Mikrobiologia przemysłowa ćw 12

BIOSYNTEZA KWASU CYTRYNOWEGO

Charakterystyka kw. cytrynowego:

-

trójkarboksylowy

-

M = 192 g

-

T topnienia = 150 st. C

-

Wyizolowany po raz pierwszy z cytryn (zawierają 7 – 9 % kwasu cytrynowego)

-

Produkowany w niewielkich ilościach przez wszystkie organizmy żywe (powstaje w
cyklu Krebsa = cyklu kwasu cytrynowego)

-

Posiada walory organoleptyczne – dobry smak, ładny zapach

-

80% produkcji kw. cytrynowego zużywana w przemyśle spożywczym

-

dobra rozpuszczalność w wodzie

-

mała toksyczność (może być dodawany do produktów spożywczych w
nielimitowanych ilościach)

-

produkcja głównie we Włoszech (z 40 kg cytryn – 1 kg kwasu)

-

jest to metabolit pierwotny!!!

Metody mikrobiologiczne – pierwszy raz zastosowane w Belgii, w latach 20 XX wieku
Metody chemiczne – są mało opłacalne finansowo. Zbyt złożony proces biosyntezy, mała
wydajność.

PRODUCENCI kw. cytrynowego (produkujący go w większej ilości niż zwyczajne
organizmy)

-

pewne gatunki pleśni, głównie z rodzaju Aspergillus (jako substrat : cukier)

o

Aspergillus niger

o

Aspergillus wenti

o

Penicillum luteum

o

Trichoderma viridae

-

Drożdże z rodzaju Candida

o

Candida tropicalis

o

Candida lipolytica

– badana potem przez Yarrowa – który odkrył szczep

zdplny do procesu płciowego i nazwał go Yarrowia lipolytica (jako substartu
wymaga n – alkanów lub n-parafin)

-

Bakterie z rodzaju Arthrobacter

Głównie wykorzystywany jest Asergillus niger. Dlaczego?

-

powszechny w przyrodzie, występuje w glebie, wodzie, na owocach

-

szczepy do produkcji łatwo pozyskać ze środowiska naturalnego

-

kwas cytrynowy – jest zw. pierwotnych, produkowanym w niewielkich ilościach

Pobieranie i przygotowanie:

-

izolacja

-

ulepszanie szczepu : dwie możliwości : (mutageneza lub rekombinacja)

o

aktywacja przez mutagenezę (metodami fizycznymi – UV, chemicznymi lub
kombinacja obu )

Mikrobiologia przemysłowa ćw 12

selekcja szczepu po działaniu czynnika mutagennego według

warunków, w jakich będziemy potem prowadzić hodowlę

mutanty głównie w poszczególnych enzymach z cyklu przemian,

otrzymamy szczep z zaburzonymi szlakami metabolicznymi

• 1. dehydrogenaza akonitynowa
• 2. dehydrogenaza izocytrynianowa
• 3. dehydrogenaza 2 –ketoglutaranowa

o

rekombinacja genetyczna (wykorzystanie cyklu paraseksualnego) na drodze
fuzjo protoplastów. Mogą być też fuzje między różnymi rodzinami (np. A.
Niger

z Trichoderma). Fuzjant otrzyma :

od Aspergillus – duża wydajność procesu produkcji kwasu

od Trichoderma : nie jest czuły na obecność glukozy (normalne

działanie : produkcja kw. cytrynowego – powstają analogi glukozy –
hamują produkcje kw. cytrynowego)

CECHY DOBREGO SZCZEPU PRZEMYSŁOWEGO
-

nie patogenny (ale Aspergillus jest /może być patogenny, powoduje tzw. aspergilozę –
ale przy zbyt częstym kontakcie przy jednocześnie obniżonej odporności organizmu)

-

niskie koszty (w sensie składu podłoża) – łatwo pozyskiwalne i łatwo dostępne
surowce

-

wysoka wydajność procesu syntezy przy niezbyt obfitym wytwarzaniu grzybni

-

duża stabilność genetyczna szczepu

o

odpowiednie przechowywanie (stosowania liofilizacja)

o

przechowywanie konidiów w jałowych pojemn. z cytrynianem wapnia

o

otrzymywanie konidiów w odpowiedni sposób (pożywki sporulacyjne)

-

nie wytwarzać / wytwarzanie w niewielkich ilościach inne kwasy organiczne (np.
szczawiooctan – obniżają one wydajność produkcji)

BIOSYNTEZA
Działają dwa szlaki –

-

EMP (glikoliza) (głównie gdy grzybnia jest w fazie stacjonarnej)

-

Lub / i pentozofosforanowy (dominuje przy intensywnym rozwoju grzybni)

Szybkość biotransformacji reguluje fosfofruktokinaza (jednocześnie reguluje glikolizę i
biotransformację kwasu cytrynowego), hamowana jest przez cytrynian i ATP (więc jest
korzystne ich „obejście” w mutagenezie) czyli poprzez skład podłoża (parametr) możemy
manipulować aby zahamować / wzmocnić działalność enzymów.

Hodowla na odpowiedniej pożywce wyłączającej dehydrogenazy :

-

dla dh. Akonitowej : deficyt jonów manganu i żelaza

-

dla dh. Izocytrynianowej : wysokie stężenie cytrynianu

-

dla dh. 2 – ketoglutaranowej : wysokie stężenie cukrów i jonów amonu

Cykl glioksolowy – reakcje pomocnicze, wzmacniające (prowadzi do powstania m.in.
szczawiooctanu – metabolit bezpośredni cytrynianu)

Mikrobiologia przemysłowa ćw 12

METODY PRODUKCJI

1. powierzchowna LSF (liquid surface fermentation)

Stosowane płytkie tace jako kadzie (taca o odpowiednio napowietrzonej, jałowej
komorze), inokulum to konidia, wzrost 2-3 dni, potem synteza w odp. Warstwie grzybni
stykajacej się z pożywką. Fermentacja trwa 8 –9 dni, Aspergillus rośnie jako zwarta grupa
komórek, w postaci kożucha (na powierzchni zarodnikuje – czarne konidia).
Wady : duze prawdopodobieństwo zanieczyszczenia hodowli (mimo jałowosci powietrza
np. zakażenie gatunkiem Penicilium – które hydrolizują grzybnię, możliwa obecność
bakterii Bacillus, E. Coli w melasie )

2. wgłębna SmF (submerged fermentation)

Efektywniejsza. Stosowane duże fermentory wypełnione pożywką. Grzybnia jest rozbita –
występuje w postaci grudek / strzępek (dzięki ciągłemu mieszaniu przez turbiny, lub
systemowi napowietrzania air lift), tak, że są zawieszone w obrębie pożywki. Bioreaktory
są zautomatyzowane, jako substrat stosowana Sacharoza. Aspergillus rośnie w całej
pożywce równomiernie.
Problemem jest dość trudne oddzielenie kwasu cytrynowego od biomasy.
Spływ pofermentacyjny : najpierw oddzieleni grzybni (w małych ilościach – np. u nas na
ć

wiczeniach przesączenie) proces wieloetapowego strącania (dodanie Ca(OH)2 –

otrzymujemy strącony cytrynian wapnia. Dodajemy to do kwasu siarkowego
(przeprowadza kwas cytrynowy z osadu do roztworu), przeprowadzamy filtrację ). Przy
okazji powstaje nam gips – CaSO4, ale niestety nie jest na tyle czysty, by mógł być użyty
– wymaga oczyszczenia.

Mikrobiologia przemysłowa ćw 12

3. na stałych pożywkach SSF (solid state fermentation)

w ten sposób produkuje się 20 % kwasu cytrynowego w Japonii (500 ton). Ekologiczna –
jako substrat stosowane odpady głównie z przemysłu spożywczego, cukrowni (np.
otręby). Wymaga 70 % wilgotności, proces fermentacji trwa 90 h, niska wydajność, kwas
oddziela się od podłoża przez ekstrakcję z ciepłą wodą.

PROWADZENIE HODOWLI

-

ź

ródło węgla i energii to cukry (stężenie 10 –22 % w zależności od szczepu

Aspergillusa

i wybranej metody)

o

przy metodzie powierzchniowej – melasa buraczana (produkt odpadowy,).
Wady : melasa może być zanieczyszczona bakteriami które mogą hamować
proces stymulując enzymy (co w met. Powierzchownej nie przeszkadza)

o

Metoda wgłębna – sacharoza ( melasa hamuje wydajność)

-

kwasowość pożywki (2, 3 pH), powyżej 3 wydajność spada, produkowane są inne
kwasy

-

eliminacja jonów metali, głównie Fe, Zn, Mn (np. dodając żelazocjanek potasowy
stymulujemy syntezę kwasu cytrynowego i wzrost grzybni)

-

niskie stężenie soli fosforanowych i amonowych

-

intensywne napowietrzanie podłoża

ZASTOSOWANIE KWASU CYTRYNOWEGO

-

przemysł spożywczy (jako E330)

o

regulator kwasowości (produkcja cukierków, różnych słodyczy, owoców
kandyzowanych, napojów)

o

antyutleniacz

(inaktywator

oksydaz

–

hamuje

utlenianie

kwasów

tłuszczowych, zapobiega psuciu się żywności)

o

dżemy, marmolady, galaretki, miód sztuczny

o

stabilizacja barwy, smaku i zapachu produktów przechowywanych w chłodni
(ryby, owoce morza, warzywa)

o

wino

-

przemysł farmaceutyczny

o

w preparatach krwi, aby zapobiec krzepnięciu, wytwarza cytrynian trójsodowy
i trójpotasowy

o

zapewnia musujący charakter tabletek

-

przemysł kosmetyczny

-

wyrób błon fotograficznych, papierów światłoczułych

-

chemia gospodarcza (dodawany do proszków do prania aby ograniczyć ilość
fosforanów,), łatwo degraduje

-

oczyszczanie kadzi mlekowych (w których powstaje kamień mleczanu – oczyszcza z
niego)

-

ś

rodki czyszczące przewody z rdzy

-

estry kwasu cytrynowego stosowane jako plastyfikatory w masach plastycznych

-

folie do pokrywania żywności