Określenie zmian morfologicznych i liczebności komórek traktowanych

różnymi stężeniami sulforafanu i nokodazolu w porównaniu z komórkami

kontrolnymi.

Przeżywalność komórek w próbce kontrolnej była najwyższa ze

wszystkich obserwowanych płytek. Komórki na płytce kontrolnej

tworzyły dużą kolonię. Pod wpływem sulforafanu i nokodazolu

spadała liczebność żywych komórek. Im stężenie sulforafanu i

nokodazolu było większe tym stopień ich przeżywalności był

mniejszy .Sulforafan 80uM- komórki mniejsze tego samego kształtu

jest mniej komórek niż w próbówce kontrolnej. Większość komórek

jest żywych. Sulforafan 120uM – Coraz mniej komórek żywych, w

większości są komórki martwe. Sulforafan 150uM- Wszystkie

komórki martwe. Nokodazol 0,4uM- komórki duże większe niż w

próbce kontrolnej. Większość komórek żywych.

Nokodazol 0,4uM- Pojawiają się komórki martwe, ale w mniejszej

ilości niż w sulforafanie 120uM . Nokodazol 1,2uM- W pływa na

śmiertelność komórek ,ale nie w takim stopniu jak sulforafan 150uM.

ĆWICZENIE 2.

Określenie morfologii komórek i stopnia zahamowania wzrostu komórek

przez sulforafan i nokodazol z zastosowaniem barwienia błękitu trypanu.

Obiektem moich badań były komórki traktowane 0,8 nM Nokodazolem. Na

początku ćwiczenia zebrałam pożywkę z płytki do probówek. Następnie

przemyłam płytkę 1ml trypsyny o stężeniu 0,25% w celu odczepienia komórek

od powierzchni płytki. Trypsyna nadtrawia macierz zewnątrzkomórkową

umożliwiając odklejenie się komórek. Po przepłukaniu dodałam 1 ml trypsyny i

inkubowałam około 5-10 minut w temperaturze 37ºC. Następnie

rozpipetowałam komórki i przeniosłam do probówek z pobraną pożywką. Po

rozpipetowaniu probówka wirowała się ok. 10 minut. Następnie odciągnęłam

supernatant. Do osadu znajdującego się na dnie probówki dodałam 1 ml buforu

Hepes i również rozpipetowałam komórki. Do probówki Ependorfa pobrałam 20

µl komórek i 20 µl błękitu trypanu. Następnie inkubowałam ok. 20 minut.

Liczenie komórek pod mikroskopem (0,8 nM Nokodazol):

• Martwe( zabarwione) - 3

• Żywe( nie zabarwione) – 5

Przeżywalność:

5/8· 100%= 62,5%

Liczenie komórek z użyciem hemocytometru:

Na skraj szkiełka nakrywkowego nakropiłam 10 µl zawiesiny. Przeniosłam

hemocytometr pod mikroskop w celu zliczenia komórek.

Liczba komórek w 1 ml:

1) objętość komory : 1/25mm2 ·16·0,1mm = 0,064mm3

2) ilość komórek : 100·5/0,064·2= 15625

1000-----x

0,064----5

X=78125*2=15625=1,5*10(do potęgi piątej)