Ćwiczenie

T: Ocena wrażliwości bakterii na antybiotyki

1) Metoda krążkowo-dyfuzyjna
2) Metoda rozcieoczeniowa

a) w bulionie Műllera-Hintona
b) w agarze Műllera-Hintona

3) MIC

Antybiotyki – produkty metabolizmu drobnoustrojów działające w sposób wybiórczy bakteriobójczo lub
bakteriostatycznie w niskich stężeniach.
Chemioterapeutyki – leki przeciwdrobnoustrojowe uzyskane za pomocą syntezy chemicznej, nie mające swojego
odpowiednika w substancjach produkowanych przez organizmy żywe.

1) Metoda krążkowo dyfuzyjna

a) przygotowanie wyjściowej zawiesiny komórek bakteryjnych (monokultury)

Należy przygotowad taką zawiesinę, aby w 1 ml znajdowało się 10

5

– 10

6

komórek bakteryjnych. W tym

celu 24-godzinną hodowlę bakteryjną rozcieocza się w płynnym jałowym podłożu M-H w następujący
sposób:



dla G(-) pałeczek 1:10000



dla gronkowców 1:1000



dla paciorkowców 1:100 (1:10)
Przykład: w celu otrzymania zawiesiny wyjściowej gronkowców pobieramy 1 ml z 24-godzinnej
płynnej zawiesiny i rozcieoczamy w 9 ml bulionu M-H (powstaje zawiesina 1:10). Następnie z
otrzymanego rozcieoczenia pobieramy także 1 ml i rozpuszczamy w 9 ml M-H (powstaje
zawiesina 1:100). Z powstałego rozcieoczenia pobieramy 1ml i dodajemy do 9 ml M-H
otrzymując koocowe rozcieoczenie 1:1000.

Różne wartości rozcieoczeo dla różnych organizmów wynikają z ich naturalnego tempa podziałów
komórkowych, a więc z liczebności komórek w 24-godzinnej hodowli.
Opcjonalnie można wykonad zawiesinę komórek mającą 0,5 w skali McFarlanda.

b) 0,1 ml odpowiednio rozcieoczonej zawiesiny bakteryjnej nanosimy na podłoże stałe (agar Műllera-

Hintona), a następnie rozprowadzamy po całym podłożu zgiętą bagietką – „hokejówką”.

c) Na podłoże wykładamy 2 lub 3 krążki bibułowe nasycone antybiotykami. Każdy krążek jest odpowiednio

oznaczony i zawiera jeden rodzaj antybiotyku. Krążki muszą byd ułożone co najmniej 2 cm od brzegu
szalki Petriego i 2cm od siebie nawzajem

d) Podłoże z krążkami następnie inkubujemy przez 24 h w temperaturze 37°C
e) Antybiotyk dyfunduje do podłoża. W miejscu, gdzie w podłożu jest odpowiednie stężenie antybiotyku i

szczep jest na niego wrażliwy powstaje strefa zahamowanego wzrostu.

f) Mierzymy średnicę strefy zahamowanego wzrostu wokół każdego krążka bibułowego. Porównujemy z

danymi podanymi przez producenta aby stwierdzid wrażliwośd, średnią opornośd lub opornośd badanego
szczepu bakteryjnego.

Bulion/agar Műllera-Hintona:



hydrolizat kazeiny



wyciąg mięsny



skrobia



agar 2% (opcjonalnie)



brak NaCl oraz glukozy, które mogą ograniczad działanie niekt. antybiotyków

Podłoże zapewnia wszystkie składniki odżywcze oraz jest izoosmotyczne względem komórek bakteryjnych. Nie
zawiera jednak NaCl ani glukozy.

2) Metoda rozcieoczeniowa

a) w bulionie M-H



Sporządzamy rozcieoczenia antybiotyku w probówkach w podłożu płynnym. Rozcieoczenia
wykonuje się w postępie geometrycznym tzn. każda kolejna próbówka zawiera antybiotyk o
dwukrotnie niższym stężeniu.



Do każdej probówki dodajemy taką samą objętośd zawiesiny bakteryjnej zawierającej 10

5

-10

6

komórek (1 ml).



Inkubujemy 24h w temp 37°C.



Odczytujemy wynik i określamy MIC

W części probówek obserwujemy wzrost, a reszta jest klarowna. Na podstawie tych obserwacji odczytujemy MIC.
MIC (minimal inhibition concentration) – najniższe stężenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustrojów.

Wartośd MIC porównujemy ze średnim osiągalnym stężeniem antybiotyku w surowicy krwi przy optymalnej dawce
dziennej. Dane te są podane przez producenta. Jeżeli MIC jest większe od średniego osiągalnego stężenia w surowicy
to antybiotyk jest w takim przypadku bezskuteczny w leczeniu.

b) w agarze M-H



Przygotowujemy szereg rozcieoczeo antybiotyku w postępie geometrycznym podobnie jak w
przypadku metody rozcieoczeniowej w bulionie M-H. Różnica polega na tym, że stężenia
antybiotyku są 10 x wyższe niż koocowe stężenia jakie chcemy uzyskad. Takie podejście stosuje
się dlatego, że antybiotyk zostanie następnie rozcieoczony przez agar M-H.



Na szereg płytek Petriego wylewamy po 1ml zawiesiny antybiotyku o odpowiednim stężeniu, a
następnie zalewamy 10 ml podłoża M-H ostudzonego do 42°C. Do jednej płytki nie dodajemy
antybiotyku – będzie to płytka kontrolna



Kiedy agar ulegnie zestaleniu posiewamy badany szczep bakteryjny w postaci paska (lub większą
liczbę szczepów – wtedy dzielimy płytkę na sektory)



Inkubujemy 24h w 37°C



Odczytujemy wynik i określamy MIC

Jeżeli we wszystkich probówkach lub szalkach Petriego rosną bakterie to znaczy, że są oporne na dany szczep
bakteryjny.