ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 4

Wykład 4

09.03

Klonowanie wektorów bazujących na fagu λ

Przed skonstuowaniem tych wektorów trzeba było roz-

wiązać dwa problemy:

wielkość – istnieją pewne granice wielkości czą-

•

steczek, jakie mogą być pakowane we wnętrzu główki

faga (3 kb – 52 kb)

miejsca restrykcyjne – enzymy restrykcyjne tną

•

cząsteczkę w wielu miejscach i staje się ona bezuży-

teczna, chociaż enzymy restrykcyjne są uznawane za

unikatowe.

pEMBL8: wektor hybrydowy (fagemid)

→ Posiada zalety M13, ale jednocześnie pozwala

na wklonowanie dłuższych fragmentów.

wektor jest hybrydą faga i plazmidu (w tym przy-

•

padku faga M13 i typowego plazmidu, np z serii PUC)

posiada oporność na ampicylinę (amp), miejsce

•

ori, lacZ’ (jak w każdym plazmidzie)

fragment DNA M13 – zawiera wszystkie sekwencje

•

potrzebne do tego, aby mogła powstać pojedyncza nić

Kiedy potrzebujemy otrzymać DNA w postaci poje-

dynczej nici (w formie kolistej), wtedy komórki, które

posiadają dany plazmid muszą być zakażone fagiem

pomocniczym. Fag pomocniczy dostarcza wszystkich

białek potrzebnych do tego, aby na matrycy fagemi-

dowej mogła rozpocząć sę synteza pojedynczej nici

DNA. Fag pomocniczy jest tak skonstruowany, że jego

DNA nie podlega replikacji i mapowaniu w białkach

osłonkowych, które również dostarcza.

pEMBL8

fragment

DNA M13

3997 bp

amp

lacZ’

M13

region

Dwuniciowe

pEMBL8

Konwersja pEMBL8 do jednoniciowego DNA

Pierwszy problem rozwiązano za pomocą znajomo-

ści genomu faga λ – geny są pogrupowane i szczęśliwie

okazało się, że w środkowej części znajdują się geny,

które są zbędne dla faga o funkcji wektora

Wczesna regulacja

Liza gos

podarza

Synteza DNA

możliwość usunięcia do 15 kb, a zatem insert

•

może mieć do 18 kb

zostaje wycięty fragment odpowiedzialny za

•

możliwość istnienia faga w formie litycznej

Drugi problem rozwiązano posługując się selekcją

naturalną. Infekowano E. Coli szczepem dzikim faga

λ. Zauważono, że po pewnym czasie liczba miejsc re-

strykcyjnych się zmniejsza – fag się uodparnia, nastę-

pują naturalne mutacje. Następnie infekowano komórki

fagiem λ o zmniejszonej ilości miejsc restrykcyjnych

aż do uzyskania faga λ, którego DNA nie ulega prze-

cięciu.

Rodzaje wektorów faga λ:

wektory inserycjne

•

wektory zastępcze

•

Wektor insercyjny

krótszy fragment

•

jedno miejsce restrykcyjne

•

λgt10

zostało wygenerowane miejsce EcoR1 do klono-

•

wania

dokładnie znana długość wektora (40 kb)

•

selekcja rekombinantów polega na zmianie feno-

•

typu łysinek (miejsce klonowania jest zlokalizowane

w obrębie genu kodującego λ represor)

Normalne DNA

(49 kb)

wektor insercyjny

(35–40 kb)

gt10

Delecja

Eco RI

40 kb

λ2APII

podobna długość wektora

•

selekcja polega na selkcji biało-niebieskiej (lacZ’)

•

lacZ’

ZAPII

Delecja

41 kb

Wektory zastępcze

dwa miejsca restrykcyjne

•

w miejsca Stuffer’a wchodzi nowe DNA

•

Cosmid

Nowe DNA, do 23 kb

SBR

RBS

fragment

Nowe DNA

Restrykcja, ligacja

Eco RI, Bam HI, Sal I

lub kombinacja

R = Eco RI B = Bam HI S = S al I

Dlaczego nie można skorzystać z pierwszej metody?

Po usunięciu miejsc Stuffer’a i samoligacji otrzy-

mamy fragmenty krótsze niż 3 kb. Dlatego w miejsce

Stuffera musi wejść nowe DNA.

λEMBL4

może przyjmować bardzo duże nowe fragmenty

•

DNA (23 kb)

selekcja przez wielkość lub fenotyp SPI

•

Po co jest potrzebny Stuffer?

Do otrzymania wektora w dostatecznej ilości do

klonowania (bez Stuffera nie mógłby się namnażać, bo

byłby za krótki)
W jaki sposób klonujemy przy użyciu wektorów faga λ

Klonowanie przy użyciu kolistego λ DNA (rzadko)

•

Klonowanie przy użyciu liniowego DNA λ

•

Eco RI

Eco RI, ligacja

– forma cykliczna

cos

Transfekcja

do E. coli

Rekombinant

Nowe DNA

Eco RI

Nowe DNA

cos

Katenany

Infekowanie E. coli

mieszanka reakcji

pakowania in vitro

Rekombinant

Ligate

długość jest określona przez miejsca cos (zatem okre-

ślają one upakowanie).

Bam HI

ori

cos

Typowy cosmid

pJB8

5.4 kb

DNA

amp

plazmid, który zawiera sekwencję faga λ i miejsce cos

•

względnie duży

•

pozwala na klonowanie fragmentów ponad 40 kb

•

otrzymujemy duże fragmenty DNA zmodyfiko-

•

wanego faga λ, ale z niego jest jedynie fragment cos oraz

białka osłonkowe, cała reszta jest rekombinowana

co jest jeszcze ważne: komórka nie ulega lizie!

•

Podsumowanie: najkrótsze są wektory M13, potem

wektory plazmidowe (8 kb), wektory faga λ (20 kb),

wektory cosmidowe (40 kb)

Można oszacować ilość klonów, aby gen wystąpił

z dobrej strony z prawdopodobieństwem.

Bam HI

cos

Kolisty

pJB8

Restrykcja

Bam HI

cos

Liniowe pJB8

Bam HI

Bam HI Bam HI

Bam HI

Nowe DNA

Nowe

DNA

Ligacja

Paczka in vitro

Rekombinowane

DNA cosmidu

Infekcja E. coli

Katenany

amp

N = ln(1 p)

ln 1

a
b

(

)

N – liczba klonów

P – prawdopodobieństwo wystąpienia każdego genu

a – średnia wielkość fragmentu

b – całkowita wielkość genomu

W jaki sposób znaleźć konkretny klon w bibliotece

genów?

Potrzeba znalezienia wektorów, które przenoszą

większe fragmenty (o tym będzie mowa później)

Problem selekcji: jeśli chcemy otrzymać bibliotekę,

to DNA przed otrzymaniem biblioteki zwykle ulega

fragmentacji. Mamy w bibliotece kolekcję fragmentów

DNA w poszczególnych klonach. W jednym z klonów

jest poszukiwana informacja.

Selekcja bezpośrednia

Jest prowadzona już na etapie hodowli komórek, przeży-

wają tylko te, które mają być wyselekcjonowane.

wygodna i skuteczna

•

Różne sposoby fragmentacji DNA

mechaniczne (np. ultradźwiękami powodujemy

•

pękanie DNA)

trawienie DNA enzymem restrykcyjnym (wy-

•

czerujące trawienie) polega na dodaniu takiej ilości

enzymu, że wszystkie miejsca ulegają restrykcji). Cza-

sem mogą powstać zbyt krótkie fragmenty nie ligujące

z wektorem – częśći DNA trawione.

lepsza metoda: Trawienie niewyczerpujące.

•

Otrzymujemy fragmenty których DNA się powtarzają,

ale sekwencje mają być różne.

Następnie przeprowadza się elektroforezę, wybiera

framenty o konkretnych dłgościach i liguje z wekto-

rem. Czy nie odrzucimy zatem części istotnego mate-

riału? Otóż nie!
Jak zredukować ilość materiału genetycznego, która

jest nam zbędna?

→ do tego służy biblioteka cDNA – odpowiada in-

formacji jaka ulega ekspresji w komórce (nie zawiera

całej informacji genetycznej).

LEU2

- brak leucyny

amp

tet

Klony E. coli

Transformacja

E. coli

Samozligowany

wektor

rekombinant

Selekcja pośrednia

Musimy zidentyfikować klon w bibliotece genów.

Przykład: Plazmid R6-5

•

Posiada oporność na działanie kalamicyny.

Doświadczenie: plazmid trawiony enzymem re-

strykcyjnym, który nie trawi interesującego nas genu

oporności na kanamicynę (EcoRI). Ligujemy strawione

fragmenty z wektorem pBR322 i wysiewamy na pod-

łoże selekcyjne z kanamicyną. Pozostają tylko klony

posiadające gen oporności na kan

Szczep auksotroficzny w odniesieniu do Trp

•

(wymaga obecności Trp w pożywce)

Doświadczenie: Dysponujemy szczepem E. Coli,

który jest zmutowany pod {...}
{...} gen za to odpowiedzialny?

Konstruujemy bibliotekę szczepu dzikiego E. Coli.

Trawimy DNA bakterii i otrzymujemy fragmenty

z oraz bez genu, zwane TrpA. Ligujemy do wektora

i transformujemy komórki. Następnie wysiewamy je na

podłoże bez Trp. Przeżyją tylko rekombinanty TrpA+.

Używana również w komórkach drożdżowych.

Praktyczne aspekty tworzenia bibliotek

Rozróżniamy biblioteki genomowe oraz biblioteki cDNA.

Biblioteka genomowa zawiera całą informację

•

genetyczną właściwą danemu organizmowi.

Jak powstaje? DNA poddawany jest fragmentacji

•

i fragmenty o określonej długości są wybierane i ligo-

wane z wektorem.

Komórka typu A

Komórka typu B

Geny ciche

Różne geny są ekspresjonowane w różnych typach

komórek. Część genów nie ulega ekspresji konstytu-

tywnej tylko od czasu do czasu.

Ogólnie bibiloteka cDNA zawiera informacje o trans-

kryptach. Każdy gen posiada wiele transkryptów, a za-

tem biblioteka cDNA jest dużo bardziej złożona.

Zakłada się często, że transkrypty posiadają {...}

Do transkryptu jest hybrydyzowana sonda, starter

który jest poliogonem T, komplementarny do poliogo-

na A. Cząsteczki RNA są niestabilne, więc biblioteka

transkryptów jest przetwarzana na DNA. Po przyłącze-

niu startera z ogonem poli(T) używana jest odwrotna

transkryptaza (korzystając z matrycy RNA syntezuje

DNA). Zsyntezowana nić DNA nosi nazwę pierwszej

nici cDNA (komplementarny DNA). Ta cząsteczka

również jest nietrwała. Potrzebujemy nić dsDNA. Mu-

simy usunąć nić RNA. Używamy do tego RNazyH1

(RNaza, która hydrolizuje RNA, brak większej specy-

ficzności). RNA ulega fragmentacji. Pozostają tylko

krótkie fragmenty połączone oddziaływaniami Watso-

na Cricka. Następnie używamy polimerazy DNA typu

I (może korzystać ze starterów, które są RNA i może

syntezować nić komplementarną), która wykorzystu-

je pozostałe fragmenty RNA. Polimeraza ta posiada

trzy aktywności: (1) polimerazową, (2) korekcyjną,

(3) nukleazową. Otrzymujemy ostatecznie cząsteczkę

dsDNA. Następnie już ligacja z wektorem i transfor-

macja komórek. Jest to biblioteka, która zawiera tylko

sekwencje kodujące białek, które pojawiają się w da-

nym momencie w komórce.

Bardzo istotny jest dobór komórek, które powinny

być wyspecjalizowane w syntezie białek (konkretnych).

Identyfikacja klonu (metody pośrednie)

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych (oddziały-

•

wania Watsona-Cricka)

Do jakich metod może być użyty tyen izotop fosforu

w pozycji d

→ do znakowania w translacji NIC (polimeraza

DNA I, która wykorzystuje aktywność 5’→3’ nukle-

azową). Musimy dysponować cząsteczką DNA,która

ma szereg pęknięć.

Można również zaznakować końce cząsteczki DNA

(tak zwane wypełnianie końców), używając fragmen-

tów Klenowa.

Znakowanie przy użyciu starterów o przypadko-

wych sekwencjach. Jako substrat wykorzystujemy

cząsteczkę dsDNA, która jest następnie denaturowa-

na. W roztworze są obecne również krótkie oligonu-

kleotydy (heksomeryczne), w różnym nadmiarze. Przy

obniżaniu temperatury, oligonkuleotydy będą hybrydy-

zowały przypadkowo i tylko te, które są komplemen-

tarne. Pełnią funkcję starterów i są używane przez frag-

ment Klenowa. Dostaniemy zatem kolekcję cząsteczek

komplementarnych do danej cząsteczki DNA. Będą

one znakowane radioaktywnie (otrzymamy sondy, któ-

re posłużą do przeszukania biblioteki).

Niestabilna hybryda

Stabilna hybryda

A zatem musimy dysponować sondą, która jest do-

statecznie stabilna.

Hybryda DNA-RNA (rybosonda)

•

Otrzymujemy replikę gotową do właściwego proce-

su hybrydyzacji. Eksperyment hybrydyzacji polega na

tym, że w roztworze zamieszczamy ten filtr mikrocelu-

lozowy z immobilizowanym DNA, a w roztworze znaj-

duje się sonda znakowana radioaktywnie. Sonda wiąże

się z DNA: wiązania niespecyficzne są bardzo słabe,

zaś wiązania specyficzne bardzo mocne. Nadmiar son-

dy jest odmywany (sonda wiązana niespecyficznie jest

usuwana). Replika jest suszona, następnie przykładany

jest film rentgenowski, który pod wpływem promie-

niowania jonizującego ulega zaczernieniu (zaczernie-

nie ukazuje sondy związane z DNA. Porówanie płytki

z koloniami {...}

Substratem do znakowania DNA jest dNTP. Taki

znacznik zawiera izotop fosforu (P

), który znajduje

się w pozycji α. (Do znakowania zaś końców 5’ stoso-

wany jest ATP ze znakowaniem w pozycji γ i ta reszta

jest przenoszona przez kinazę T4 na 5’ koniec).

Sonda ze znakowanym DNA

Bakterie

Zasada

+ proteaza

DNA

Niesparowane zasady

Film rentgenowski

Przemycie

* ** ****

****

Hybryda DNA-RNA

DNA

RNA

Membrana

nitrocelulozowa/nylonowa

Bakterie przyczepione

do membrany