Mgr Kamila Gala

Klinika Immunologii Transplantologii i

Chorób Wewnętrznych

RODZAJE BADAŃ:



Badania jakościowe



potwierdzenie lub wykluczenie obecności określonego
składnika



Badania ilościowe



pozwalają na wiarygodne określenie ilości poszczególnych
składników występujących w materiale biologicznym

METODY SPEKTROSKOPOWE



Zasada:



Wykorzystują efekty oddziaływania promieniowania
elektromagnetycznego o różnej długości fali na próbkę



Metoda polega na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji
lub odbicia światła



Techniki:



Spektroskopia absorbcyjna



spektrofotometria (VIS, UV, IR), kolorymetria



Analiza spektralna emisyjna



absorpcja atomowa, fluorymetria, turbidymetria, nefelometria,
refraktometria, polarymetria

SPEKTROFOTOMETRIA VIS (KOLORYMETRIA)



Etapy:



Otrzymanie barwnego połączenia



Pomiar absorbancji w świetle o odpowiedniej długości fali



Wykorzystanie:



Wapń całkowity



Fosforany



Magnez



Żelazo w surowicy



Glukoza (z oksydazą glukozową)



Białko całkowite w surowicy



Albuminy w surowicy



Fosfataza zasadowa

METODY ROZDZIELCZE



Stosowane do rozdziału substancji



Rodzaje:



Wirowanie



Umożliwia wyodrębnienie cząstek stałych z płynnej zawiesiny



Chromatografia



Rozdzielanie mieszanin substancji na poszczególne składniki, bądź

ich grupy, dzięki różnicom w zachowaniu się tych składników w

układzie dwóch faz, w których jedna nie zmienia swego położenia

(

faza nieruchoma, stacjonarna

), druga zaś porusza się względem

pierwszej w określonym kierunku (faza ruchoma, roztwór

rozwijający)



Elektroforeza



Metoda rozdziału cząsteczek obdarzonych ładunkiem elektrycznym,

które poruszają się pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego

w kierunku jednej z elektrod

WIROWANIE



Podstawowa metoda separacji materiału

biologicznego ( np. surowicy krwi)



Siła wirowania jest zwielokrotnieniem oddziaływania

przyspieszenia ziemskiego i zależy od trzech

czynników:



Masy



Prędkości



Promienia rotora

CHROMATOGRAFIA



Podział ze względu na właściwości podłoża:



jonowymienna, adsorpcyjna, podziałowa,

powinowactwa, sączenie molekularne



Podział ze względu na stosowane ciśnienie:



nisko-, średnio- i wysoko- ciśnieniowa



Podział ze względu na stosowany nośnik:



gazowa, cieczowa



Podział ze względu na rodzaj podłoża:



kolumnowa, kapilarna, cienkowarstwowa, bibułowa

CHROMATOGRAFIA

Techniki zautomatyzowane:



Chromatografia gazowa:



Oznaczanie związków toksycznych (np. alkaloidy),



Monitorowanie stężenia leków



Chromatografia gazowa połączona ze

spektrometrem gazowym:



amfetamina, kokaina, polichlorowane bifenyle



Wysokorozdzielcza chromatografia cieczowa

(HPLC):



aminokwasy, hormony, katecholaminy, witaminy, leki



Chromatografia cienkowarstwowa:



alkaloidy, barbiturany, pochodne fenodiazepiny

ELEKTROFOREZA ŻELOWA:



Zasada:



Ośrodkiem jest żel elektroforetyczny (agarozowy,

poliakrylamidowy) zanurzony w przewodzącym prąd

roztworze buforowym



Wzdłuż krawędzi żelu biegną elektrody, do których

przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie

elektryczne (50-3000 V)



Po zakończeniu procesu żel analizuje przez wybarwienie

lub obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV)



Wykorzystanie:



Identyfikacja i oznaczanie, lipoprotein, przeciwciał,

kwasów nukleinowych



Oznaczanie białek surowicy krwi: proteinogram



Wykrywanie, diagnozowanie i kontrola leczenia

przypadków związanych z obecnością nieprawidłowych

bia

bia

ł

ł

ek,

ek, np. szpiczaka mnogiego

METODY ELEKTROCHEMICZNE



Podstawą metod są zjawiska zachodzące na

elektrodach pod wpływem prądu płynącego przez

badaną substancję lub jej roztwór



Techniki:



Potencjometria



Konduktometria



Polarografia

POTENCJOMETRIA



Zasada:



Wykorzystuje zależność między aktywnością

oznaczanego jonu w roztworze, a potencjałem

elektrycznym elektrody



Praktycznie wyznacza się stężenie oznaczanego

składnika na podstawie SEM ogniwa utworzonego

z elektrody wzorcowej i pomiarowej



Zastosowanie:



Oznaczanie jonów: Ca

2+,

Na

+

, K

+

, F

-

, Cl

-

, Br

-

, pH

roztworów

METODY KONDUKTOMETRYCZNE



Zasada:



Pomiar zmian przewodnictwa elektrycznego
roztworu, co daje możliwość wyznaczenia zmiany
stężenia roztworu



Wykorzystanie:



Oznaczanie liczby erytrocytów i płytek,
hematokryt, MCV

METODY IMMUNOCHEMICZNE:



Zasada:



Reakcja antygenu ze swoistym przeciwciałem w wyniku

czego powstaje kompleks antygen-przeciwciało



Służą do wykrywania przeciwciał i antygenów



Rodzaje:



Metody radioimmunologiczne (RIA)



Metody immunoenzymatyczne (EIA; w tym ELISA)



Metody immunofluorescencyjne (FIA)



Metoda immunochemiluminescencyjne (LIA lub CMIA)

METODY IMMUNOCHEMICZNE:

Nazwa metody

Materiał do analizy

Testy immunodiagnostyczne
(immunoassay)

Surowica i osocze krwi, płyny wysiękowe
(np. z jamy stawowej), płyn z opłucnej, płyn
mózgowo- rdzeniowy, mocz, ślina

Immunocytochemia (komórki)

Komórki

Immunohistochemia

Tkanki, biopaty

Hybrydocytochemia

DNA lub RNA preparatów mikroskopowych

Bloting, bloting in situ

Homogenat materiału tkankowego lub
komórek, tkanki

Etapy:

+

1. Reakcja przeciwciała z odpowiednim antygenem

2. Technika analityczna służąca do określenia ilości

wytworzonego produktu reakcji (ilościowa lub jakościowa)

kompleks

antygen-przeciwciało

METODY IMMUNOCHEMICZNE

Zastosowanie:



Diagnostyka zakażeń wywołanych przez drobnoustroje, np.
Salmonella, Yersinia, Listeria



Wykrywanie przeciwciał przeciw wirusom, np. anty-HBc, anty- HBe,
VCA-EBV IgM, VCA-EBV IgG



Wykrywanie przeciwciał na drożdżaki, amebozy, malarię,
toksoplazmozę



Wykrywanie bakteryjnych toksyn np. toksyny cholery,
toksynyenteropatogennych szczepów E. coli, enterotoksyny
Staphylococcus aureus, wirusów: rotawirusy, Hepatitis wirus,
Parainfluensae wirus



Oznaczanie stężenia w białek, hormonów w materiale biologicznym

METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ



Reakcja łańcuchowej polimerazy- PCR



Hybrydyzacja kwasów nukleinowych



Sekwencjonowanie



Mikromacierze

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY - PCR

•

Umożliwia uzyskanie dużej liczby kopii
danej sekwencji DNA

•

Konieczna jest znajomość sekwencji
krótkich odcinków DNA po każdej
stronie sekwencji przeznaczonej do
powielenia (

startery

)

•

Etapy cyklu reakcji PCR:

•

denaturacja

•

hybrydyzacja

•

elongacja

•

Liczba cykli jest uzależniona od
wymaganej krotności powielenia
wyjściowego DNA

ANALIZA ZA POMOCĄ REAKCJI PCR

1.

Izolacja materiału, np. DNA z krwi

3.

Reakcja PCR

4.

Rozdział produktu reakcji PCR

na żelu agarozowym i wizualizacja
w świetle UV

2.

Sporządzenie mieszaniny reakcyjnej

REAL-TIME PCR

PCR W CZASIE RZECZYWISTYM

•

Wykorzystuje techniki fluorescencyjne

•

Pozwala na monitorowanie ilości produktu reakcji w każdym
cyklu prowadzonej reakcji PCR

•

Procedura analizy jest stosunkowo szybka

•

Umożliwia wgląd w kinetykę reakcji

•

Pozwala na oszacowanie ilości produktu na początku reakcji

•

Ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest minimalne

WYKORZYSTANIE



Diagnostyka mikrobiologiczna:



Wykrywanie materiału genetycznego czynników zakaźnych,
np. DNA HBV, DNA CMV, RNA HCV,

Mycobacterium

tuberculosis



Identyfikacja podtypów drobnoustroju: genotypowanie HCV



Ocena masywności zakażenia (np. wiremia)



Diagnostyka onkologiczna:



Wykrywanie swoistych dla danego nowotworu zmian
genetycznych, np. BCR/ABL



Ocena właściwości komórek nowotworowych



Diagnostyka genetyczna:



Diagnostyka dystrofii mięśniowej



Oznaczanie RHD płodu w osoczu matki RHD (-)