Komórki dendrytyczne –

subpopulacje i

oznaczanie za pomoca

cytometrii przepływowej

dr n. med. Jacek Tabarkiewicz
([e-mail])

KOMÓRKI
DENDRYTYCZNE

Profesjonalne komórki prezentujące antygen,

rozmieszczone

w większości tkanek organizmu

Zaangażowane w większość oddziaływań
miedzykomórkowych

• rozpoczynają odpowiedź komórkową, stymulując
limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne
• pobudzają odpowiedź humoralną i produkcję
przeciwciał
• wspomagają funkcję komórek odporności nieswoistej
• zapewniają tolerancję immunologiczną

Scharakteryzowane na podstawie kształtu,
lokalizacji,
panelu antygenów powierzchniowych oraz cech
funkcjonalnych,

Odkryte w 1868 r. przez Langerhansa na podstawie
reakcji z solami złota

WĘDRÓWKA KOMÓREK DENDRYTYCZNYCH W

LUDZKIM ORGANIZMIE

SZPIK

KOSTNY

PREKURSORY

TKANKI

NIEDOJRZAŁE DCs - „wartownicy
spokoju immunologicznego”

NACZYNIA

LIMFATYCZNE

DOPROWADZAJĄCE

DOJRZEWAJĄCE DCs
po kontakcie z antygenem

NARZĄDY LIMFATYCZNE

DOJRZAŁE DCs

KRĄŻENIE

KREW

PREKURSORY -
NIEDOJRZAŁE
MIELO-
I LIMFOIDALNE
DCs

SZPIK
KOSTNY

HSC

(HEMATOPOETYCZNA

KOMÓRKA PNIA)

CMP

(common mieloid

progenitor)

CLP

(common lymphoid

progenitor)

CD34, CD45RA, CD10,
IL7R

CD34, CD33, CD11c

MIELOIDALNE

DCs

LIMFOIDALNE

DCs

KRĄŻENIE

CD1c -
CD4 +
CD11c -
CD33 -
CD45RA +
CD123(IL-3R)
+
BDCA2 +
BDCA4 +
BDCA3 –
CMRF58 –

CD1c -

CD4 +/-

CD11c +/-

CD33 +/-

CD45RA -

CD123(IL-3R) -

BDCA2 –
BDCA4 –

BDCA3 +

CMRF58 +

CD1c +

CD4 +/-

CD11c +

CD33 +

CD45RA -

CD123(IL-3R) -

BDCA2 –
BDCA4 –
BDCA3 –

CMRF58 –

Immunofenoty

p

Limfoidalne/

plazmocytoidal

ne

Mieloidalne

Mieloidalne

Immunology Today Vol.21 No. 9 Sep. 2000

Subpopulacje a

immunofenotyp komórek

dendrytycznych

Subpopulacje a immunofenotyp

komórek dendrytycznych

wydzielanie IL-12++++

wydzielanie IL-10 +/-

stymulacja CD4 ++++
stymulacja CD8 ++++

interakcja z limfocytami B +

Wydzielanie IL-12++++

wydzielanie IL-10++++

stymulacja CD4 ++++

stymulacja CD8 +++

interakcja z limfocytami B ++++

wydzielanie IL-12 +/-

wydzielanie IL-10 -

stymulacja CD4 ++
stymulacja CD8 ++

interakcja z limfocytami B ?

Funkcja

strefy grasiczozależne węzłów

chłonnych,

prekursory we krwi,

niedojrzałe komórki w

epithelium

w narządach limfatycznych w obszarach

zajmowanych przez limfocyty T i ośrodkach

rozmnażania (GCDCs),

prekusory we krwi,

niedojrzałe komórki w miąższu różnych

narządów (płuca, serce, nerki)

w narządach limfatycznych w

obszarach zajmowanych przez

limfocyty T,

prekusory we krwi

Lokalizacja

CD11c+
IL3R-
MHC-II+
CD11b+
CD13+
CD33+
CD4+
CD1a+
CD86+
CD40+
DC-LAMP+
ziarnistości Birbecka+
langeryna+

CD11c+
IL3R-
MHC-II+
CD11b+
CD13+
CD33+
CD4+
CD1a-
CD86+
CD40+
DC-LAMP+
Ziarnistości Birbecka-
langeryna-

CD11c-
IL3R+
MHC-II+
CD11b-
CD13-
CD33-
CD4++
CD1a-
CD86+
CD40+
DC-LAMP+
ziarnistości Birbecka-
langeryna-

Fenotyp dojrzałych

komórek

dendrytycznych

-

-

++++

Produkcja IFNα

przez krążące

prekursory

CD11c+,CD1a+, IL3R-

CD11c+CD1a+IL3R-

CD11c-CD1a-IL3R+(CD123+)

Fenotyp krążących

komórek

prekursorowych

Pochodzące z LC

Intersticjalne

Mieloidalne komórki dendrytyczne

Limfoidalne

komórki

dendrytyczne

TRENDS in Immunology Vol.22 No. 1 jan. 2001

PREKURSOR

Y SZPIKOWE

NIEDOJRZAŁE

DCs

FcγRI

FcγRII

CD68
CCR1
CCR4
CCR5

CXCR4

WELONOWATE

DCs

CD80

CD83

CD86

CCR7

DOJRZAŁE

DCs

CD54, CD58

CD80, CD86

CD83, CD40L

DC-LAMP

CCR7

ZMIANA FENOTYPU KOMÓREK

DENDRYTYCZNYCH W TRAKCIE DOJRZEWANIA

Metoda oznaczanie komórek

dendrytycznych jako komórki

Lin-/CD11c+/HLA-DR+

lub

Lin-/CD123+/HLA-DR+

• Stosujemy koktajl następujących przeciwciał

sprzężonych z FITC: CD3, CD14, CD16, CD19,
CD20, CD56 – które znakują nam limfocyty,
monocyty, neutrofile i eozynofile – komórki
Lin+

Metoda z użyciem koktajlu przeciwciał

monoklonalnych

• 1. Dla oznaczenia mieloidalnych DC używa się

przeciwciał monoklonalnych: anty-CD14, anty-

CD16 FITC, anty-CD33 PE oraz anty-HLA-DR

CyChrome. Za mieloidalne komórki dendrytyczne

uznaje się komórki o immunofenotypie CD14-,

CD16-/CD33+, HLA-DR+.

• 2. Dla oznaczenia limfoidalnych DC używa się

przeciwciał monoklonalnych: anty-CD3, anty-

CD11c, anty-CD14, anty-CD16, anty-CD19 FITC,

anty-CD4 PE oraz anty-HLA-DR CyChrome. Za

limfoidalne DC uznaje się komórki o

immunofenotypie CD3-, CD11c-, CD14-, CD16-,

CD19-/CD4+, HLA-DR+

Mieloidalne DC:

CD16-,CD14-/CD33+,HLA-DR+

R1

R2

Mieloidalne DC:

CD16-,CD14-/CD33+/HLA-DR+

R3

R3=0.18%

R1

R2

R3

Limfoidalne DC:

CD3-,CD11c-,CD14-,CD16-,CD19-/CD4+/HLA-

DR+

R1

R2

Limfoidalne DC:

CD3-,CD11c-,CD14-,CD16-,CD19-/CD4+,HLA-

DR+

R3

R3=0.10%

Oznaczanie krążących komórek

dendrytycznych za pomocą przeciwciał

anty-BDCA

firmy Miltenyi Biotec

Do

oznaczenia

komórek

dendrytycznych

lini

mieloidalnej używa się przeciwciał anty-CD19 i anty-
BDCA-1 (CD1c). Komórki o immunofenotypie
CD19- i BDCA-1+ odpowiadają mieloidalnym DC.
Komórki

BDCA-1+

wykazujà

ekspresję

nastepujących antygenów: CD4+, Lin-, CD11c

bright

,

CD123

dim

, CD45RO+, CD2+, CD13+, CD33+, CD32+,

CD64+ oraz HLA-DR+.
Stanowią średnio ok. 0,3% leukocytów krwi
obwodowej.

Oznaczanie krążących komórek

dendrytycznych za pomocą przeciwciał

anty-BDCA

firmy Miltenyi Biotec

Do oznaczenia komórek dendrytycznych linii
limfoidalnej/plazmacytoidalnej

używa

się

przeciwciał anty BDCA-2 (CD303) i CD123.
Limfoidalnym

DC

odpowiadają

komórki

o

immunofenotypie BDCA-2+ i CD123+. Komórki
BDCA-2+ wykazują ekspresję CD4+, Lin-, CD11c-,
CD123

bright

, CD45RA+, CD2-,CD13-, CD33-, CD32-,

CD64- oraz HLA-DR+
Stanowią średnio ok. 0,4% leukocytów krwi
obwodowej.

Oznaczanie krążących komórek

dendrytycznych za pomocą przeciwciał

anty-BDCA

firmy Miltenyi Biotec

Do oznaczenia kolejnej subpopulacji komórek
dendrytycznych linii mieloidalnej można użyć
przeciwciał anty BDCA-3 i CD14 PE. Komórki te
wykazują następujący immunofenotyp CD4+, Lin-,
CD11c dim, CD123-, CD45RO+ and CD2-, CD13,
CD33. Nie wykazują ekspresji receptorów Fc:
CD32, CD64 i FcεRI.
BDCA-3 może występować w niskiej ekspresji na
monocytach, plazmocytoidalnych DC: BDCA-2+
BDCA-4+ i także komórkach CD1c (BDCA-1)+.
Stanowią średnio ok. 0,02% leukocytów krwi
obwodowej.

Oznaczanie krążących komórek

dendrytycznych za pomocą przeciwciał

anty-BDCA

firmy Miltenyi Biotec

Do oznaczenia kolejnej subpopulacji komórek
dendrytycznych linii limfoidalnej można użyć
przeciwciał anty BDCA-4 (CD304/Neuropilin-1)
FITC i CD123 PE. Odpowiadają komórki o
immunofenotypie BDCA-4+ i CD123+. Komórki
BDCA-4+ wykazują immunofenotyp: CD4+, Lin-,
CD11c-, CD123bright, CD45RA+, CD2-, łańcuch α
pre-TCR i BDCA-2+.
Ich ilość we krwi obwodowej jest zbliżona do
komórek BDCA-2+ (CD303)+.

BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+

komórki dendrytyczne – krew

obwodowa

R1

R2

R2

R1

R2

R2

BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+

komórki dendrytyczne – zapalny płyn

stawowy (MIZS)

BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+

komórki dendrytyczne – przerzutowe węzły

chlonne (rak płuca)

R1

R2

R2

BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+

komórki dendrytyczne – tkanka

nowotworowa

(rak płuca)

R1

R2

R2

BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+

komórki dendrytyczne – płyn opłucnowy

(rak płuca z przerzutami do opłucnej)

R1

R2

R2

BDCA3+\CD14- i BDCA-4+\CD123+ komórki

dendrytyczne krew obwodowa

R2

R2

R2

R2

Problemy z interpretacją wyników

Kliniczne zastosowanie szczepionek z

DCs

Nowotwór Ilość prób klinicznych

Chłoniak

2

Szpiczak

9

Białaczki

8

Czerniak

21

R. piersi

12

R. jajowodu

1

R. pęcherza

1

R. pęcherza

26

R. nerki

18

Guzy z ekspresją CEA 1
R. przytarczyc

1

R. tarczycy

3

R. przełyku

1

R. żołądka

2

R. j. cienkiego

2

R. j. grubego

10

R. wątroby

4

R. płuca

7

R. trzustki

8

Nowotwory U.N.

11

R. Nosogardzieli

1

Różne

2

HIV

4

HBV

1

Wykorzystanie szczepionek z

DCs w innych schorzeniach

Choroby autoimmunizacyjne

Infekcje wirusowe

Infekcje bakteryjne

Choroby pasożytnicze

Choroby alergiczne

W immunoterapii używamy najczęściej

komórek dendrytycznych wygenerowanych

z monocytów krwi obwodowej.

Do ich immunofenotypowania używamy

najczęściej przeciwciał anty: CD14, CD45,

CD1a, CD83, CD80, CD86, HLA-DR.

R2

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

• W całej procedurze używamy buforu

do DC składającego się z PBS (bez
jonów Ca

2+

i Mg

2+)

wzbogaconego

0,5% BSA i 2mM EDTA

.

• Używamy chłodnego buforu, a

inkubację i płukanie
przeprowadzamy w 4C

• Zawieszamy 10x10

7

komórek

w 80l buforu

• Dodajemy 20l FcR Blocking

Reagent

• Dodajemy 10l przeciwciał anty-

BDCA-1 lub anty BDCA-2

• Przeprowadzamy 10 min

inkubacje w 4C

• Dodajemy odpowiednie ilości

pozostałych przeciwciał

• Dodajemy 1-2ml buforu na każde

10x107 komórek i wirujemy
przez 10 min. z przyśpieszeniem
300xg w temperaturze 4C

• Zlewamy supernatant i

przeprowadzamy analizę
cytometryczną

Do powstania prezentacji

przyczynili się:

• mgr Sebastian Radej
• dr n. med. Agata Surdacka
• mgr Magdalena Wasiuk
• mgr paulina Wdowiak
• dr n. med.. Kamila Wojas-

Krawczyk