WYKŁAD NR 13
Retardanty:
Retardanty wzrostu (RTD) są grupą związków, które wpływają hamująco na wzrost roślin, głównie wzrost wydłużeniowy, nie powodując z reguły chorobliwych zniekształceń i innych filotoksycznych efektów gdy są użyte we właściwych dawkach. Wpływ retardantów na rośliny polega głównie na tym, że hamuje wydłużanie międzywęźli. RTD powoduje zwiększenie poziomu cytokinin w roślinach.
Etylen:
W naturalnych warunkach gazowa substancja o szerokim zakresie oddziaływań na rośliny. Stymuluje proces starzenia (przyspiesza dojrzewanie owoców, rzucanie liści), hamuje wydłużanie i podziały komórkowe. Miejsce biosyntezy etylenu jest nieznane.
Obecnie umiemy zablokować biosyntezę etylenu (metodami inżynierii genetycznej lub za pomocą inhibitorów syntezy ACC - synteza kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego - główny enzym cyklu biosyntezy etylenu.
Inhibitorem wzrostu w roślinach jest także kwas salicylowy - związany głównie z reakcjami obronnymi rośliny przed patogenami.
BIOTECHNOLOGIA ROŚLIN (obowiązuje również skrypt)
Zajmuje się praktycznym wykorzystaniem roślinnych kultur in vitro. Kultury in vitro to hodowle wyizolowanych z roślin protoplastów, komórek, tkanek lub organów na odpowiednich, sztucznych podłożach. Mówimy o kulturach in vitro bo hodowle prowadzimy w szkle, hodując tkanki czy komórki odizolowane od organizmu macierzystego.
Dwa odkrycia przyczyniły się do rozwoju technik roślinnych kultur tkankowych (ich początek sięga lat 50 XX wieku). Są to odkrycia zjawiska totipotencji komórek roślinnych i regulatorów wzrostu.
Totipotencja to zdolność pojedynczej somatycznej komórki roślinnej do nieograniczonego dzielenia się i odtwarzania całej rośliny. Początek roślinie może więc dać nie tylko zygota, ale każda komórka somatyczna. W ten sposób w kulturach in vitro istnieje możliwość rekonstrukcji całej rośliny z pojedynczej komórki, a nawet protoplastu. Z faktu totipotencji wynika, że w pojedynczej komórce znajduje się pełna informacja genetyczna niezbędna do zrealizowania całego programu rozwojowego rośliny. Jednakże uruchomienie informacji zależy od wielu czynników. Na zjawisku totipotencji oparta jest biotechnologia roślin.
Drugim kamieniem milowym w rozwoju tej gałęzi naukowej było wykrycie roślinnych regulatorów wzrostu w latach 50 XX wieku.
Regulatory wzrostu (substancje wzrostowe) to związki organiczne, które w bardzo małej ilości pobudzają, hamują lub działają w inny sposób.
Jak otrzymuje się kultury tkankowe i komórkowe?
W celu uzyskania kultury fragment tkanki lub organ roślinny (tzw. eksplantat), czyli materiał roślinny do zapoczątkowania kultury, umieszcza się na sterylną pożywkę. Eksplantatem może być właściwie każdy fragment rośliny. Może on pochodzić z aseptycznie wyhodowanych siewek lub dojrzałej rośliny zebranej ze stanowisk naturalnych lub z uprawy.
Jeżeli taki materiał umieścimy na odpowiedniej pożywce to wtedy na powierzchni eksplantatu (najczęściej w miejscu zranienia) zaczyna się tworzyć niezróżnicowana morfologicznie i histologicznie tkanka zwana kalusem. Tworzenie kalusa związane jest z procesem dedyferencji czyli odróżnicowania, w wyniku którego różne typy tkanek występujące w eksplantacie tracą swoje specyficzne cechy i w hodowli in vitro pojawia się jeden typ tkanki - kalus. Kalus - z komórek miękiszowych, anatomicznie i morfologicznie nie zróżnicowane.
Tkanka kalusowa utworzona na eksplantacie stanowi pierwotną kulturę kalusową. Właściwą kulturę kalusową można otrzymać przez ciągłe pasażowanie tkanki kalusowej na świeżą pożywkę. W takich warunkach wzrost tkanki jest nieograniczony i kulturę można prowadzić przez dowolnie długi okres czasu. Przykładem jest kultura kalusowa zapoczątkowana przez Gathereta w 1939 roku, która jest kontynuowana do chwili obecnej.
Gatheret - po raz pierwszy otrzymał kulturę tkankowa i to ona kontynuowana jest do dzisiaj.
Podstawową zasadą w pracy z kulturami roślinnymi jest zachowanie aseptyki. Wszystkie czynności związane z otrzymywaniem kultury i pasażowaniem należy wykonywać w warunkach sterylnych. Sterylny musi być materiał roślinny służący do zapoczątkowania kultury, a także podłoże, na którym prowadzi się kulturę.
Komórki bakterii i grzybów rosną szybciej i szybciej się dzielą niż tkanka roślinna, dlatego należy zmieniać podłoże aby się nie rozwinęły.
Podłoża stosowane w kulturach in vitro:
Skład ich powinien być tak dobrany, aby zapewniał jak najlepsze warunki dla rozwoju procesów życiowych komórek. Dlatego pożywki zmienia się w zależności od rozwoju kultury.
Istnieje wiele pożywek opracowanych przez różnych badaczy wykorzystywanych w kulturach in vitro różnych roślin. Do najczęściej stosowanych należy pożywka Murashiga i Skoog'a ustalona w 1962 r.
Kultury tkanek kalusowych prowadzi się najczęściej na pożywkach stałych ustalonych agarem (polisacharyd, składnik ścian komórkowych niektórych krasnorostów). Do prawidłowego wzrostu kultur in vitro niezbędne jest zachowanie odpowiednich parametrów fizycznych, takich jak temperatura, wilgotność, oświetlenie. Pożywka zawiera pewne stałe grupy składników, są to:
Sole mineralne (mikro i makroelementy)
Źródło węgla i energii
Witaminy
Regulatory wzrostu
Rodzaje kultur tkankowych:
Kultura kalusowa - otrzymujemy po umieszczeniu eksplantatu na odpowiednim agarowym podłożu, w wyniku dediferencji podziałów komórek eksplantatu.
Kultura zawiesinowa (komórkowa) - otrzymujemy ją po przeniesieniu komórek kalusa do płynnej wstrząsanej pożywki. W tych warunkach występuje rozbicie kalusa na drobne fragmenty, a nawet pojedyncze komórki. Zawiesinę, podobnie jak kulturę kalusowa, trzeba co pewien czas przeszczepiać na świeże podłoże, wtedy wzrost jej jest nieograniczony w czasie. Wytrząsanie zapewnia komórką dostęp tlenu i umożliwia oddychanie. Zawiesina zawiera pojedyncze komórki i ich agregaty.
Długość cyklu wzrostu (od momentu przeszczepienia na świeże podłoże do zakończenia wzrostu na tym podłożu) wynosi zwykle 2-3 tygodnie i zależy od gatunków rośliny i warunków wzrostu. Podczas cyklu wzrost zawiesin wykazuje pewne podobieństwo do wzrostu kultur drobnoustrojów (krzywa wzrostu o kształcie sinusoidalnym).
Fazy:
Faza lag - przygotowanie do podziałów
Faza exponentialna (wykładnicza) - komórki dzielą się bardzo szybko, komórki w zawiesinie drobne, agregaty duże
Faza linear (liniowa) - szybkość wzrostu mniej więcej stała, potem tępo spada
Faza decelaration (wzrostu opóźnionego) - tępo spada, dzielą się, ale głównie wzrost wydłużeniowy
Faza stationary (stacjonarna) - brak podziałów komórkowych, w tej fazie należy przenieść komórki na nowe podłoże, inaczej kultura obumrze na skutek braku składników pokarmowych
Długość cyklu 2-3 tygodnie.
Kultury organów - takie kultury otrzymuje się najczęściej w wyniku organogenezy tkanki kalusowej lub kultury zawiesinowej. Wśród komórek kalusa mogą znajdować się komórki kompletna. Te komórki mogą się w odpowiednich warunkach różnicować, czyli ulegać dyferencji. W wyniku takiej dyferencji może dojść do organogenezy tkanki kalusowej, tj. do powstania z kalusa korzeni, pędów lub całej rośliny. Typ organogenezy, a więc to czy z tkanki kalusowej będą różnicować się pędy czy korzenie, zależy w znacznym stopniu od typu i stężenia regulatorów wzrostu w pożywce. Skoog i Miller w hodowli z tkanką kalusową tytoniu udowodnili, że auksyny stymulują rozwój korzeni, a hamują wzrost pędów. Jeżeli stosunek cytokininy jest większy - na kalusie zaczynają powstawać pąki, a z nich rozwijają się pędy (działają odwrotnie do auksyn).
Jeżeli w pożywce przewaga auksyny - będą powstawać korzenie.
Przewaga cytokininy - powstają pąki, a z nich różnicują się pędy.
Natomiast cytokininy działają stymulująco na rozwój pędów. Ustalenie współzależności między dwoma substancjami wzrostowymi: auksyną i cytokininą umożliwiło sterowanie procesem organogenezy in vitro, co znalazło już znaczenie praktyczne w mikropropagacji.
Kultury transgenicznych organów - przykładem takich kultur są kultury korzeni transformowanych, czyli korzeni o zmienionych cechach genetycznych, co jest wynikiem wbudowania do genomu komórki roślinnej obcego DNA. Wprowadzenie obcego materiału genetycznego to transformacja. Korzenie transformowane otrzymuje się w wyniku transformacji wektorowej, a jako wektorów używa się plazmidów bakterii Agrobacterium rhizogenes.
Jest to bakteria patologiczna dla roślin dwuliściennych i nagonasiennych, wywołująca chorobę włośnikowatości układu korzennego. Plazmidy Agrobacterium (pozachromosomowy kulisty fragment DNA, replikujący autonomiczne bez udziału DNA chromosomowego). Jako kuliste cząsteczki DNA plazmidy są mniej podatne na działanie nukleaz. Plazmid A. rhizogenes zwany jest plazmidem Ri (root inducting plasmid) - pozachromosomowy kulisty DNA, replikujący niezależnie od DNA chromosomowego.
W procesie transformacji fragmentu DNA (tzw. T-DNA, transfer DNA) z plazmidu RI wbudowuje się na trwale do genomu komórki roślinnej. Na tym fragmencie DNA znajdują się różne geny, które ulegają ekspresji w komórkach roślinnych i zmieniają ich metabolizm i prowadzą do tworzenia korzeni włośnikowatych (ze względu na ich wygląd).
Te korzenie różnią się także fenotypowo od korzeni normalnych - ich charakterystyczne cechy to wysoka szybkość wzrostu, brak geotropizmu, plagiotropizmu (rosną właściwie do wektora grawitacji), wysoka liczba odgałęzień i zdolność do wzrostu na podłożach bez regulatorów wzrostu, na T-DNA znajdują się geny odpowiedzialne za biosyntezę auksyn.
Warunkiem powodzenia transformacji jest uszkodzenie tkanki roślinnej, po wniknięciu do rośliny wirulentne agrobakterie przyczepiają się do określonych miejsc ściany komórkowej. Połączenie to zachodzi przy udziale lipopolisacharydów bakteryjnej ściany komórkowej i frakcji kwasu poligalakturonowego ściany komórkowej rośliny. Do przeniesienia fragmentu DNA z plazmidu bakteryjnego do genomu komórki roślinnej konieczne są tzw. vir-geny (geny wirulencji) zlokalizowane na plazmidzie Ri, ale poza obrębem T-DNA. T-DNA zawiera obce prokariotyczne geny, które ulegają ekspresji w komórkach eukariotycznych.
Kultury protoplastów - protoplasty są to komórki pozbawione ściany komórkowej. Ściany komórkowe usuwane są na drodze enzymatycznej komórek z kultury zawiesinowej lub komórek mezofilu liścia, które stanowią materiał wyjściowy dla kultury protoplastów poddaje się działaniu enzymów rozkładających pektyny, celulozę i hemicelulozę.
Zaletą kultury protoplastu jest fakt, że stanowią one (w przeciwieństwie do zawiesin) jednokomórkowe populacje całkowicie oddzielonych od siebie jednostek.
Dla biotechnologii największe znaczenie ma przydatność protoplastów w inżynierii genetycznej. Eksperymenty z protoplastami pozwalają na przeniesieni obcych genów i organelli z komórki do komórki w wyniku zlania się protoplastów dwóch gatunków nie łączących się ze sobą normalnie. Może to prowadzić do uzyskania nowych odmian leczniczych, uprawnych i ozdobnych.
WYKORZYSTANIE BIOTECHNOLOGII
Biotechnologia roślin obejmuje kilka kierunków badań:
Mikrorozmnażanie czyli rozmnażanie roślin metodą in vitro.
Biosyntezę i biotransformację związków biologicznie aktywnych, takich jak alkaloidy, glikozydy nasercowe, olejki eteryczne.
Inżynierię genetyczną (transformacja genów, hybrydyzacja somatyczna) stwarza możliwość wprowadzenie obcego DNA do komórek i regenerowanie roślin posiadających nowe cechy.
Mikrorozmnażanie
Metoda ta ma wiele zalet w porównaniu z metodą konwencjonalną. Pozwala na:
otrzymywanie roślin wolnych od wirusów, odpornych na choroby, niektóre herbicydy czy niską temperaturę
na szybkie mnożenie roślin, które w naturze rozmnażają się wolno
mnożenie roślin, które w pewnych warunkach klimatycznych nie wydają nasion, np. paprocie tropikalne, których zarodniki w naszych warunkach kiełkują bardzo słabo
otrzymywanie w krótkim czasie nowych, lepszych odmian
niezależność od pór roku
Po raz pierwszy mikrorozmnażanie zastosowano w praktyce do mnożenie bardzo wolno rosnących storczyków. Obecnie technika ta powszechnie stosowana jest w celach handlowych do szybkiego mnożenia roślin ozdobnych. Jako przykład można podać lilie: 100 000 tych roślin może być otrzymanych metodą in vitro, z jednej cebulki w ciągu miesiąca.
Mikrorozmnażanie można prowadzić 3 sposobami:
z merystemów wierzchołkowych i bocznych
- metodą organogenezy, czyli poprzez tworzenie pąków przybyszowych z komórek somatycznych kalusa lub eksplantatu
metoda somatycznej embriogenezy czyli poprzez rozwój zarodników somatycznych
Metoda z merystemów wierzchołkowych lub bocznych:
Materiałem wyjściowym są pobrane z rośliny pąki szczytowe lub boczne. Mogą to być również wyizolowane z roślin stożki wzrostu. Metoda ta pozwala na otrzymanie roślin wolnych od wirusów. Wirusy mogą atakować cała roślinę, ale nie występują w stożkach wzrostów. W ten sposób wyprowadzając rośliny ze stożków wzrostu udało się z zainfekowanych roślin otrzymać rośliny wolne od wirusów. Metoda ta jest powszechnie stosowane dla otrzymania storczyków.
Powstają tu rośliny identyczne z rośliną macierzystą.
Metoda somatycznej embriogenezy:
W tym wypadku z kalusa, komórek zawiesiny lub tkanek eksplantatu powstają zarodki somatyczne. Są to dwubiegunowe struktury dające początek całej roślinie, powstałe z komórek somatycznych, a więc nie w wyniku zapłodnienia komórki jajowej. Ich rozwój jest podobny jak zarodków zygotycznych. Z zarodków somatycznych powstałych z kultur embriogennych otrzymano już nowe odmiany ryżu, warzyw oraz drzew owocowych.
Przebieg somatycznej embriogenezy w kulturze zawiesinowej marchwi:
rośliny dostarczają tkanek lub organów roślinnych, które mogą służyć jako eksplantaty
eksplantaty po sterylizacji umieszcza się na odpowiednim podłożu gdzie tworzą one embriogenny kalus
kalus przenoszony jest do płynnego podłoża dla zapoczątkowania zawiesiny
po przeniesieniu komórek zawiesiny lub fragmentu kalusa do innego podłoża rozwijają się somatyczne zarodki, które dają początek roślinom
W celu utrzymania zarodków w odpowiedniej formie przez dłuższy czas opracowano metodę osłaniania ich specyficznymi powłokami (najczęściej z alginianu wapnia). W ten sposób otrzymuje się zarodki w formie kapsułek, nazywane sztucznymi lub somatycznymi nasionami. Dotychczas sztuczne nasiona otrzymano już z takich roślina jak lucerna, marchew, bawełna, sałata, kukurydza czy ziemniak.
Metoda somatycznej embriogenezy jest najbardziej wydajną metodą rozmnażania roślin in vitro. Z kilku gramów kalusa można otrzymać około miliona zarodków. Ograniczeniem jest fakt, że nie wszystkie rośliny dają się rozmnażać tą metodą. Praktycznie w ten sposób rozmnaża się już frezje, poinsencje, pelargonie, cyklamery.
Metoda organogenezy:
Przebieg procesu organogenezy u Nicotiana tabacum (tytoń):
eksplantaty (liście tytoniu) tworzą kalus
kalus na odpowiedniej pożywce regeneruje pędy (organogeneza pośrednia)
pędy mogą być źródłem nowych eksplantatów lub umieszczone na odpowiedniej pożywce ukorzeniają się
roślinki po aklimatyzacji przenoszone są do uprawy gruntowej
Pędy mogą pojawiać się również na eksplantatach bez pośrednictwa tkanki kalusowej (organogeneza bezpośrednia).
Przy rozmnażaniu pędów za pośrednictwem kalusa, czyli metodą organogenezy i somatycznej embriogenezy, można otrzymać rośliny o zmienionym w porównaniu z rośliną macierzystą genotypie. Przyczyną jest istnienie w kalusie różnych typów komórek, z których teoretycznie każda może dać początek roślinie. W ten sposób można otrzymać nowe odmiany roślin.