Temat: OCENA AKTYWNOŚCI

ANTYOKSYDACYJNEJ PRZY UŻYCIU

TESTÓW KOLORYMETRYCZNYCH LUB

FLUORYMETRYCZNYCH.

Wykonał:

Mateusz Jankowski

Towaroznawstwo, Rok III. Gr. I

Nowoczesne metody analizy

żywności

Spis treści:



Rozdział 1 Przeciwutleniacze (pojęcia)



Rozdział 2 Metody i ich omówienie



Rozdział 3 Przykład zastosowania metod



Wyniki i ich omówienie



Rozdział 4 Wady i zalety



Podsumowanie



Źródła

Rozdział 1

Przeciwutleniacze (pojęcia)



Przeciwutleniacze (antyoksydanty,
antyutleniacze) – grupa związków chemicznych, które
same występując w małych stężeniach (w porównaniu z
substancją podlegającą utlenianiu), wstrzymują lub
opóźniają proces utleniania tej substancji

,

usuwają z

organizmu człowieka nadmiar wolnych rodników, każdy
przeciwutleniacz może występować w roli prooksydanta.



Antyoksydanty występują często w suplementach diety i
są powszechnie uważane za środek prewencyjny w
zapobieganiu licznym chorobom takim jak nowotwory,
chorobie niedokrwiennej serca a nawet chorobie
wysokościowej, spowalniają procesy starzenia organizmu
oraz zapobiegają rozwojowi chorób określanych jako
cywilizacyjne.



Przeciwutleniacze stosowane są w

zapobieganiu niepożądanym procesom
utleniania, przez co przedłużają czas
trwałości żywności.



Dozwolone przeciwutleniacze stosowane

w przemyśle spożywczym:



E270 – kwas mlekowy (regulator
kwasowości)



E330 – kwas cytrynowy (regulator
kwasowości i stabilizator)



E300 – kwas askorbinowy (witamina C;
substancja klarująca, regulator
kwasowości i stabilizator)



E301 – askorbinian sodu (regulator
kwasowości i stabilizator)



E302 – askorbinian wapnia (pełni funkcję
regulator( kwasowości i stabilizator)



E335 – wodorowinian sodu i winian sodu



E337 – winian sodowo-potasowy



W głównej mierze przeciwutleniacze to naturalne
substancje roślinne, które wspierają naturalne
mechanizmy obronne komórek człowieka, ale
przeciwutleniaczami mogą być także jony metali
przejściowych (manganu, cynku, selenu). Do
antyoksydantów zaliczmy witaminę A, E i C, karotenoidy
(na przykład beta-karoten, zeaksantyna), bioflawonoidy,
niektóre składniki mineralne, na przykład cynk i selen, a
także związki, takie jak koenzym Q.



Przeciwutleniacze w żywności występują m.in. w:



pomidorach- wit. A, C, likopen



jagodach- wit. C, antocjany, kwercetyna



morelach- wit. A, C, luteina



śliwkach- beta-karoten, wit. C, kw. chlorogenowy



papryce- wit. A, C, E



szpinaku- beta-karoten, luteina, zeaksantyna

Rozdział 2

Metody i ich omówienie



Jak dotąd nie ma jednej, pełnej klasyfikacji stosowanych technik
pomiarowych. Większość badań opiera się na ocenie aktywności czy
tzw. pojemności antyoksydacyjnej, będącej sumą właściwości
poszczególnych związków zawartych w badanym materiale. Inne
metody oceniają przeciwutleniacze ilościowo i jakościowo, nie
uwzględniając ich aktywności.



Wszystkie metody służące do oceny przeciwutleniaczy, zarówno ich
ilości, jak i aktywności, można podzielić na:



chromatograficzne:



na płaszczyznach - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa
(TLC),



na kolumnach - chromatografia cieczowa (HPLC) i gazowa (GC),



spektrofotometryczne,



kolorymetryczne,



elektrochemiczne:



woltamperometria cykliczna (CV),



spektroelektrochemia,



elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR).



Metodami kolorymetrycznymi można oceniać
zawartość lub aktywność flawonoidów w
ekstraktach po wstępnym oczyszczeniu. Do tej
grupy należą m.in. metody:



Christa-Műllera, w której zawartość
flawonoidów oznacza się poprzez pomiar
natężenia zabarwienia powstałego w wyniku
reakcji flawonoidu z trójchlorkiem antymonu,
tlenochlorkiem cyrkonu, octanem uranylowym,
azotanem berylu, kwasem borowym lub
chlorkiem glinowym,



Folina-Ciocalteu'a, gdzie flawonoidy tworzą
barwny kompleks z odczynnikiem Folina-
Ciocalteu'a (mieszanina wolframianu
sodowego, molibdenianu sodowego i siarczanu
litu w środowisku kwasu fosforowego i solnego)
dając zielono-niebieską barwę; po utlenieniu
kompleks oznacza się spektrofotometrycznie
przy długości fali od 750 nm do 784 nm.
Molibdenian Mo(VI) przyjmuje elektron, a
następnie jest redukowany do Mo(V). Reakcja
między odczynnikiem Folina-Ciocalteu’a a
związkami fenolowymi jest możliwa tylko w
środowisku alkalicznym. Na podstawie krzywej
kalibracyjnej przedstawiającej zależność
absorbancji etanolowego roztworu kwasu
galusowego od jego stężenia w roztworze
oznacza się ogólną zawartość związków
fenolowych w żywności.



opierające się na reakcjach wygaszania
syntetycznych wolnych rodników (ABTS, DPPH,
DMPD); barwny aktywny rodnik ulega redukcji
przez antyoksydanty obecne w badanej próbce,
do bezbarwnych związków, co ilościowo mierzy
się spektrofotometrem przy długości fali 734,
515 i 505 nm odpowiednio dla w/w rodników,



FRAP, polegająca na pomiarze zdolności do
redukcji jonu żelazowego 2,4,6-tripirydylo-s-
triazyny (TPTZ); związek żelaza (III) w reakcji z
antyoksydantem daje barwny produktu, który
oznacza się przy długości fali 593 nm,



TRAP, w której przeciwutleniacz redukuje rodnik
ABAP,



CUPRAC, w której jony miedzi (II) ulegają pod
wpływem antyoksydantów redukcji do jonów
miedzi (I); analizę spektrofotometryczną
wykonuje się przy długości fali 450 nm,



ORAC, oceniająca zdolność antyutleniacza do
opóźniania fluorescencji
R-fikoerytryny, indukowanej przez AAPH, długość
fali wzbudzającej to 540 nm, a emisji 570 nm.



Do technik oceniających zawartość związków
przeciwutleniających należy zaliczyć również
wszystkie oznaczenia poszczególnych
antyoksydantów, a więc metody analizy
witaminy C, tokoferoli, antocyjanin itd.



Wyżej wymienione metody służą do analizy
ilościowej lub jakościowej przeciwutleniaczy oraz
oceny ich aktywności.



Skróty:



ORAC - Oxygen radical absorption capacity TRAP -
Total reactive antioxidant potential



FRAP - Ferric reducing ability of plasma albo Ferric
reducing antioxidant power



CUPRAC - Cupric reducing antioxidant capacity



TEAC - Trolox equivalent antioxidant capacity



VCEAC - Vitamin C equivalent antioxidant capacity



AAPH - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane
dihydrochloride



ABAP - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane



ABTS+ - 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonate)



DMPD – N,N-dimethyl-p-phenylenediamine



DPPH - 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl

Rozdział 3

Przykład zastosowania metod



Zaczerpnięte z magazynu Bromatologia i Chemia
Toksykologiczna (BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XLIV,
2011, 3, str. 355-360 ) z artykułu pt. „WŁAŚCIWOŚCI
PRZECIWUTLENIAJĄCE NAPOJÓW ENERGETYZUJĄCYCH”,
autorstwa Anny Witkowskiej, Małgorzaty E. Zujko,
Iwony Mirończuk-Chodakowskiej



W pracy tej oznaczono potencjał antyoksydacyjny
napojów energetyzujących. Stwierdzono, że napoje
energetyzujące charakteryzują się niższą aktywnością
antyoksydacyjną niż napoje produkowane z surowców
naturalnych, takie jak soki i wina owocowe, kawa,
herbata, napary ziołowe. Uzyskane wyniki wskazują na
mało istotne znaczenie napojów energetyzujących jako
źródeł pokarmowych substancji przeciwutleniających.



Napoje energetyzujące pochodzące od różnych producentów
zakupiono w sieci handlowej na terenie Białegostoku. Do momentu
wykonania analizy były one przechowywane w oryginalnych,
zamkniętych opakowaniach. Przed wykonaniem oznaczeń napoje
były odgazowywane przez 0,5 godz. przy pomocy płuczki
ultradźwiękowej Bransonic 1510, Branson. (przygotowanie próbki)



Całkowite stężenie polifenoli oznaczono kolorymetrycznie metodą
Singletona i Rossiego przy użyciu odczynnika fosforowo-
molibdenowego. Absorbancję barwnych roztworów odczytano na
spektrofotometrze Spekol 10, Niemcy, przy długości fali 765 nm.
Stężenie podano w przeliczeniu na ekwiwalenty kwasu galusowego.



Aktywność antyoksydacyjną FRAP (Ferric reducing antioxidant
potential) oznaczono wg Benzie i Strain przy użyciu reagenta Fe3+
(TPTZ). Absorbancję roztworów badanych i ślepych odczytywano po 4
minutach na spektrofotometrze Spekol 10 przy długości fali 593 nm.



Metoda ta (Benzie i Strain), polega na ocenie zdolności redukcji
kompleksu żelaza Fe3+-TPTZ (kompleks żelazowo-2,4,6-tripirydylo-s-
traizyny) do kompleksu Fe2+-TPTZ przez badaną substancję o
właściwościach przeciwutleniających. Redukcji tej towarzyszy zmiana
absorbancji mieszaniny reakcyjnej. Spadek absorbancji kompleksu
Fe3+-TPTZ mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali 593
nm.

Wyniki i ich omówienie



Na podstawie analizy składu deklarowanego przez
producentów stwierdzono, że we wszystkich badanych
napojach energetyzujących występowała woda, sacharoza,
regulatory kwasowości (kwas cytrynowy lub/i cytrynian
sodu), dwutlenek węgla, aromaty oraz kofeina w ilości ok.
0,03%. Większość napojów zawierała barwniki takie jak
karmel i jego pochodne, a także ryboflawinę. W składzie
zdecydowanej większości występowały substancje
wzbogacające w postaci witamin z grupy B: niacyna, kwas
pantotenowy, witamina B6 i witamina B12. W ośmiu
napojach występowała tauryna, w siedmiu – ekstrakt
guarany, w pięciu - inozytol, w czterech – glukuronolakton.
Niektóre napoje (od pięciu producentów) konserwowane
były chemicznie sorbinianem potasu i/lub benzoesanem
sodu.

Rozdział 4

Wady i zalety



Zaletami metod kolorymetrycznych jest:



duża szybkość wykonywania oznaczeń



możliwość oznaczania bardzo małych ilości
substancji



stosunkowo dużą dokładność



nie wymagają żadnych dodatkowych odczynników

•

Wady tych metod:



pomimo tego, że większość z nich jest prosta,
interpretacja wyników bywa skomplikowana, np.
kiedy analizowane próbki mają pokrywające się
widma



dużą wadą też jest mieszanie się substancji,
szczególnie cukrów, aromatycznych amin,
dwutlenku siarki, kwasu askorbinowego i kwasów
organicznych. Dlatego należy wprowadzać korekty



Nie wszystkimi metodami można oznaczyć te same
przeciwutleniacze. Metoda FRAP nie mierzy np.
glutationu.

Podsumowanie



Duże zróżnicowanie w budowie i reaktywności
rodników oraz mechanizmów ich inaktywacji
wymusiło opracowanie wielu metod oznaczania i
identyfikacji związków o charakterze
przeciwutleniającym. Do najczęściej stosowanych
zalicza się techniki spektrofotometryczne,
oceniające sumaryczny potencjał antyoksydacyjny
substancji. Można tutaj wymienić metody
wygaszania rodników ABTS, DPPH oraz CUPRAC i
ORAC. Do ilościowego oznaczania polifenoli
wykorzystuje się metodę Folina-Ciocalteau, a w
celu identyfikacji – techniki chromatograficzne
(głownie HPLC).

Źródła:



Materiały Katedry Technologii Fermentacji i Mikrobiologii
Technicznej Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, praca
pt.: Wpływ czynników fizyko-chemicznych oraz warunków
przechowywania na właściwości przeciwutleniające
wybranych produktów żywnościowych



Pachołek B., Sielicka M., Zagórska A., WŁAŚCIWOŚCI
PRZECIWUTLENIAJĄCE WYBRANYCH HERBATEK BĘDĄCYCH
SUPLEMENTAMI DIETY,
ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2010, 5 (72), 112 –
122



Witkowska A., Zujko M., Mirończuk-Chodakowska I.,
WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCE NAPOJÓW
ENERGETYZUJĄCYCH,
BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XLIV, 2011, 3, str. 355-360