BACILLUS - ŹRODŁO ENZYMÓW BAKTERYJNYCH

Charakterystyka

• gramdodatnie laseczki (brak LPS i OM); nie posiadają błony zewnętrznej - ułatwiona sekrecja enzymów;

• tlenowce lub względne beztlenowce

• urzęsienie perytrychalne lub biegunowe

• znane gatunki mezofile, termofilne, psychrofilne, psychotropowe (zimnolubne)

• tworzą endospory o różnym kształcie i rozmieszczeniu w komórce (podstawa klasyfikacji)

• powszechne; występują w glebie, w wodzie, na roślinach, w przewodzie pokarmowym zwierząt

• najbardziej popularne: B.pumilus, B.cereus, B.subtilis

• producenci antybiotyków polipeptydowych: gramicydyny, polimyksyn, bacytracyny

• B.thuringiensis syntetyzuje endotoksynę stosowaną jako biopestycyd

• B.sphericus → acylaza penicylinowa

• Inne enzymy: fosfataza alkaliczna, lipaza

Technologia produkcji egzoenzymów Bacillus sp:

I. Proces biosyntezy:

• hodowla wgłębna, okresowa, w klasycznych fermentorach

• podłoże: źródło węgla, witaminy, zasady azotowe

• zakres temperatury 28-40C

• warunki hodowli dobierane indywidualnie do szczepu

II. Wyodrębnienie enzymu z podłoża hodowlanego:

• filtracja

• oczyszczanie

Metody stabilizacji:

• dodatek związków chemicznych: siarczan amonu, glicerol, niektóre sole

• chemiczna modyfikacja enzymów (acylacja, alkilacja)

• selekcja i konstrukcja mutantów wytwarzających enzymy o większej stabilności

• immobilizacja - trwałe związanie z nośnikiem, tworzą nierozpuszczalne w wodzie połączenia

• Związanie enzymu z nośnikiem

• usieciowanie (polimeryzacja) cząsteczek enzymu bez udziału nośnika → sprzężanie z aldehydem glutarowym

• zamknięcie enzymu w nośniku żelowym, włóknistym polimerze (octan celulozy)

• mikrokapsułkowanie - otoczenie enzymu błoną półprzepuszczalną

Zalety unieruchamianych enzymów:

• są mniej wrażliwe na czynniki zewnętrzne

• korzystne zmiany właściwości katabolicznych

• większe możliwości kontroli procesu

• wielokrotne użycie

• produkt pozbawiony śladów enzymu

• idealny materiał w procesie technologicznym wykorzystującym ciąg reakcji enzymatycznych

• możliwość zautomatyzowania procesu

• mniejsze zanieczyszczenie środowiska

INŻYNIERIA ENZYMÓW PRZEMYSŁOWYCH:

I. Klonowanie i ekspresja naturalnych wariantów enzymów w innym biorcy

Dotyczy enzymów pochodzących z gatunków termofilnych (wykazujących optimum wzrostu w temperaturze powyżej 90C), trudnych do hodowli na skalę przemysłową. Biorcami są drobnoustroje o niższych wymaganiach.

Sklonowano w Bacillus subtilis geny kodujące:

• termostabilną -amylazę i subtilizynę z B. amyloliquefaciens

• -amylazę B. stearothermophilus

• ksylanazę z B. pumilus

• acylazę penicylinową z B. sphericus

Uzyskanie subtylizyny niezależnej od Ca²⁺ Bacillus amyloliquefaciens

1. Uzyskanie struktury trójwymiarowej metodą krystalografii rentgenowskiej, ustalenie która część jest odpowiedzialna za wiązanie Ca²⁺

2. Ukierunkowana mutageneza → delecja kilku aminokwasów wiążących Ca² → brak zmiany struktury, ale utrata aktywności

3. Zwiększenie stabilności enzymów poprzez wymianę niektórych aminokwasów

4. Test kazeinowy - badanie właściwości proteolitycznych enzymu wskazujących na otrzymanie enzymu niezależnego od Ca²⁺ o wyższej aktywności, niż enzym wyjściowy.

II. Zmiana specyficznych właściwości białka enzymatycznego

Inżynieria białka - zmiany w sekwencji aminokwasowej białka, w celu zmian jego właściwości

Zmiany dotyczą:

• siły wiązania enzymu z substratem

• tolerancji i aktywności w pH i T, które inaktywują natywne białko

• wymagań względem kofaktorów

• modyfikacji miejsca wiązania substratu w celu zwiększenia specyficzności enzymu

• zmian miejsca oddziaływania allosterycznego, aby usunąć feedback inhibition

• zwiększenia odporności na komórkowe proteazy

Modyfikowanie właściwości enzymów- strategie:

• zmiana przypadkowego aminokwasu metodą prób i błędów; najczęściej prowadzi do otrzymania nieaktywnego białka

• zmiana aminokwasów zaprojektowana w oparciu o strukturę trójwymiarową enzymu → mutageneza ukierunkowana:

• poprzez delecje, wstawienie innego kodonu

• oparta o metody PCR, np. użycie polimerazy bez zdolności do korekty; niedomiar jednego z nukleotydów

Uzyskanie struktury 3D enzymu:

• modelowanie komputerowe

• krystalografia rentgenowska

Modyfikowanie właściwości ksylanazy B.circulans

→ modelowanie komputerowe 3D struktury w celu zaprojektowania miejsc wprowadzenia mostków dwusiarczkowych stabilizujących trójwymiarową strukturę białka, zwiększa termostabilność i oporność na rozpuszczalniki organiczne

→ zmiana aminokwasów tak, aby powstały mostki dwusiarczkowe (z grup sulfhydrylowych dwóch reszt cysteiny)

Mechanizmy regulujące syntezę egzoenzymów u Bacillus spp - indukcja i represja

• większość egzoenzymów podlega indukcji

• w obecności induktora (produktu degradacji substratu) synteza enzymu wzrasta nawet 1000x

• synteza enzymów podlega represji katabolicznej:

• węglowej - obecność łatwodostępnego źródła węgla

• azotowej - obecność różnych form azotu

Regulacja biosyntezy subtylizyny u Bacillus:

• obecność białka (substratu) w podłożu hodowlanym B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis zwiększa wydajność syntezy tylko kilkukrotnie

• intensywna synteza enzymu nie zależy od obecności białka; rozpoczyna się przed sporulacją

• na syntezę nie ma wpływu źródło azotu - brak represji azotowej

• represja kataboliczna bez udziału cAMP-CAP, regulatorem jest GTP

• Poziom wewnątrzkomórkowego GTP jest zależny od stężenia glukozy

• GTP reguluje ekspresję genu kodującego białko spoOA

• Wejście w sporulację wiąże się ze wzrostem stężenia GTP, indukcją syntezy spoOA oraz indukcją syntezy subtylizyny.

	Przemysłowe nazewnictwo cukrów	Skład
Dekstroza/glukoza	Cukier gronowy	Cukier prosty
Sacharoza	Cukier buraczany	Dwucukier(fruktoza+glukoza)
Laktoza	Cukier mlekowy	Dwucukier(galaktoza+glukoza)
Syrop glukozowy	Cukier skrobiowy	Glukoza+maltoza(dwucukier glukoza+glukoza)
Ksyloza	Cukier drzewny	Cukier prosty (pentoza)