Pożywką nazywamy zestaw składników pokarmowych odpowiednio dobranych pod względem ilościowym i jakościowym niezbędnych do hodowli drobnoustrojów.

Skład pożywki musi być tak dobrany, by gwarantował optymalne warunki wzrostu i rozwoju badanych mikroorganizmów.

Ze względu na charakter chemiczny składników wyróżnia się pożywki:

- naturalne (mleko)

- syntetyczne (agar odżywczy)

-półsyntetyczne (zw. syntetyczne + zw. naturalne np. agar odżywczy z dodatkiem krwi baraniej)

Pod względem konsystencji pożywki dzieli się na:

- płynne

- półpłynne 

- stałe

Zależnie od celu, jakiemu mają służyć, pożywki dzieli się na:

- ogólne (zawierają zw., które mogą być źródłem węgla i energii)

- selektywne (wybiórcze, różnicujące)

wybiórcze - rośnie tylko wybrana grupa bakterii (wg Bunta, wg Martina)

różnicujące - rośnie grupa bakterii i grzybów, możemy je wyróżnić (wg McConkey'a, dla bakterii kwaszących)

Substancje zestalające - są to substancje, które pozwalają na zestalenie pożywek. Do najczęściej używanych substancji zestalających należy agar i żelatyna.

- Żelatyna - jest substancją białkową. Otrzymuje się ją w wyniku hydrolizy kolagenu czyli białka występującego w tkance łącznej zwierząt. Temperatura upłynnienia podłoża z żelatyną wynosi około 25ºC, a temperatura zestalania około 20ºC. Wykorzystywana jest przez drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych.

- agar - agar - stosowany do wszystkich pożywek stałych, wysuszony; otrzymuje się go z glonów morskich; temp. upłynnienia = 95⁰C; temp. zastygnięcia = 45⁰C

Jałowienie szkła i pożywek:

- sterylizacja termiczna (mokra, sucha)

- sterylizacja fizyczna

Sterylizacja termiczna sucha - wykorzystuje się suszarkę; powietrze podgrzane do 160^oC; czas trwania 1 - 2h; wykorzystuje się je do sterylizacji szkła; płytki i pipety umieszcza się w tubusie.

Sterylizacja termiczna mokra - autoklawowanie, pasteryzacja i tyndalizacja.

Autoklaw - jest to kocioł o podwójnych ścianach i podwójnym dnie, zaopatrzony w manometry, termometr oraz zawór bezpieczeństwa i zawór odpowietrzający. W górnej części znajduje się pokrywa mocowana specjalnymi śrubami. Czynnikiem jałowiącym jest przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. Sterylizacja odbywa się przy ciśnieniu (1 atmosfery) w temp. 121^OC - w ciągu 20 - 30 minut. Autoklaw jest najczęściej stosowanym aparatem do jałowienia, oprócz pożywek można w nim jałowić sprzęt, który w suszarce przy znacznie wyższej temperaturze może ulec zniszczeniu.

Tyndalizacja (proces długotrwały) - pasteryzacja I, poźniej inkubacja 24h w 30⁰C, pasteryzacja II, poźniej inkubacja 24h w 30⁰C, pasteryzacja III

Pasteryzacja - nie jest metodą sterylizacji; wyk. w aparacie Kocha; zabija formy wegetatywne

Wyjaławianie przez filtrację - metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne bądź chemiczne (surowica, roztwory mocznika i niektórych cukrów). Metoda filtracji polega głównie na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od średnicy drobnoustrojów. Istnieje wiele rodzajów takich filtrów, różniących się materiałem z którego są wykonane oraz konstrukcją np.:

- Berkefelda - wykonany z ziemi okrzemkowej.

- Chamberlanda - z nieglazurowanej porcelany.

- Seitsa - azbestowe.

- Schotta - ze spiekanego szkła 

membranowe (molekularne) - przygotowywane z żelatyny, pergaminu, poliwęglanów, błon zwierzęcych itp.

Dezynfekcja - nie jest metodą sterylizacji; zabija głównie formy wegetatywne (z nastawieniem na organizmy chorobotwórcze)

Sterylizacja - zabija zarówno formy wegetatywne jak i przetrwalnikowe; na sucho - wyjaławianie w suszarkach; na mokro - autoklawowanie.

Posiew - wprowadzenie badanego materiału (np. zawiesiny drobnoustrojów, zawiesiny wodnej gleby, cząsteczek gleby) na podłoże hodowlane lub do pożywki.

Przesiew - przeniesienie drobnoustrojów z podłoża na podłoże.

Opalanie - polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia np. z brzegami naczyń zawierających pożywki, wlotami probówek. Głaszczkę opala się zanurzając w alkoholu i zapalając w płomieniu palnika.

Wyżarzanie - to sterylizacja przez rozgrzanie do czerwoności w płomieniu palnika, a następnie 3 krotne przesunięcie w płomieniu palnika oprawki wyżarzanego narzędzia - ezy lub igły.

Posiew redukcyjny - zmniejsza liczbę drobnoustrojów wysiewanych na jednostkę powierzchni podłoża zestalonego i ma na celu uzyskanie kolonii z jednej komórki macierzystej (czysta kultura).

Do czynników fizycznych mających wpływ na drobnoustroje zaliczyć można:

- temperaturę

- ciśnienie osmotyczne i hydrostatyczne

- potencjał oksydacyjno- redukcyjny

- napięcie powierzchniowe

- pH

- promieniowanie

Natomiast do czynników chemicznych zaliczamy:

- konserwanty 

- barwniki

- środki dezynfekcyjne np. fenole, alkohole, związki chloru itp. antybiotyki.

1. Temperatura - zależy od niej metabolizm bakterii oraz stan fizyko-chemiczny makrocząsteczek białkowych i nukleinowych, czyli struktura.

* temperatury kardynalne - mają najbardziej znaczący wpływ na rozwój organizmów

- minimalna - poniżej której wzrost i rozmnażanie się bakterii ulega zahamowaniu. Procesy chemiczne ulegają zwolnieniu lub zahamowaniu.

- optymalna - drobnoustroje rozmnażają się i rosną najszybciej; temp. optymalna dla wzrostu niekoniecznie jest temp. optymalna dla procesów metabolicznych

- maksymalna - powyżej której mikroorganizmy przestają rosnąć a znacznemu zwolnieniu lub zahamowaniu ulega aktywność enzymatyczna

Na podstawie punktów kardynalnych wyróżniamy: 

* Zimnolubne - psychrofilne (bakterie morskie - fotosyntetyzujące i bakterie żelazowe np. Gallionella)

- optymalna temperatura do wzrostu < 20°C

- minimalna ok. temperatury zamarzania

- maksymalna 25 - 30°C

- dzielimy je na bezwzględne (temp. max. nie przekracza 20^oC), względne (rozwijają się w temp. powyżej 20^oC)

* Mezofilne - liczne patogeny, bardzo powszechne saprofity (E. coli, Salmonella typhi, Brucella bovis, Shigella sp.).

- optymalna temperatura do wzrostu 20 - 40°C

- minim. 10 - 25°C

- maks. 40 - 45°C

* Termofile - ciepłolubne, występują w glebie, rozkładających się resztkach roślinnych, gorących źródłach (B. stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris).

- optymalna temperatura do wzrostu 45 - 60°C

- min. 25 - 45°C

- maks. 70 - 80°C

- biorą udział w kompostowaniu, zasiedlają gorące źródła i jelita niektórych zwiarząt,

- dzielimy je na bezwzględne (temp. optymalna = 60-75^oC), względne (temp. optymalna = 45-60^oC)

Część praktyczna

Należy wysiać po jednym oczku ezy zawiesiny bakterii do probówek z bulionem:

a). 2 probówki zaszczepione Escherichia coli 

b). 2 probówki zaszczepione Bacillus subtilis

Po jednej probówce z bulionem zaszczepionym E. coli i B. subtilis należy wstawić do łaźni wodnej o temp. 85^oC na 10 minut. Po tym czasie należy probówki schłodzić w strumieniu zimnej wody. Hodowle spasteryzowane i kontrolne E. coli i B. subtilis należy wstawić do cieplarki na 24 h o temp. odpowiednio: 37^oC i 28^oC. 

2. Wpływ promieniowania ultrafioletowego na mikroorganizmy - odznaczają się mniejszą wrażliwością na promieniowanie UV niż organizmy wyższe.

Działanie promieni UV polega na tym, że przy pewnej długości fali są pochłaniane przez białka i dochodzi do tworzenia się wiązań miedzy białkami a kwasami nukleinowymi. Dodatkowo w środ. tlenowym promienie UV powodują powstawanie wolnych rodników oraz związków niestałych o charakterze ponadtlenku. Najsilniejsze działanie bakteriobójcze mają fale o długości 230-275nm.

Przetrwalniki i zarodniki grzybowe są 2 razy bardziej odporne na działanie promieni UV niż formy wegetatywne.

Część praktyczna

O zabójczym działaniu promieni UV na bakterie można się łatwo przekonać. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy a następnie wysiano szczep E. coli. Płytkę otworzono i poddano promieniom UV, część płytki przykryto.

Obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli na agarze odżywczym po naświetleniu promieniami UV.

3. Ciśnienie osmotyczne - mikroorganizmy są mało wrażliwe na zmiany ciśnienia środowiska (grzyby są bardziej odporne).

Na ciśnienie osmotyczne mają wpływ:

- stężenie chlorku sodu - 0-0,15% NaCl

- stężenie glukozy

Ciśnienie osmotyczne komórki bakteryjnej jest równoważne 10-20% roztworowi sacharozy. Jeżeli jest za wysokie ciśnienie to woda z komórki będzie wypływała w sposób niekontrolowany (plazmoliza).

4. Stężenie jonów wodorowych (pH) - zakres jednakowy dla wszystkich gatunków

- bakterie pH ~ 7 (najlepiej rosną: acydofile - wolą środ. kwaśne; alkalofile - wolą środ. zasadowe)

- grzyby pH ~ 5-6

Wpływ środków dezynfekcyjnych (sublimat) na bakterie (Escherichia coli) - demonstracja.

Działanie środków dezynfekcyjnych można sprawdzić metodą studzienkową. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy i zaszczepiono zawiesiną przygotowaną z hodowli E. coli. W podłożu z hodowlą wycięto korkoborem (zanurzony w denaturacie i opalony) studzienkę, którą napełniono 0,1% roztworem sublimatu (HgCl₂). Płytkę zamknięto i wstawiono do cieplarki gdzie inkubowano ją w temp. 28^oC przez 1 tydzień.

Część praktyczna

Należy obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli poddaną działaniu roztworu sublimatu (w stężeniu 0,1%).

korkobór - wycięto nim otwór na środku płytki; do otworu naniesiono 0,1ml HgCl2 i wstawiono do lodówki 4-5^oC (czas preinkubacji); dyfunduje do studzienki; im dalej tym mniej środka; później nastąpiła inkubacja 37^oC

intensyfikacja wzrostu - odpowiedź na zagrożenie

4. Wpływ detergentów i alkoholu na mikroorganizmy - wpływają na przepuszczalność błon komórkowych; naruszają gospodarkę pierwiastkami i mogą prowadzić do ich śmierci. Alkohol najbardziej skuteczny przy 75%; powoduje denaturację białek.

Czynniki:

- bakteriobójcze - powodują śmierć

- bakteriostatyczne - powodują zahamowanie wzrostu

Część praktyczna

Aby zbadać skuteczność dezynfekcyjnego działania alkoholu etylowego i mydła na mikroflorę skóry i dłoni należy płytkę Petriego z agarem odżywczym podzielić na 3 części. 

W każdej z nich zrobić lekki odcisk palca:

1. brudnego

2. umytego wodą i mydłem 

3. przemytego watą zwilżoną etanolem (75%)

Założone hodowle należy umieścić w cieplarce w temperaturze 28^oC na ok. 48h.

Wybrane metody stosowane do hodowli mikroorganizmów.

Hodowle mieszane - różne gatunki mikroorganizmów na 1 pożywce

Hodowle czyste - mamy tu do czynienia z bakteriami i grzybami należącymi do 1 szczepu

Czyste kultury - 1 gatunek bądź szczep organizmu, które są jednorodne genetycznie

Kolonia - charakterystyczne dla rodzaju lub gatunku skupienie dużej ilości komórek wyrosłych na podłożu stałym, przy założeniu, że namnożyły się z 1 komórki. Są one najczęściej widoczne gołym okiem.

jtk (cfu) - jednostka tworząca kolonie, używa się jej przy określaniu liczny organizmów w danym środowisku.

Cechy kolonii:

1. Wzrost kolonii:

- powierzchniowy,

- podpowierzchniowy,

- wgłębny,

2. Wielkość kolonii:

- mała - o średnicy do 1 mm,

- średnia - o średnicy 1-3 mm,

- duża - o średnicy powyżej 3 mm.

3. Kształt kolonii:

a). punktowa, b). okrągła, c). rizoidalna, d). nieregularna, e). strzępiasta.

 4. Profil kolonii:

a). płaski, b). lekko wypukły, c). silnie wypukły, d). stożkowaty, e). wypukły z powierzchnią brodawkowatą, f). wrastający w podłoże, g). kraterowaty.

5. Brzeg kolonii:

a). regularny, b). falisty, c). nieregularny, d). rozlany, strzępiasty

6. Przejrzystość kolonii:

- przejrzysta,

- nieprzejrzysta,

- półprzejrzysta

7. Fluorescencja kolonii - obecna lub brak.

- nieindukowana (po 72h na kolor zielony)

- niebieska, zielona (indukuje się trzymając otwartą płytkę pod lampą UV)

8. Barwa kolonii - obejmuje obecność pigmentu lub jego brak (kolonia bezbarwna), intensywność zabarwienia, zabarwienie otoczenia kolonii związane z dyfuzją barwnika do podłoża;
9. Struktura kolonii

- ziarnista (przy dotknięciu wyczuwalna ziarnistość),

- krucha, pylista (przy dotknięciu rozpada się),

- włóknista (przy podnoszeniu widoczne włókna),

- skórzasta (zwarta i trudna do rozmazania)

- mazisto-kremowa (ciągnąca się) 

10. Zapach kolonii - obecny lub kolonia bez zapachu, określa się intensywność zapachu i czy jest charakterystyczny

E. coli nie wytwarza przetrwalników. Proces pasteryzacji zabija ją.

B. subtilis wytwarza przetrwalniki. Proces pasteryzacji nie powoduje jej śmierci.

Hodowle tlenowe i beztlenowe.

Ćwiczenie. Zastosowanie bulionu odżywczego lub słupków z agaru. Zaszczepiamy ezą (bulion) lub igłą (agar). Inkubacja 24h. Jeżeli wzrost jest w postaci kożuszka to tlenowiec. Jeśli w środku pożywki mamy zmętnienie to beztlenowiec względny. Jeśli na dnie pożywki mamy osad to beztlenowiec bezwzględny.

Bezwzględne tlenowce — drobnoustroje, dla których tlen jest czynnikiem niezbędnym nie tylko dla wzrostu i rozwoju, lecz także dla utrzymania się przy życiu. Do takich drobnoustrojów należą np. autotroficzne bakterie utleniające amoniak do azotanów. Do bezwzględnych tlenowców zalicza się jednak i takie organizmy, które wprawdzie nie mogą rosnąć i rozwijać się bez udziału tlenu, ale zachowując żywotność mogą przetrwać pewien okres w środowisku o niskiej zawartości tlenu. Do takich organizmów należy większość drobnoustrojów glebowych.

Mikroaerofile — czyli względne tlenowce, stanowią grupę pokrewną tlenowcom bezwzględnym. Są one bardzo rozpowszechnione w przyrodzie, a zwłaszcza w glebie. Rosną i rozwijają się najlepiej wtedy, gdy stężenie tlenu w środowisku jest niskie.

Względne beztlenowce — drobnoustroje, które mogą żyć w obecności lub przy braku tlenu wykorzystując do procesów utleniania tlen wolny lub inny substrat energetyczny. Do tej grupy zalicza się takie organizmy jak drożdże, które mogą oddychać zarówno tlenowo, jak i w warunkach beztlenowych fermentując wtedy cukry. Względnymi beztlenowcami są też niektóre gatunki bakterii fotosyntetyzujących.

Bezwzględne beztlenowce — drobnoustroje, których wzrost jest hamowany nawet przez małe ilości tlenu, prawdopodobnie ze względu na nieodwracalne utlenienie przenośników elektronów i wytwarzanie się toksycznych nadtlenków np. H₂O₂. Do tej grupy należą niektóre gatunki Clostridium.

Hodowle tlenowe - na pożywkach płynnych; stosuje się niski słup pożywki, żeby była najbardziej natleniona;

hodowle w kolbkach - większy dostęp tlenu;

na pożywkach stałych - na płytkach Petriego i w probówkach;

Hodowle beztlenowe - ograniczamy dostęp tlenu.

Metody usuwania tlenu:

* metody biologiczne:

- płytki Fortnera - bakterie beztlenowe wykorzystują cały dostępny tlen w czasie inkubacji i stwarza to dogodne warunki do rozwoju beztlenowca; beztlenowiec bezwzględny nie będzie żył

- zast. tkanek rośl. i zw., które mają naturalną zdolność do adsorpcji tlenu; pożywa płynna wg Wrzostka - wykorzystuje się marchewkę lub pokrojoną wątrobę

* fizyczne - odcinamy dostęp tlenu:

- na swojej powierzchni posiadają warstwę ciekłej parafiny. W przypadku stałych stosuje się agar wodny 10%. Wylewa się go na płytce z pożywką i beztlenowcem. Agar zastyga i odcina dostęp tlenu do pożywki.

- wykorzystanie anaerostatów - gaz obojętny: propan butan, azot, CO2 - odprowadzają tlen, wprowadzany jest gaz obojętny

* chemiczne:

- wykorzystuje się zw. chem., które wykazują właściwości adsorpcji tlenu np. pyrogallol, który w środowisku alkalicznym zaczyna wiązać tlen;

- gaspack - torebki z kwasem węglowym, odcinamy róg, wlewamy 10ml wody i wrzucamy do anaerostatów; wydziela się H2 i CO2

- mieszane

---