Ćw. 5 – Antygeny zgodności tkankowej.

Test mikrolimfocytotoksyczny wg Terasaki.

Antygeny zgodności tkankowej – glikoproteiny powierzchniowe obecne w błonach komórkowych,
występują u kręgowców, są odpowiedzialne za odrzucanie przeszczepów allogenicznych.

• MHC – Major Histocompatibility Complex – zespół genów kodujących antygeny zgodności

tkankowej, położonych u człowieka na chromosomie 6.

• HLA – Human Leukocyte Antigens – antygeny zgodności tkankowej występujące u człowieka.

Długośd przeżycia przeszczepów narządowych jest uwarunkowana stopniem zgodności HLA
między dawcą a biorcą przeszczepu (antygeny transplantacyjne).

Rys. Schemat mapy genetycznej układu HLA.

Klasy MHC:



MHC klasy pierwszej

:

• prezentują antygeny limfocytom Tc, doprowadzając do lizy komórki

zainfekowanej np. wirusami lub bakteriami wewnątrzkomórkowymi,
np. Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis

• występują na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych (nieliczne na

erytrocytach)

• są kodowane przez polimorficzne geny okupujące trzy loci: HLA-A, HLA-B, HLA-C, w obrębie

każdego locus opisano od kilku do kilkunastu swoistości antygenowych

• u człowieka ze względu na diploidalny komplet chromosomów i dziedziczenie MHC jako

cechy kodominującej zwykle wykrywa się po dwa antygeny z każdego locus

• Budowa:

-

łaocuch ciężki – α (45 kDa)
 fragment zewnątrzkomórkowy - 3 domeny  α

1

, α

2

(tworzą

rowek wiążący

9aa antygen

), α

3



fragment hydrofobowy – częśd transbłonowa



fragment hydrofilowy – częśd cytoplazmatyczna

-

łaocuch lekki – β2-mikroglobulina (β2m) (12 kDa) – kodowany
przez gen na chromosomie 15, czynnik „wyciągający” łaocuch α na
zewnątrz komórki



MHC klasy drugiej

:

• prezentują antygen limfocytom Th, doprowadzając do aktywacji układu

immunologicznego poprzez wpływ na:

-

odpowiedź humoralną: Th2 - IL-4, IL-5 IL-6

-

odpowiedź komórkową: Th1 – IL-2, IFN-γ, TNF-α, TNF-β

• występują na powierzchni limfocytów B, makrofagów, komórek

dendrytycznych i nabłonkowych grasicy

• są kodowane w regionie D, który składa się z kilkunastu blisko

położonych loci, zgrupowanych w subregiony: HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR

• wykryto kilkaset swoistości antygenowych kodowanych przez te geny

• Budowa:

-

łaocuch α (33 kDa) i łaocuch β (29 kDa) – częśd
wewnątrzkomórkowa, transbłonowa i zewnątrzkomórkowa

-

częśd zewnątrzkomórkowa – domeny α

1

i α

2

oraz β

1

i β

2

-

domeny α

1

i β

1

– tworzą rowek wiążący 20aa antygen



MHC klasy trzeciej

:

• Składowe dopełniacza: C4, C2, B
• Występują w plazmie krwi i odgrywają niewielką rolę w odrzucaniu przeszczepów

Funkcje MHC:

• Główna funkcja MHC to wiązanie i prezentacja antygenu limfocytom T

• Heterozygoty wykazują lepszą możliwośd prezentacji większej ilości antygenów, a

polimorfizm MHC zwiększa przeżycie niektórych osobników w populacji podczas epidemii
śmiertelnych chorób

!!!

• Różnorodnośd cząsteczek MHC jest wynikiem przystosowania się układu immunologicznego

do walki z mikroorganizmami

Metody identyfikacji HLA:

• Typowanie serologiczne oparte na przeciwciałach anty-HLA, najczęściej monoklonalnych (np.

test Terasaki)

• Typowanie genetyczne określające polimorfizm na poziomie DNA
• Analiza fragmentów restrykcyjnych produktu PCR (PCR-RFLP) i porównanie z określonymi

wzorcami

Typowanie HLA jest istotne w:

-

transplantologii

-

diagnostyce chorób powiązanych z HLA (np. korelacja między ekspresją HLA-B27 a
zesztywniającym zapaleniem kręgosłupa)

-

ustalaniu ojcowstwa

-

medycynie sądowej

Test mikrolimfocytotoksyczny wg. Terasaki (wykrywanie HLA kl. I)

Izolacja limfocytów - wykonanie:

1. Odwłóknioną przez wytrząsanie z perełkami szklanymi krew rozcieoczono PBS w stosunku 1:1
2. Otrzymaną zawiesinę nawarstwiono na Lymphoprep w proporcji 2:1 (np. 6ml krwi i 3ml

Lymphoprepu) i wirowano przez 15 min (400xg)

3. Zebrano limfocyty z interfazy (pierścieo znajdujący się między Lymphoprepem a osoczem) i

płukano je 2-3x PBSem oraz rozcieoczono PBS do gęstości 2x10

6

kom/ml

4. Limfocyty kontrolne, przechowywane w ciekłym azocie odmrożono przez zanurzenie

ampułki w wodzie o temp. 37°C, następnie płukano PBS i przygotowano zawiesinę o gęstości
2x10

6

kom/ml

Test Terasaki - wykonanie:

1. 72-dołkowe płytki Terasaki na których przeprowadza się test należy odpowiednio oznakowad

i wszystkie zagłębienia wypełnid do 2/3 objętości olejem parafinowym (uwaga! na dnie
zagłębieo nie może byd pęcherzyków powietrza)

2. Do każdego zagłębienia, pod parafinę, wkrapla się przy pomocy mikrostrzykawki Hamiltona o

pojemności 50 µl po 1 µl surowicy wzorcowej anty-HLA (uwaga! Przy każdej zmianie surowicy
strzykawkę trzeba dokładnie przepłukad w PBS (10x), aby uniknąd przeniesienia surowicy z
jednego dołka do drugiego)

3. Zagłębienie oznaczone

1A

przeznaczone jest na kontrolę żywotności limfocytów, więc

zamiast surowicy wzorcowej dodajemy tu 1 µl PBS

(kontrola negatywna)

natomiast do dołka

1B

dodajemy wzorcowe limfocyty i wybraną wzorcową surowicę

(kontrola pozytywna)

4. Do wszystkich dołków (z wyjątkiem 1B) dodajemy po 1 µl zawiesiny badanych limfocytów o

gęstości 2x10

3

kom/1 µl PBS

5. Płytki inkubujemy z wytrząsaniem przez 30 min w 20°-24°C
6. Następnie do każdego dołka dodajemy po 5 µl króliczego dopełniacza i inkubujemy próbki z

wytrząsaniem przez 60 min w 20°-24°C

7. Po inkubacji do każdego dołka dodajemy po 5 µl 5% roztworu eozyny żółtawej, a po 3 min po

5 µl 38% roztw. formaldehydu

Dopełniacz łączy się z komórkami opłaszczonymi przeciwciałami i powoduje ich lizę. W dołkach, w

których limfocyty uległy zniszczeniu zaszła reakcja pomiędzy antygenem HLA a skierowanym

przeciw niemu przeciwciałem- wynik dodatni.