Zagadnienia obowiązujące na zaliczenie przedmiotu Techniki Laboratoryjne w roku akademickim 2014/2015

1. Zastosowanie i przykłady białek biologicznie aktywnych

   Białka biologicznie aktywne odpowiedzialne są za prawidłową budowę tkanek, ułatwienie przyswajalności niektórych składników, biorą one również udział w regulacji procesów metabolicznych.

Najbardziej znane są karnityna, tauryna, glutation, oksytocyna, czy wazopresyna.

• karnityna – pochodna kwasu γ-amino-β-hydroksymasłowego obficie występująca w mięśniach. Pełni funkcje transportowe wobec kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach, które przekazywane są do mitochondriów, gdzie ulegają przemianom, w wyniku których powstaje energia niezbędna do prawidłowego funkcjonowania komórek organizmu. Reguluje stosunki między acetylo-CoA i CoA.

• tauryna – jej funkcją biochemiczną jest sprzęganie kwasów żółciowych przed wydaleniem ich z wątroby. Tauryna wpływa na ośrodkowy układ nerwowy. Przypisuje się jej funkcje neuroprzekaźnika. Jest m.in. agonistą receptorów GABA(A). Działa jak transmiter metaboliczny i ma dodatkowo efekt detoksykujący oraz wzmacniający siłę skurczu serca.

• glutation – niewielkie białko pełniące w organizmie funkcje antyoksydacyjne, detoksykacyjne i odpornościowe (aktywność limfocytów).

• oksytocyna i wazopresyna – cykliczne nonapeptydy (zbudowane z 9 aminokwasów) wytwarzane w podwzgórzu i magazynowane w przysadce; należą do neuropeptydów, czyli hormonów peptydowych wydziela-nych przez tkankę nerwową. Nazywane są też a hormonami tylnego płata przysadki mózgowej.

2. Biochemiczne właściwości białek

• budowa chemiczna (wiązanie peptydowe, aminokwasy)

Aminokwasy – grupa organicznych związków chemicznych zawierających zasadową grupę aminową oraz zasadniczo kwasową grupę karboksylową -COOH, lub w ujęciu ogólniejszym, dowolną grupę kwasową.

Grupa aminokwasów biogennych:

• struktura białka - I, II, III i IV rzędowa - wiązania stabilizujące te struktury, rodzaj struktur i ich charakterystyka

Pierwszorzędowa: sekwencja, czyli kolejność aminokwasów w łańcuchu białkowym. Struktura ta jest najtrwalsza, gdyż dopiero działanie enzymów lub kwasów może spowodować hydrolizę wiązania peptydowego. Sekwencja aminokwasów w łańcuchu białkowym jest zapisana w genie kodującym dane białko.

Drugorzędowa: łańcuch białkowy w układzie helisy α lub arkusza β (β harmonijka). Struktura ta jest stabilizowana wiązaniami wodorowymi.

Trzeciorzędowa: ułożenie łańcucha aminokwasowego w przestrzeni stabilizowane przez wiązania wodorowe, disiarczkowe, estrowe, tioestrowe i jonowe (tzw.mostki solne).

Czwartorzędowa: asocjacja podjednostek białka o określonej strukturze trzeciorzędowej w większe agregaty.

• fałdowanie białek - uwarunkowania energetyczne, molekularne modele procesu fałdowania, komórkowa maszyneria wspomagająca proces fałdowania

Fałdowanie białek jest procesem polegającym na postępującym stabilizowaniu stadiów pośrednich, częściowo podobnych do stanu ostatecznej konformacji. Prawidłowa struktura przestrzenna jest zwykle konieczna do pełnnienia roli fizjologicznej. Natywna forma białka (czyli forma najstabilniejsza, o najmniejszej energii kinetycznej) jest konsekwencją wielu wzajemnie na siebie wpływających oddziaływań. Główną rolę w procesie tworzenia się struktur II- i III-rzędowych odgrywają wiązania hydrofobowe. Możliwości konformacyjne określa diagram Ramachandrana. II-rzędowe struktury białkowe mają skonność do łączenia się w motywy strukturalne, pozwalające na stworzenie funkcjonalnej domeny.

Białko w stanie rozwiniętym (zdenaturowanym) utrzymuje wiele niekowalencyjnych oddziaływań z rozpuszczalnikiem. Kiedy fałduje się, zamienia wiele z tych oddziaływań na inne, wewnątrzcząsteczkowe: hydrofobowe łańcuchy boczne mają tendencję do agregacji, a wiele innych aminokwasów paruje się na zadzie tworzenia np. wiązań dwusiarczkowych. Energetyczne oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe są niewielkie, ale dzięki temu iż jest ich bardzo wiele ich suma jest ogromna.

Z tych pobieżnych i uproszczonych wyliczeń wynika, iż musi istnieć jakiś "szlak", który minimalizuje losowość tego procesu. Rozwinięte zostały teorie dotyczące trzech możliwych dróg, po których białko zmierza "do celu". Uprościły one proces rozdzielając tworzenie struktur drugo- i trzeciorzędowych i zlikwidowały konieczność równoczesnego ich zachodzenia, tzn. dopuściły ich sekwencyjne powstawanie. Pierwsze dwa zakładają równoczesne powstawanie lokalnych elementów natywnych struktur drugorzędowych. Elementy te mogą następnie dyfundować do momentu spotkania się ich w odpowiednich konformacjach jak to się dzieje w modelu dyfuzyjno-kolizyjnym (ang. diffusion-collision model) lub ich struktura może być niejako "propagowana" na cały łańcuch (ang. nucleation model). Model nukleacyjny postuluje, iż pewne sąsiadujące aminokwasy mogą spontanicznie tworzyć elementy struktur drugorzędowych, które w późniejszych etapach będą tworzyć tzw. "jądra" lub "centra", od których natywna struktura będzie się rozszerzać na cały łańcuch - trzeciorzędowa struktura powstanie więc jako konsekwencja struktur drugorzędowych. Trzecim - odmiennym modelem fałdowania jest tzw. model hydrofobowego kolapsu (ang. hydrophobic collapse model). Postuluje on iż cząsteczka bardzo szybko "zapada się" dzięki oddziaływaniom hydrofobowych łańcuchów bocznych tworząc półpłynną strukturę, która następnie musi ulec rearanżacji do struktury natywnej. W tym modelu struktura drugorzędowa tworzy się dzięki oddziaływaniom trzeciorzędowym.

Fałdowanie białek w komórce jest wspomagane katalitycznie na kilka sposobów.

• disulfidoizomeraza białek (PDI) kilka tysięcy razy przyspiesza reakcję wymiany mostków disiarczkowych

• izomeraza peptydoprolilowa (PPIaza) znacznie przyspiesza izomeryzację wiązań peptydowych X‑Pro, które mogą być cis- lub trans- (pozostałe z reguły są w izomerii trans)

• tendencja do agregacji występuje w dużych stężeniach białek

• chaperony – mają zdolność do rozpoznawania i wiązania białek "nie natywnych". Wspomagają one fałdowanie poprzez: zapobieganie agregacji niesfałdowanych białek oraz oddziaływanie z nimi, by dać im "jeszcze jedną szansę"

Polecana literatura:

Bregier C. i in., Białka opiekuńcze - „molekularne przyzwoitki” w fałdowaniu białek, 2007

3. Systemy heterologicznej ekspresji białek rekombinowanych

• bakteryjny system pET - zasada funkcjonowania, zalety i ograniczenia, metodyka eksperymentu, charakterystyka szczepów ekspresyjnych*, optymalizacja procesy nadekspresjii

Bakteryjny system pET jest najczęściej wybieranym systemem do produkcji białek rekombinantowych ze względu na dobrze zbadaną genetykę, łatwą i tanią hodowlę oraz dużą tolerancję dla produkcji obcych białek, nawet w dużych ilościach. Wadą tego systemu jest produkcja wielu białek tylko w postaci ciałek inkluzyjnych oraz niemożność otrzymywania białek wymagających modyfikacji potranslacyjnych, co jest możliwe w innych systemach np. system drożdżowy, komórki owadzie czy też ssacze.

W celu uzyskania ekspresji pożądanego białka, kompetentne komórki E. coli należy stransformować plazmidem, w który uprzednio wklonowano odpowiedni gen. Gen ten musi być kontrolowany przez odpowiedni promotor. Silnym promotorem najczęściej stosowanym w plazmidach jest promotor T7 z bakteriofaga T7.

[pobrane z http://bioenergy.asu.edu/photosyn/courses/bio_343/lab/experiment-i.html]

[opis eksperymentu tamże]

Większość wektorów serii pET poza typowym ori replikacyjnym zawiera również sekwencję origin replikacji faga f1 umożliwiającą uzyskanie jednoniciowej formy DNA tych plazmidów np. w celu przeprowadzenia mutagenezy ukierunkowanej w obrębie ich sekwencji. Wyróżniamy trzy podstawowe kryteria wyboru wektora ekspresyjnego:

• ilość białka, którą chcemy wyprodukować:

  • „małe” ilości białka (techniki badania aktywności białek, badania oddziaływania uzyskanego białka z wybranymi ligandami,uzyskiwanie przeciwciał przeciwko tym białkom)

  • „duże” ilości białka (uzyskanie stężonych lub wysoce aktywnych preparatów - badania strukturalne, zastosowania przemysłowe)

• Możliwość lub konieczność uzyskania białka w postaci fuzji z wybranymi domenami fuzyjnymi mającemu na celu np.: ułatwienie procedury oczyszczania eksprymowanego białka, zwiększenie rozpuszczalności uzyskanego białka w cytozolu E. coli, lub transport eksprymowanego białka do przestrzeni periplazmatycznej E. coli

• Strategia klonowania czyli wybór wektora pod względem miejsc restrykcyjnych obecnych w MCS oraz pod względem wyboru jednej z trzech możliwych ramek odczytu

Problemy nadekspresji:

* Polecana publikacja pt. „Wybór systemu ekspresyjnego” [dostępna na stronie http://www.pg.gda.pl/chem/pl/zamawiane/images/stories/Nowoczesne3_4.pdf]

• drożdżowy układ Pichia pastoris - ogólna zasada funkcjonowania, selekcja oparta o zjawisko auksotrofii, warunki hodowli i nadekspresjii białka, zalety i wady w stosunku do układu pET.

Produkcję białek rekombinowanych w Pichia pastoris powinno prowadzić się w odpowiednich bioreaktorach. Umożliwia to pełne wykorzystanie potencjału ekspresyjnego drożdży. Jest to proces kosztowny, a drożdże mimo to są mniej wydajne i dodatkowo mogący ulec kontaminacji. Zaletami tego systemu ekspresyjnego jest zaś możliwość modyfikacji posttranslacyjnych, możliwość adresowania białek, obecność chaperonów, czy lepsze przystosowanie do produkcji genów eukariotycznych.

Auksotrofy – organizmy żywe, pozbawione zdolności syntezy określonych, niezbędnych do ich wzrostu, skomplikowanych związków organicznych, takich jak witaminy, zasady purynowe czy aminokwasy. Organizm auksotroficzny musi pobierać ten związek z otoczenia, jako składnik swojego pożywienia. Pichia pastoris nie potrafi syntetyzować histydyny. Indukcja następuje po zmianie źródła węgla np. z glukozy na metanol. Pichia pastoris to bakterie metylotroficzne, mające zdolność do wykorzystywania węgla zakumulowanego w tej postaci (posiadają geny kodujące oksydazę alkoholową AOX1 i AOX2).

• bakulowirusowy system oparty o komórki owadzie - ogólna zasada funkcjonowania

Bakulowirusy umożliwiają powielanie w komórkach owadzich. Główną zaletą jest możliwość modyfikacji białek, jak w wyższych organizmach eukariotycznych. Promotory bakulowirusowe są nieaktywne w komórkach ssaczych. Wysoki poziom ekspresji białek rekombinantowych z wektora bakulowirusowego w postaci fuzji umożliwia detekcje i oczyszczanie tych białek. Opcjonalnie przy zastosowaniu wektorów pBACgus, ułatwiają selekcję rekombinantowych komórek dzięki obecności genu gus kodującego enzym – glukuronidazę. Białka oczyszczamy z zastosowaniem klasycznych technik takich jak, precypitacja siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa etc.

Polecana książka: King L. A., Possee R. D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Springer, 1992

4. Metody dezintegracji komórek po nadekspresji i frakcjonowania lizatu komórkowego -

• wirowanie S-30 i S-100;

Wirowanie S-30: 12 tys. rpm, 10 min.

Wirowanie S-100: 80 tys. rpm, 30-45 min. (dodanie 1% trytonu)

• frakcje białek rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych

Dezintegat (wirowanie oczyszczające: 5 tys. rpm, 5 min. x3) → supernatant I

Supernatant I (wirowanie S-30) → supernatant II (białka rozpuszczalne) + osad I (białka nierozpuszczalne – ciałka inkluzyjne)

Supernatant II (wirowanie S-100) → supernatant III (białka pozarybosomalne) + osad II (białka rybosomalne)

5. Chromatografia powinowactwa -

• przykłady i charakterystyka etykiet białkowych;

Chromatografia powinowactwa jest jedną z odmian chromatografii cieczowej. W najszerszej definicji chromatografia jest to technika separacji cząsteczek chemicznych (m.in. białek) wykorzystująca różnice w oddziaływaniu poszczególnych składników mieszaniny ze złożem chromatograficznym. Oczyszczanie białek poprzez chromatografię powinowactwa opiera się na zjawisku naturalnego powinowactwa etykiety, jaka dołączona jest do białka rekombinowanego, do specyficznego liganda zimmobilizowanego na złożu chromatograficznym.

Etykiety, domeny fuzyjne (ang. tag) umożliwiają ekspresję tego samego genu w postaci białek fuzyjnych różniących się właściwościami wynikającymi z ich sekwencji. Domeny fuzyjne mogą składać się z kilku reszt aminokwasowych np. 6 reszt aminokwasowych His-Tag lub mogą być to sekwencje reszt aminokwasowych białek np. 495 reszt aa. białka NusA z Nus-Tag

• różnice we właściwościach i zastosowaniu etykiety 6xHis i GST;

Etykieta histydynowa jest krótkim homopeptydem zbudowanym z 6 reszt histydynowych dołączonych do C- lub N- końca białka rekombinowanego. Przyłączenie etykiety odbywa się na etapie konstrukcji wektora ekspresyjnego, kiedy to do sekwencji DNA kodującej białko poddawane heterologicznej ekspresji dołącza się fragment DNA kodujący 6 reszt histydyny.

Etykieta GST (transferaza S-glutationu) ma zdolność stymulacji prawidłowego fałdowania białka. Podobnie jak poprzednik elucja zachodzi w łagodnych warunkach. W przeciwieństwie do 6xHis-tag nie wykazuje powinowactwa do jonów dwuwartościowych (Ni, Cu, Zn).

Polecane artykuły: Porowińska D. i in., Prokariotyczne systemy ekspresyjne, 2013

Wawiórka L., Rybosomalne białka P Plasmodium falciparum jako potencjalny składnik szczepionki przeciwko malarii [dostępne na stronie http://www.rsi2004.lubelskie.pl/doc/sty6/opis/Wawiorka_opis.pdf]

• oczyszczanie w warunkach natywnych vs oczyszczanie w warunkach denaturujących

Procedura oczyszczania w warunkach natywnych:

Literatura:

1. Treści omawiane w trakcie poszczególnych zajęć

2. „Genomy” Browna

3. „Krótkie wykłady z biologii molekularnej”

4. „ Cytobiochemia” prof. Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz

   [opracowanie internetowe]

Wykonał Jakub Knurek