MIKROBIOLOGICZNE

MIKROBIOLOGICZNE

METODY BADANIA

METODY BADANIA

ŻYWNOŚCI

ŻYWNOŚCI

W ocenie mikrobiologicznej

W ocenie mikrobiologicznej

żywności uwzględnia się zarówno

żywności uwzględnia się zarówno

jakość, jak i jej ilość.

jakość, jak i jej ilość.

Znajomość mikroflory

Znajomość mikroflory

występującej w żywności

występującej w żywności

pozwala nie tylko na ocenę

pozwala nie tylko na ocenę

surowców i gotowych produktów,

surowców i gotowych produktów,

lecz także umożliwia ustalenie,

lecz także umożliwia ustalenie,

czy prowadzone procesy

czy prowadzone procesy

technologiczne i zabiegi

technologiczne i zabiegi

utrwalania żywności przebiegają

utrwalania żywności przebiegają

prawidłowo.

prawidłowo.

W analizie mikrobiologicznej

W analizie mikrobiologicznej

żywności stosuje się różne metody.

żywności stosuje się różne metody.

Wybór zależy głównie od typu

Wybór zależy głównie od typu

badanej żywności.

badanej żywności.

Kierunek mikrobiologicznej analizy

Kierunek mikrobiologicznej analizy

żywności może dotyczyć:

żywności może dotyczyć:



Oznaczenia ogólnej liczby drobnoustrojów

Oznaczenia ogólnej liczby drobnoustrojów



Oznaczenia drobnoustrojów

Oznaczenia drobnoustrojów

wskaźnikowych

wskaźnikowych



Oznaczenia obecności, liczby i grupy

Oznaczenia obecności, liczby i grupy

drobnoustrojów wywołujących psucie

drobnoustrojów wywołujących psucie



Wykrywania lub oznaczania liczby

Wykrywania lub oznaczania liczby

drobnoustrojów wywołujących zatrucia

drobnoustrojów wywołujących zatrucia

pokarmowe

pokarmowe

Oznaczanie ogólnej

Oznaczanie ogólnej

liczby drobnoustrojów

liczby drobnoustrojów

1. METODY BEZPOŚREDNIE

1. METODY BEZPOŚREDNIE

(mikroskopowe)

(mikroskopowe)

Metody te polegają na liczeniu drobnoustrojów

bezpośrednio pod mikroskopem. W cienkiej

warstwie płynu, w znanej objętości i na znanej

powierzchni szkiełka liczy się komórki żywe,

martwe i uszkodzone.

Metody mikroskopowe obejmują liczenie

drobnoustrojów:

►

Za pomocą komór

►

Metodą Breeda

►

Metodą filtrów membranowych

►

Za pomocą komór

Komory do bezpośredniego liczenia

drobnoustrojów pod mikroskopem są to

zazwyczaj grubościenne szkiełka

przedmiotowe z wgłębieniem o znanej

głębokości i powierzchni podzielonej na

kwadraty lub prostokąty.

Używa się komór: Thoma, Howarda,

Bürkera, Fuchsa-Rosenthala. W komorach

możliwe jest liczenie tylko większych

komórek, takich jak drożdże, zarodniki

pleśni i duże komórki bakteryjne.

Powszechnie jest stosowana komora Thoma zwana też
hemocytometrem

Widok z góry

Widok z boku Siatka kwadratów w

powiększeniu

Komora
Thoma

Komora Thoma jest to grube szkiełko przedmiotowe z
wgłębieniem o głębokości 0,1 mm, podzielonym na 16 dużych
kwadratów, z których każdy składa się z 16 małych
kwadracików o boku 0,05 mm. Na siatkę komory nanosi się
kroplę zawiesiny drobnoustrojów i przykrywa szkiełkiem
nakrywkowym. Pod mikroskopem, stosując obiektyw
powiększający 40x lub 60x, liczy się komórki w 40 lub 80
małych kwadratach (w każdym kwadracie liczba komórek
znajdujących się wewnątrz pola plus połowa, znajdująca się na
liniach) i oblicza się średnią przypadającą na jeden kwadrat.
Liczbę komórek w 1cm

3

badanego płynu oblicza się ze wzoru:

a x b x 4000 x 1000

gdzie:

a – średnia liczba komórek przypadająca na jeden mały

kwadrat

b – ewentualnie rozcieńczenie zawiesiny

► metoda Breeda

Na znanej powierzchni szkiełka przedmiotowego, rozprowadza

się znana objętośc zawiesiny. Preparat po utrwaleniu barwi się i

liczy drobnoustroje pod mikroskopem z użyciem obiektywu

immersyjnego. Metoda ta pozwala na oznaczenie liczby bakterii

w badanym produkcie. Do prawidłowego przeprowadzenia

badania przygotowuje się trzy preparaty z tej samej zawiesiny.

W każdym preparacie oblicza się średnią z 20 pól widzenia, a

następnie średnią z trzech preparatów.

Liczbę bakterii w 1cm

3

oblicza się ze wzoru:

gdzie:

a – średnia liczba bakterii w jednym polu widzenia

b – powierzchnia preparatu

c – objętość zawiesiny wprowadzonej na szkiełko przedmiotowe

r

2

– powierzchnia pola widzenia

► Metoda filtrów membranowych

Metodę tę stosuje się do liczenia bakterii w środowiskach

ubogich w drobnoustroje. Polega ona na przesączeniu przez

odpowiednio zabarwiony filtr określonej objętości próby, a

następnie wybarwieniu bakterii znajdujących się na filtrze i

liczeniu ich pod mikroskopem. Po przesączeniu próby filtr wyjmuje

się z oprawy, suszy i umieszcza na szkiełku przedmiotowym.

Komórki liczy się, z użyciem obiektywu immersyjnego, w

określonej liczbie pól widzenia.

Liczbę bakterii w 1cm

3

badanej próbki oblicza się ze wzoru:

liczba bakterii / liczba pól mikroskopu x współczynnik x

rozcieńczenie

Oblicza się pole filtru i pole widzenia mikroskopu, a następnie

współczynnik równy stosunkowi pola filtru do pola widzenia

mikroskopu

2. METODY POŚREDNIE

2. METODY POŚREDNIE

Metody pośrednie oznaczania liczby bakterii polegają

głównie na liczeniu kolonii metodą płytkową. Ogólną

zasadą metod płytkowych jest posiew określonej

objętości badanej próbki na podłoże stałe, a po

okresie inkubacji – stwierdzenie liczby wyrosłych

kolonii. Metodami tymi można z większym lub

mniejszym prawdopodobieństwie określić rzeczywistą

liczbę drobnoustrojów. Wyniki jednak są zawsze

niższe, ponieważ na płytkach liczy się tylko kolonie

drobnoustrojów, które są zdolne do wzrostu na danym

podłożu i w danej temperaturze. Ponadto niektóre
bakterie, występujące w skupiskach i łańcuszkach

złożonych niekiedy z kilkudziesięciu komórek, dają

również jedną kolonię.

Metody pośrednie są oparte na:



posiewie i liczeniu kolonii
metodą zalewową



posiewie powierzchniowym



oznaczeniu najbardziej
prawdopodobnej liczny
drobnoustrojów (NLP)

Próbkę żywności

Próbkę żywności

przeznaczonej do oznaczeń

przeznaczonej do oznaczeń

ilościowych należy

ilościowych należy

odpowiednio przygotować,

odpowiednio przygotować,

tzn. rozcieńczyć, a w

tzn. rozcieńczyć, a w

przypadku produktów stałych

przypadku produktów stałych

- najpierw rozdrobnić.

- najpierw rozdrobnić.

Posiew ilościowy metodą płytkową

Metoda płytkowa została wprowadzona przez
Roberta Kocha i oprócz liczenia znalazła
zastosowanie do izolowania czystych kultur i
obserwacji morfologicznych kolonii
mikroorganizmów.

Posiewu można dokonać w dwojaki sposób:
- przez wprowadzenie badanej próbki do płytki i
zalanie jej upłynnionym podłożem stałym (metoda
zalewowa)

- przez wprowadzenie próbki na powierzchnię
zastygłego podłoża i rozprowadzenie za pomocą
głaszczki (metoda posiewu powierzchniowego)

Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą

posiewu powierzchniowego

Przy ilościowym oznaczaniu określonych grup

drobnoustrojów na podłożach wybiórczych stosuje się

posiew powierzchniowy na pożywki uprzednio

rozlane i zestalone w płytkach. Najczęściej posiewa

się po 0,1 lub 0,5 cm

3

z odpowiednich rozcieńczeń

próbki i natychmiast rozprowadza równomiernie po

całej powierzchni za pomocą specjalnie wygiętej

jałowiej bagietki (głaszczki). Metoda płytkowa Kocha

doczekała się licznych udoskonaleń i modyfikacji

oraz automatyzacji.

Określenie najbardziej prawdopodobnej

liczby drobnoustrojów

Metoda ta służy do oznaczania drobnoustrojów występujących

w niewielkiej liczbie w produkcie spożywczym. Polega ona na

hodowli określonych grup bakterii na pożywkach selektywnych

(płynnych lub stałych) . Tego rodzaju podłoża sprzyjają

namnożeniu się bakterii występujących w niewielkiej liczbie. W

metodzie używa się trzech lub pięciu probówek (lub płytek),

zawierających odpowiednio po 10cm

3

lub 15cm

3

podłoża,

ustawionych w trzech rzędach, zależnie od kierunku analizy i

rodzaju produktu. Do pierwszego rzędu probówek posiewa się po

10cm

3

próbki z rozcieńczenia wyjściowego (1:10) a następnie po

1 cm

3

z dwóch kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych. Jeśli

posiewamy po 10cm

3

próby, w pierwszym rzędzie pożywka

powinna być podwójnie stężona. Po inkubacji, z odpowiednich

tabel opartych na rachunku prawdopodobieństwa odczytuje się

najbardziej prawdopodobną liczbę bakterii.

METODY WSKAŹNIKOWE

METODY WSKAŹNIKOWE

Metody wskaźnikowe pozwalają na

stwierdzenie obecności drobnoustrojów na

podstawie ich aktywności biochemicznej.

Metodami tymi określa się obecności

drobnoustrojów które nawet w niewielkich

ilościach wskazują na stan sanitarny produktu,

jednocześnie są trudne do wykrycia metodami

płytkowymi.

Do metod wskaźnikowych

zalicza się



oznaczanie miana



próbę reduktazową

Oznaczanie miana

Mianem określa się najmniejszą ilość

produktu, w której stwierdzono obecność

danego drobnoustroju.

W celu oznaczenia miana, do rzędu

probówek z podłożem płynnym posiewa się

po 1cm

3

odpowiednich rozcieńczeń

badanego produktu. Ostatnie rozcieńczenie,

w którym stwierdzono jeszcze dodatnią

reakcję (wzrost, zmianę barwy pożywki czy

wzrost i obecność gazu), przyjmuje się jako

miano.

Powszechnie stosuje się oznaczanie miana

coli

oraz miana

enterokoków,

a także

bakterii beztlenowych

.

Miano coli

Najczęściej stosowanym oznaczeniem w

ocenie sanitarno-higienicznej żywności jest

określenie miana coli. Pałeczki z grupy

okrężnicy występują w przewodzie

pokarmowym ludzi i zwierząt, stanowiąc

główny składnik mikroflory. Obecność

bakterii coli w produkcie wskazuje na

możliwość zanieczyszczenia kałowego, a tym

samym na możliwość zakażenia bakteriami

chorobotwórczymi z grupy drobnoustrojów

jelitowych, które należą do tej samej rodziny,

co pałeczka okrężnicy

Do oznaczania miana coli stosuje się płynne

pożywki wybiórcze. Dodatek pewnych związków,

takich jak fiolet krystaliczny czy zieleń brylantowa,

hamuje wzrost pozostałych bakterii głównie gram-

dodatnich. Selektywność pożywki zwiększa dodatek

kwasów żółciowych. Obecność pałeczek z grupy coli

stwierdza się na podstawie wytworzonego z laktozy

gazu w trakcie fermentacji. Hodowlę prowadzi się w

temperaturze 37oC przez 24-48 godzin. Oznaczenie

miana coli metodą probówkowo-fermentacyjną daje

wyniki orientacyjne. Dlatego też w razie wyników

dodatnich lub wątpliwych stosuje się badania

potwierdzające. Próby dodatnie i wątpliwe

przesiewa się na podłoża wybiórcze które

umożliwiają dalszą identyfikację pałeczek z grupy

okrężnicy.

Miano enterokoków

Enterokoki, głównie gatunki Enterococcus faecalis

i Enterococcus faecium, występują podobnie jak

Escherichia coli, w przewodzie pokarmowym ludzi

i zwierząt. Ich obecność w żywności świadczy o

zakażeniu kałowym. W odróżnieniu od pałeczek z

grupy coli, enterokoki odznaczają się większą

odpornością na działanie czynników

środowiskowych i charakteryzują się znacznie

dłuższym okresem przeżywania. Nadmierna ilość

enterokoków w produktach spożywczych może

być przyczyną zatruć pokarmowych. Większość

metod stosowanych do ich wykrycia wykorzystuje

azydek sodowy jako czynnik selektywny. Posiewu

dokonuje się podobnie jak przy oznaczeniu miana

coli. O wyniku dodatnim świadczy, oprócz

zmętnienia, zmiana barwy podłoża.

Miano beztlenowców

Oznaczenie beztlenowców, szczególnie ich

komórek, jest trudne z uwagi na konieczność

przestrzegania warunków ściśle beztlenowych.

Jak dotąd nie ma uniwersalnej metody

ilościowego oznaczania bakterii beztlenowych.

Jako podłoża stosuje się zarówno pożywki stałe,

jak i płynne. Bardzo często jest to podłoże

Wrzoska. Wynik dodatni wymaga potwierdzenia

badaniem mikroskopowym lub posiewem na

podłoże selektywne.

Próba reduktazowa

Próba reduktazowa, stosowana w ocenie mleka

surowego i pasteryzowanego, pozwala na ocenę

jego jakości i ilości zawartych w nim bakterii. Próba

reduktazowa jest oparta na oznaczeniu momentu

wyczerpania tlenu rozpuszczonego w mleku przez

bakterie. Czas, w jakim tlen zostanie zużyty, zależy

od ilości, rodzaju i aktywności rozwijających się

drobnoustrojów. Po zużyciu tlenu funkcję akceptora

wodoru pełni dodany barwnik (błękit metylenowy,

resazuryna). Błękit metylenowy w wyniku zmiany

potencjału oksydoredukcyjnego środowiska

przechodzi z formy barwnej w postać bezbarwną.

Do bakterii zużywających tlen należą przede

wszystkim bakterie mlekowe oraz pałeczki z grupy

coli.

Wykrywanie

Wykrywanie

drobnoustrojów

drobnoustrojów

wywołujących psucie

wywołujących psucie

żywności

żywności

Mikroorganizmy te można wykryć

Mikroorganizmy te można wykryć

wykorzystując standardowe

wykorzystując standardowe

podłoża i wprowadzając tylko

podłoża i wprowadzając tylko

niekiedy pewne selektywne

niekiedy pewne selektywne

czynniki lub zmianę np. warunków

czynniki lub zmianę np. warunków

hodowli.

hodowli.

►

►

Pleśnie i drożdże rosną dobrze na brzeczce słodowej oraz na

Pleśnie i drożdże rosną dobrze na brzeczce słodowej oraz na

podłożach zawierających ekstrakt drożdżowy, o pH 5,0-6,0.

podłożach zawierających ekstrakt drożdżowy, o pH 5,0-6,0.

►Dla grzybów rosnących przy pH bliskim obojętnemu wprowadza się

►Dla grzybów rosnących przy pH bliskim obojętnemu wprowadza się

do podłoża NaCl w ilości 6-7% lub antybiotyki czy inne związki w celu

do podłoża NaCl w ilości 6-7% lub antybiotyki czy inne związki w celu

zahamowania rozwoju szybciej rosnących bakterii,

zahamowania rozwoju szybciej rosnących bakterii,

uniemożliwiających swobodny rozwój grzybów.

uniemożliwiających swobodny rozwój grzybów.

►Do oznaczania laseczek przetrwalnikujących bakterii tlenowych z

►Do oznaczania laseczek przetrwalnikujących bakterii tlenowych z

rodzaju

rodzaju

Bacillus

Bacillus

stosuje się podłoża standardowe.

stosuje się podłoża standardowe.

►Laseczki beztlenowe z rodzaju

►Laseczki beztlenowe z rodzaju

Clostridium

Clostridium

wymagają warunków

wymagają warunków

beztlenowych (oznacza się ich miano)

beztlenowych (oznacza się ich miano)

►Laseczki redukujące siarczyny wykrywa się na podłożu Wilson-

►Laseczki redukujące siarczyny wykrywa się na podłożu Wilson-

Blaira (tworzą charakterystyczne czarne kolonie)

Blaira (tworzą charakterystyczne czarne kolonie)

►Bakterie fermentacji mlekowej, zarówno pałeczki, jak i ziarniaki,

►Bakterie fermentacji mlekowej, zarówno pałeczki, jak i ziarniaki,

mają duże wymagania odżywcze. Do ich wykrywania stosuje się

mają duże wymagania odżywcze. Do ich wykrywania stosuje się

najczęściej podłoże De Mana-MRS. Często przeprowadza się badania

najczęściej podłoże De Mana-MRS. Często przeprowadza się badania

w kierunku drobnoustrojów o określonych uzdolnieniach

w kierunku drobnoustrojów o określonych uzdolnieniach

enzymatycznych: proteolitycznych, amylolitycznych, lipolitycznych i

enzymatycznych: proteolitycznych, amylolitycznych, lipolitycznych i

innych.

innych.

►Do wykrywania drobnoustrojów proteolitycznych wykorzystuje się

►Do wykrywania drobnoustrojów proteolitycznych wykorzystuje się

żelatynę i kazeinę. Bakterie rozkładające kazeinę powodują powstanie

żelatynę i kazeinę. Bakterie rozkładające kazeinę powodują powstanie

przeźroczystej obwódki wokół kolonii, a rozkładające żelatynę-

przeźroczystej obwódki wokół kolonii, a rozkładające żelatynę-

upłynnienie podłoża.

upłynnienie podłoża.

Wykrywanie

Wykrywanie

drobnoustrojów

drobnoustrojów

wywołujących zatrucia

wywołujących zatrucia

pokarmowe

pokarmowe

Metody wykrywania mikroorganizmów

Metody wykrywania mikroorganizmów

wywołujących zatrucia pokarmowe są

wywołujących zatrucia pokarmowe są

zazwyczaj długie i wieloetapowe.

zazwyczaj długie i wieloetapowe.

►

►

Izolacja bakterii z rodzaju

Izolacja bakterii z rodzaju

Salmonella

Salmonella

jest

jest

złożoną analizą, wymagającą podłoży

złożoną analizą, wymagającą podłoży

selektywnych, namnażających (zazwyczaj stosuje

selektywnych, namnażających (zazwyczaj stosuje

się równolegle dwa podłoża wybiórcze – z

się równolegle dwa podłoża wybiórcze – z

seleninem sodowym i czterotionianem sodu).

seleninem sodowym i czterotionianem sodu).

Następnie po inkubacji hodowlę rozsiewa się

Następnie po inkubacji hodowlę rozsiewa się

powierzchniowo na płytki z co najmniej dwoma

powierzchniowo na płytki z co najmniej dwoma

pdłożami wybiórczymi (SS, MacConkey’a), a

pdłożami wybiórczymi (SS, MacConkey’a), a

następnie wykonuje testy biochemiczne i

następnie wykonuje testy biochemiczne i

serologiczne podejrzanych kolonii, potwierdzając

serologiczne podejrzanych kolonii, potwierdzając

ich przynależność do rodzaju

ich przynależność do rodzaju

Salmonella

Salmonella

.

.

►

►

Wykrywanie gronkowców chorobotwórczych

Wykrywanie gronkowców chorobotwórczych

(

(

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus

) wykonuje się w dwóch

) wykonuje się w dwóch

kierunkach. Pierwszy to oznaczanie ich obecności lub

kierunkach. Pierwszy to oznaczanie ich obecności lub

liczby, drugi to badanie obecności enterotoksyny w

liczby, drugi to badanie obecności enterotoksyny w

żywności. Najbardziej przydatnym podłożem wybiórczym

żywności. Najbardziej przydatnym podłożem wybiórczym

jest podłoże Baird-Parkera. Badany materiał posiewa się

jest podłoże Baird-Parkera. Badany materiał posiewa się

na podłoże Giollitti-Cantoni, w przypadku wzrostu i

na podłoże Giollitti-Cantoni, w przypadku wzrostu i

obecności czarnego osadu lub sczernienia podłoża

obecności czarnego osadu lub sczernienia podłoża

posiewa się na podłoże Baird-Parkera. Gronkowce rosną

posiewa się na podłoże Baird-Parkera. Gronkowce rosną

tworząc kolonie o czarnej barwie, otoczone strefą

tworząc kolonie o czarnej barwie, otoczone strefą

przejaśnienia. Obecność gronkowców należy potwierdzić

przejaśnienia. Obecność gronkowców należy potwierdzić

dalszymi testami.

dalszymi testami.

►Wykrywanie pozostałych grup drobnoustrojów

►Wykrywanie pozostałych grup drobnoustrojów

chorobotwórczych, rozwijających się na żywności,

chorobotwórczych, rozwijających się na żywności,

dotyczy tylko kreślonych grup produktów, a badania

dotyczy tylko kreślonych grup produktów, a badania

przeprowadza się w przypadku żywności podejrzanej.

przeprowadza się w przypadku żywności podejrzanej.