

Zadanie: o czym świadczą obserwowane różnice w barwie? Porównując zabarwienie mieszanin reakcyjnych określić optymalną temperaturę działania α-amylazy ślinowej/ α-amylazy trzustkowej.

ENZYMY PROTEOLITYCZNE: SOK ŻOŁĄDKOWY - pepsyna/ SOK TRZUSTKOWY (trypsyna)

Wpływ formy substratu (białko natywne i zdenaturowane) oraz pH na aktywność pepsyny/ trypsyny

Materiał: substrat - 1% roztwór albuminy natywnej (nieprzegotowanej) i 1% roztwór albuminy zdenaturowanej (przegotowanej) w buforze o pH=7.6, sok żołądkowy/ sok trzustkowy, 0.5% roztwór kwasu solnego (HCl) do zakwaszenia środowiska mieszaniny trawiennej, 5% roztwór TCA (kwasu trichlorooctowego) do inaktywacji enzymu i przerwania reakcji enzymatycznej, roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) o stęż. 0.5 mol/dm³ do alkalizacji mieszaniny trawiennej po reakcji, odczynnik Folina-Ciocalteu do oznaczenia stężenia produktów proteolizy, 6 probówki plastikowe, 6 probówek szklanych, łaźnia wodna, wirówka, spektrofotometr

Wykonanie: Do 3 ponumerowanych plastikowych probówek odmierzyć odczynniki według poniższej tabeli ZACHOWUJĄC PODANĄ W TABELI KOLEJNOŚĆ!!:

numer probówki	SOK ŻOŁĄDKOWY/ SOK TRZUSTKOWY	r-r ALBUMINY	HCl	TCA
						natywnej
		ilość: 1 ml	ilość: 1 ml	ilość: 0.25 ml	ilość: 3 ml
		kolejność dodawania odczynników
1 (pH = 7.6)	1	2	-	-
2 (odczyn kwaśny)	1	3	2	-
3 (próba kontrolna)	1	3	-	2

Do kolejnych 3 ponumerowanych plastikowych probówek odmierzyć odczynniki według poniższej tabeli ZACHOWUJĄC PODANĄ W TABELI KOLEJNOŚĆ!!:

numer probówki	SOK ŻOŁĄDKOWY/ SOK TRZUSTKOWY	r-r ALBUMINY	HCl	TCA
						zdenaturowanej
		ilość: 1 ml	ilość: 1 ml	ilość: 0.25 ml	ilość: 3 ml
		kolejność dodawania odczynników
1 (pH = 7.6)	1	2	-	-
2 (odczyn kwaśny)	1	3	2	-
3 (próba kontrolna)	1	3	-	2

Probówki wstawić na 30 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37^oC. Po inkubacji należy przerwać reakcję enzymatyczną, dodając do probówek 1 i 2 po 3 ml TCA. Probówki zatkać korkami i odwirować przez 10 min przy 2500 obrotów/min.

W supernatancie (roztworze znajdującym się nad osadem) należy oznaczyć metodą Lowry'ego stężenie peptydów będących produktami reakcji proteolizy.

Zasada metody polega na zachodzącej w środowisku zasadowym (pH = 10) reakcji redukcji odczynnika Folina- Ciocalteu (zawierającego kwas fosforomolibdenowy) pod wpływem tyrozyny zawartej w uwolnionych peptydach. Powstaje związek o zabarwieniu niebieskim (pochodzącym od tlenków molibdenowych), a natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia produktów proteolizy i tym samym aktywności pepsyny/trypsyny znajdującej się w soku żółądkowym/ soku trzustkowym.

Do szklanych probówek oznaczonych numerami 1, 2, 3 odpipetować po 1 ml supernatantu (UŻYWAJĄC ZA KAŻDYM RAZEM INNEJ KOŃCÓWKI DO PIPETY), dodać po 2 ml 0.5 M roztworu NaOH, a nast. po 0.6 ml odczynnika Folina-Ciocalteu. Po dodaniu odczynnika Folina próby należy NATYCHMIAST wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej. Po upływie 15 minut odczytać absorbancję prób przy λ=750 nm względem próby 3.

Stężenie produktów proteolizy (μmol/l) wyliczyć z wzorów:

Dla próby 1:

stężenie produktów proteolizy = A x 1.67

Dla próby 2:

stężenie produktów proteolizy = A x 1.67 x 1.25

gdzie A - absorbancja próby

1. 67 - współczynnik przeliczeniowy jednostki absorbancji

na jednostkę stężenia produktów proteolizy

1.25 - współczynnik rozcieńczenia próby 2

Zadanie: wyniki zebrać w tabeli i określić optymalny dla działania pepsyny odczyn środowiska :

Tabela nr … Tytuł

	stężenie produktów proteolizy [μmol/l]
próba 1 (środowisko słabo zasadowe)
próba 2 (środowisko kwaśne)

ENZYMY LIPOLITYCZNE - SOK TRZUSTKOWY - lipaza trzustkowa

Wykrywanie obecności lipazy w soku trzustkowym - enzymatyczmna hydroliza tłuszczu mleka

Materiał: mleko (substrat - tłuszcz mleka), sok trzustkowy, wskaźnik pH - fenoloftaleina, 1% roztwór węglanu sodu (Na₂CO₃) do alkalizacji mieszaniny trawiennej, probówka szklana, łaźnia wodna

Wykonanie: Do probówki zawierającej 5 ml mleka należy dodać 2 ml soku trzustkowego, kilka kropli roztworu fenoloftaleiny oraz parę kropli roztworu Na₂CO₃ do uzyskania lekko różowego zabarwienia mieszaniny trawiennej. Probówkę wymieszać.

Probówkę należy wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37^oC i obserwować do momentu zaniku różowej barwy.

Zadanie: o czym świadczy zanik różowego zabarwienia? Co jest dowodem na obecność lipazy w soku trzustkowym?

ŻÓŁĆ - emulgujące działanie żółci:

Materiał: olej, żółć wieprzowa, 1% roztwór kwaśnego węglanu sodu (NaHCO₃), woda, 3 probówki szklane

Wykonanie: Do probówek dodajemy:

Probówka 1	Probówka 2	Probówka 3:
6 ml wody i 2 ml oleju	6 ml NaHCO3i 2 ml oleju	6 ml NaHCO3, 2 ml oleju i 1 ml żółci

Probówki wstrząsamy i oglądamy wygląd warstwy tłuszczowej, zwracając uwagę na stopień emulgacji tłuszczu i trwałość emulsji

Zadanie: czym różni się wygląd warstwy lipidowej w probówce z żółcią od wyglądu warstwy lipidowej w probówkach, do których nie dodano żółci? Na czym polega emulgujące działanie żółci? Jakie ma to znaczenie w procesie trawienia tłuszczu?

Klasyfikacja Enzymów

Enzymy zostały sklasyfikowane przez Międzynarodową Unię Biochemiczną (International Union of Biochemistry) w 1984 roku. Komisja Enzyme Commission przypisała każdemu enzymowi zarekomendowaną nazwę i czteroczęściowy rozróżnialny numer. Numery Enzyme Commission (EC) dzielą wszystkie enzymy na sześć głównych grup ze względu na typ katalizowanej reakcji.

Pierwsza cyfra numeru EC oznacza klasę danego enzymu. Klasy enzymów

EC	KLASA ENZYMÓW	KATALIZOWANE REAKCJE
EC 1	Oksydoreduktazy	Reakcje oksydacyjno-redukcyjne
EC 2	Transferazy	Przenoszenie grup funkcyjnych
EC 3	Hydrolazy	Reakcje hydrolizy
EC 4	Liazy	Enzymy odszczepiające od substratów określoną grupę (niehydrolitycznie) z wytworzeniem podwójnego wiązania lub odwrotnie, przyłączające grupy do podwójnych wiązań
EC 5	Izomerazy	Izomeryzacja
EC 6	Ligazy	Enzymy katalizujące reakcje syntezy, którym towarzyszy odszczepienie reszt kwasu fosforowego od ATP lub analogicznego trójfosforanu

Druga cyfra numeru EC świadczy o podklasie danego enzymu. Podklasy enzymów

EC 3	HYDROLAZY
EC 3.1.	Esterazy - Działają na wiązania estrowe
EC 3.2.	Glikozydazy - Hydrolizują związki glikozydowe
EC 3.3.	Hydrolazy działające na wiązania eterowe
EC 3.4.	Peptydazy - działają na wiązania peptydowe
EC 3.5.	Hydrolazy działające na wiązanie C-N, ale różniące się od peptydowych
EC 3.6.	Enzymy działające na bezwodniki kwasowe
EC 3.7.	Hydrolazy działające na wiązanie C-C
EC 3.8.	Enzymy działające na wiązanie halogenkowe (halogenkowo-alkilowe)
EC 3.9.	Hydrolazy działające na wiązanie P-N
EC 3.10.	Enzymy działające na wiązanie S-N
EC 3.11.	Hydrolazy działające na wiązanie C-P
EC 3.12.	Enzymy działające na wiązanie S-S
EC 3.13.	Hydrolazy działające na wiązanie C-S

Trzecia cyfra numeru EC świadczy o przynależności danego enzymu do podpodklasy. Natomiast czwarta cyfra wskazuje miejsce w podpodklasie enzymów oznaczonych danym numerem klasy, podklasy i podpodklasy np. EC 1.1.1.6 dehydrogenaza glicerolu

---