Niedobory odporności związane z zaburzeniami czynności komórek żernych i cytotoksycznych

1. Wrodzone neutropenie: cykliczna neutropenia, ciężkie wrodzone neutropenie, zespół Shawmana – Diamonda.

2. Przewlekła choroba ziarniniakowa.

3. Zespół Chediaka – Higashiego.

4. Niedobory cząsteczek adhezyjnych (LAD1,2,3)

5. Niedobory związane ze szlakiem Il- 12, i INF – γ.

6. Niedobory składników dopełniacza.

7. Metody umożliwiające ocenę potencjału fagocytarnego (Bursitest, Fagotest) i cytotoksycznego (test z chromem, LDH i
MTT).

Ad. 1

Ciężkie wrodzone neutropenie (SCN – severe congenital neutropenia)

- heterogenna grupa chorób o

wspólnym fenotypie klinicznym i hematologicznym, charakteryzująca się zahamowaniem rozwoju
prekursorów neutrofilów w szpiku na etapie promielocyta/ mielocyta z liczbą krążących neutrofilów
mniejszą niż 0,5 G/l i licznymi objawowymi infekcjami.

SCN1 (AD):

mutacje genu ELANE (najczęściej mutacje typu missense w 4/5 eksonie) – 50-60%

przypadków, gen koduje elastazę neutrofilową (proteaza serynowa syntezowana w retikulum
endoplazmatycznym i magazynowana w pierwotnych ziarnistościach promielocyta); mutacja w tym
genie wiąże się ze stresem ER czyli komórkowym mechanizmem odpowiedzi na niesfałdowane
białka (UPR – unfolded protein response); w wyniku mutacji ELANE powstają nieprawidłowo
sfałdowane białka elastazy neutrofilowej, których obecność wywołuje apoptozę przez poprzez UPR;
w komórkach linii mieloidalnej ze zmutowanym genem ELANE wykrywano zwiększoną ilość białka
chaperonowego BiP – klasycznego markera aktywacji UPR. Najbardziej wyrażoną aktywację UPR
obserwowano w przypadku Gly185Arg – pacjenci Ci wymagają leczenie znacząco większymi
dawkami G-CSF, zwiększone jest też ryzyko zespołów mielodysplastycznych, ostrej białaczki
szpikowej,

SCN2(AD)

: mutacja genu dla czynnika transkrypcyjnego GFI1, objawia się monocytozą, neutropenią

SCN3(AR)

: homozygotyczne mutacje HAX1, zespół Kostmanna; autosomalna recesywna SCN, gen

HAX1 koduje białko mitochondrialne o działaniu antyapoptycznym zbliżonym do BCL-2; odgrywa
ono kluczową rolę w utrzymaniu potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej; mutacje
powodują pojawienie się kodonu stop bądź zmianę ramki odczytu. Neutrofile pozbawione białka
HAX1 nie utrzymują prawidłowego potencjału wenątrznej błony mitochondrialnej i ulegają
apoptozie, neutropeni towarzyszą zaburzenia neurologiczne – od opóźnienia psychoruchoego do

ciężkiej padaczki (głownie izoforma B białka HAX1; mutacje w izoformie A ograniczają się do
cieżkiej neutropenii)

SCN4(AR):

mutacja genu kodującego podjednostkę katalityczną 3 glukozo- 6- fosfatazy; objawia się

wadami układu serowo- naczyniowego, moczowo- płciowego, niskorosłością, widocznymi żyłami
powierzchniowymi.

Cykliczne neutropenie (CN) – także związane najczęściej z mutacją genu ELANE – mutacje
intronowe w regionach składania, powodujące powstawanie wariantów splicingowych, istotą
choroby są regularne oscylacje liczby neutrofilów – powtarzające się klasycznie co 21 dni epizody
granulocytopenii trwającej 3-5 dni, po których następuje powrót liczby neutrofilów do normy;
przebieg łagodniejszy niż w SCN – nautropenia szczególnie jawna w okresie dzieciństwa, lecz
infekcje przemijają wraz z samoistym wzrostem liczby neutrofilów, wraz z wiekiem spada
amplituda oscylacji liczby neutrofilów – słabsze nasilenie objawów; chorzy lepiej odpowiadają na
leczenie niż SCN. Niektóre fenotypy CN może też powodować mutacja genu GFI1.

Zespół Schwachmana – Diamonda (AR)

– wrodzona neutropenia niezwiązana z hipopigmentacją;

mutacja genu SBDS; objawia się niewydolnością egzokrynną trzustki, niskorosłością, wadami
szkieletu, niedokrwistością, trombocytopenią.

Większość osób z zespołem

Shwachman Diamond przechodzi sporadyczne epizody neutropenii, co sprawia, że są one bardziej
podatne na infekcje, takie jak zapalenie płuc, nawracające infekcje ucha (zapalenie ucha
ś

rodkowego) i zakażenia skóry. Neutropenia sprzyja także próchnicy i chorobom przyzębia.

Ad. 2

Przewlekła choroba ziarniniakowa

– chorobę powoduje defekt wytwarzania przez komórki żerne

reaktywnych utleniaczy o właściwościach toksycznych. Wywarzanie wolnych rodników tlenowych
odbywa się z udziałem oksydazy NADPH. Enzym składa się z kompleksu flawoproteiny i cytochromu
b

-558

, który przenosi elektrony na atom tlenu – powstaje anion ponadtlenkowy. Aktywacja oksydazy

NADPH wymaga fosforylacji i przyłączenia dwóch białek o masie cząsteczkowej 67kDa i 47kDa
znajdujących sie w cytoplazmie (p67 – phox i p47-phox) oraz niskocząsteczkowego białka
wiążącego GTP (rac-1 lub rac-2). Około 60% chorych nie ma podjednostki 91kDa cytochromu b

-558

(mutacja na chromosomie X), u 30% za chorobę odpowiada brak białka cytoplazmatycznego
47kDa, rzadziej nie wykrywa się białka p67-phox lub błonowej podjednostki 22kDa cytochromu;
upośledzone wytwarzanie toksycznych związków tlenowych występuje również u chorych z
niedoborem dehydrogenazy – 6 fosforanu; chorzy wykazują zwiększoną podatność na zakażenia
drobnoustrojami wytwarzającymi katalazę (S. aureus). Niedostateczna degradacja i eliminacja

składników bakterii sprawia, że długotrwałe utrzymuje się ich działanie chemotaktyczne na komórki
ż

erne; migrujące do miejsca reakcji maktofagi tworzą ziarniniaki; leczenie INF – γ, bądź transfekcją

genu p47-phox.

Ad. 3

Zespół Chediaka – Higashiego

– wywołany defektem, który dziedziczy się jako cecha AR - mutacja w

genie CHS; chorzy wykazują zaburzenia pigmentacji (albinizm), skłonność do nawracających
ropnych zakażeń i nacieków limfocytowych w narządach. Neutrofile mają charakterystyczne
lizosomy, natomiast nie znajduje się w nich ziaren azurochłonnych; neutrofile wykazują liczne
defekty: upośledzenie chemotaksji, zaburzenia powstawania fagolizosomu i zmniejszoną
cytotoksyczność. W ziarnach stwierdzono zmniejszenie aktywności proteaz – elastazy i katepsyny G.
Olbrzymie lizosomy obecne są również w komórkach NK. Aktywność cytotoksyczna tych komórek
jest zmniejszona i nie ulega zwiększeniu pod wpływem IL-2 i INF – γ. Badanie szpiku wykazuje
obecność dojrzałych neutrofilów ( w odróżnieniu od SCN), neutropenia występuje okresowo.

Ad4.

Niedobory cząsteczek adhezyjnych (LAD1,2,3) - AR

Typu I:

przyczyną jest mutacja genu dla łańcucha β wspólnego dla wszystkich integryn β2 (CD18).

Z łańcuchem tym mogą wiązać się cztery łańcuchy α: αL (CD11a), αM (CD11b), αX(DC11c) i
α

D(CD11d). Integryna CD11a/CD18 jest najczęściej nazywana antygenem związanym z funkcją

leukocytów (LFA-1), ważne są także CD11b/CD18 (CR3) oraz CD11c/CD18 (CR4). Ligandem dla
integryny LFA-1 są molekuły ICAM-1 śródbłonka. Brak ekspresji cząsteczek adhezyjnych na błonie
komórek żernych utrudnia przyleganie do komórek śródbłonka. Granulocyty nie potrafią
przedostawać się do ogniska zapalenia, gdzie znajdują się drobnoustroje. Charakterystyczny dla
tego niedoboru jest brak niedoboru wydzieliny ropnej, która powstaje w miejscu zakażenia w
wyniku działania enzymów granulocytów na bakterie i tkanki gospodarza. Obniżona ekspresja
receptorów CR3 i CR4 dla składnika iC3b dopełniacza znacznie zmniejsza zdolność do fagocytozy
drobnoustrojów, które uległy opsonizacji. Chorzy cierpią na nawracające zakażenia bakteryjne i
grzybicze przy stale podwyższonej liczbie granulocytów we krwi.

Typu II

– brak sialyl – Lewis X (CD15s) (ligand dla E i P- selektyn na śródbłonku), chorzy wykazują

też fenotyp Bombay, Selektyna P (CD62P) bierze udział we wczesnych etapach toczenia się;
selektyna E (CD62E) -

Podstawową funkcją pełnioną przez selektynę E jest przejście leukocytów z

etapu toczenia się do ścisłej adhezji po aktywacji komórki. Dzieje się tak, gdyż selektyna E może
spowalniać ruch komórek toczących się po śródbłonku. Gdy prędkość tego ruchu jest zbyt duża,
komórka mimo aktywacji może w ogóle nie mieć szans na zmianę kształtu i przylgnięcie do
ś

ródbłonka, nim dojdzie do miejsca żyłki, w którym zanikają selektyny, integryny i chemokiny.

Typu III

– mutacja w genie KINDLIN3, co zapobiega aktywacji integryn β-1, -2, -3 na leukocytach i

płytkach.

5. Niedobory związane ze szlakiem Il- 12, i INF – γ.

Defekty osi IL-12/INFγ stanowią przykład niedoboru odporności, który prowadzi do znacznie

zwiększonej podatności na infekcje mykobakteryjne przy zachowanej odporności w stosunku do
innych drobnoustrojów. Defekty osi IL-12/INFγ (interleukina-12/interferon gamma) dotyczące
zarówno niedostatecznej produkcji tych cytokin lub braku ekspresji receptorów tego szlaku są
przykładem takiego niedoboru.

Pierwszym etapem odpowiedzi immunologicznej na zakażenie prątkami jest ich fagocytoza przez

makrofagi. Pobudzone makrofagi produkują cytokiny: m.in. IL-12 (heterodimer zbudowany z
cząsteczek IL-12p40 i IL-12p35) i TNFα (tumor necrosing factor alfa). IL-12 pobudza limfocyty T i
komórki NK poprzez receptory dla IL-12 (IL-12Rbeta1 i IL-12Rbeta2). W odpowiedzi na stymulację
limfocyty T CD4

+

i NK aktywnie wydzielają IFNγ. IFNγ wiąże się z receptorem o wysokim

powinowactwie INF-R1, prowadząc do dimeryzacji podjednostek receptora INF-R1 i INF-R2. Kolejno
dochodzi do fosforylacji kinaz JAK 1 i JAK2 (Janus kinase). Aktywne kinazy JAK fosforylują reszty
tyrozynowe na części cytoplazmatycznej receptora interferonowego. To powoduje przyłączenie się
białek STAT i ich fosforylację. Ufosforylowane białka STAT dimeryzują na powierzchni cytoplazmy.
Następnie dochodzi do ich translokacji do jądra, gdzie biorą udział w regulacji ekspresji genów.
Powoduje to transkrypcję genów zależnych od INFγ. Jednym z efektów jest produkcja TNFα co
sprzyja rozwojowi ziarniny zapalnej i ograniczeniu zakażenia, zwiększenie ekspresji antygenów
zgodności tkankowej na powierzchni makrofagów tkankowych oraz do indukcji syntezy enzymów
lizosomalnych, a tym samym zwiększenia zdolności wewnątrzkomórkowego zabijania prątków
(rycina 1) [1].

Defekty osi IL-12/INFγ mogą dotyczyć ekspresji receptorów dla interferonu tj. INFγ-R1, INFγ-R2,

receptora dla IL-12 : IL-12beta1, IL-12beta2, STAT1, NEMO.

6.

Niedobory składników dopełniacza.

a)niedobory składników wczesnych etapów klasycznej drogi aktywacji dopełniacza

Brak składników C1, C2 i C4 uniemożliwiają uruchomienie drogi klasycznej, natomiast jest zachowana aktywacja
dopełniacza drogą alternatywną, chociaż sam proces przebiega wolniej. Poważnemu zaburzeniu ulega mechanizm
neutralizacji i usuwana szkodliwych kompleksów antygen – przeciwciało. Brak wymienionych mechanizmów usuwania
kompleksów sprzyja rozwojowi chorób autoimmunizacyjnych, tj. kłębuszkowe zapalenie nerek, toczeń układowy
rumieniowaty, zapalenie skórno – mięśniowe i inne. Ponadto chorzy wykazują objawy niedoboru odporności pod postacią
zwiększonej częstości zakażeń, wywołanych głównie bakteriami mającymi otoczkę (S. pneumoniae, Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae)

Brak inhibitora czynnika C1, który oprócz hamowania drogi klasycznej współdziała z elementami układu kinin, plazminy i
krzepnięcia (hamuje plazminę, kalikreinę i aktywny czynnik XII), wiąże się z nagłym rozwojem obrzęków (obrzęk
naczynioruchowy Qiunckego). Wdiagnostyce trzeba oprócz oznaczenia inh. C1 w surowicy oznaczyć składnik C4, gdyz
jego stężenie jest obniżone, ze względu na destruktywne działanie niehamowanego C1.

b) niedobory składników alternatywnej drogi
aktywacji dopełniacza

– brak czynników H i I

znosi naturalny mechanizm zapobiegający
spontanicznej aktywacji drogi alternatywnej.
Niedobór properdyny lub czynnika D
uniemożliwia uruchomienie alternatywnej drogi
dopełniacza. U chorych dochodzi często do
uogólnionego zakażenia Neisseria meningitidis,
częstość chorób autoimmunizacyjnych nie
zwiększa się.

c) niedobór C3

– składnik C3 zajmuje strategiczną

pozycję na szlaku klasycznej i alternatywnej
aktywacji szlaku dopełniacza. Jego niedobór

powoduje zahamowanie mechanizmów odpowiedzi swoistej i nieswoistej. Utrudnienie eliminacji
kompleksów immunologicznych sprzyja postawaniu chorób autoimmunizacyjnych, ujawnia się
zwiększona podatność na zakażenia – nawracające zakażenia bakteriami otoczkowymi.

d) niedobory składników końcowej drogi dopełniacza (składowe C5-8, C9

) – defekty jednego ze

składników końcowej drogi aktywacji dopełniacza uniemożliwia powstanie kompleksu atakującego
błonę. Tym samym nie zachodzi działanie lityczne układu dopełniacza na komórki. Typowym
objawem klinicznym u chorych tej grupy są nawracające zakażenia dwoinką zapalenia opon (N.
meningitidis), które pojawiają sie w wieku kilkunastu lat. Chorzy z niedoborem C5 wykazują

dodatkowo zaburzenia chemotaksji granulocytów.

7) Metody umożliwiające ocenę potencjału fagocytarnego (Bursitest, Fagotest) i cytotoksycznego (test z chromem, LDH i
MTT).

1.

Bursstest

służy do badania ilościowego aktywności wybuchu tlenowego monocytów i granulocytów w heparynizowanej

krwi pełnej.

Do próby testowej podajemy zawiesinę nieznakowanych bakterii E. coli poddanych opsonizacji; do próby stanowiącej
negatywną kontrolę dodajemy roztwór do płukania; do słabej próby kontrolnej dodajemy rozcieńczony roztór zawierający
chemotaktyczny peptyd fMLP (słaby stymulator wybuchu tlenowego), do silnej próby kontrolnej dodajemy PMA – silny
stymulator wybuchu tlenowego. Następnie inkubacja 37 i dodanie substratu (Substrat Disc) i znowu inkubowano --->
liza erytrocytów --> inkubacja+ wirowanie ---> roztwór barwiący DNA (warunki jak w Phagotest)---> pomiar
cytometryczny – oznaczenie odsetka granulocytów i monocytów, które wytworzyły reaktywne rodniki tlenowe a także
skaźnik aktywności metabolicznej komórek (pomiar średniej logarytmicznej wartości fluorescencji komórek wykazujących
wybuch tlenowy).

2

. Phagotest

służy do ilościowego badania aktywności fagocytarnej.

0,1 ml próby badanej dodajemy 0,02ml znakowaną FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) zawiesinę poddanych opsonizacji,
wstrząśnięciu i schłodzeniu bakterii E.coli (0

o

C) --> mieszamy w wytrząsarce przez 10min w T=37

o

C( łaźnia wodna,

próby kontolne w lodzie) ---> do prób badanych dodajemy roztwór oziębiający i wkładamy je do lodu, w celu
zahamowania fagocytozy ---> mieszanie, płukanie ---> inkubacja z roztworem do lizy erytrocytów ---> wirowanie,
płukanie---> dodajemy roztwór barwiący DNA ---> mieszanie, inkubacja 0 stopni przez 10 min bez dostępu światła ---
> pomiary cytometryczne – oznaczamy ilość granulocytów i monocytów wykazujących fagocytozę oraz intensywność
fagocytozy poprzez ocenę ilości sfagocytowanych bakterii (pomiar średniej logarytmicznej wartości fluorescencji
fagocytujących komórek)

3. Test z chromem