Zasady pobierania, transportu, przechowywania próbek żywności

Zasady pobierania, transportu, przechowywania próbek żywności

pobranych do badań mikrobiologicznych

1. Mikrobiologiczna ocena żywności:

sprawdzenie prawidłowości procesów technologicznych

- nadmierna ilość drobnoustrojów lub obecność pewnych grup może wskazywać na:

- metody stosowane w mikrobiologicznej analizie żywności - cel:

oznaczenie ogólnej liczby drobnoustrojów

oznaczenie drobnoustrojów wskaźnikowych

oznaczenie obecności i liczby drobnoustrojów wywołujących psucie i zatrucia

- partia żywności - ilość środka spożywczego wytworzonego w tym samym czasie, jednolitego pod względem pochodzenia, producenta, rodzaju, sposobu i rodzaju pakowania

- próbka pierwotna - jednostki pochodzące z tego samego miejsca partii (materiał pobrany w jednym punkcie partii)

- próbka zbiorcza (ogólna) - połączony i wymieszany zbiór próbek pierwotnych, pobranych z partii (w przypadku mięsa i drobiu każda próbka pierwotna jest próbką zbiorczą)

- próbka laboratoryjna - próbka wysłana do laboratorium lub otrzymana w laboratorium; obejmuje reprezentatywną ilość materiału pobranego z próbki zbiorczej; uzyskuje się ją w wyniku uśrednienia i pomieszania próbki zbiorczej

- próbka analityczna - materiał przygotowany do analizy z próbki laboratoryjnej poprzez oddzielenie części produktu przeznaczonego do badania, a następnie wymieszanie, zmielenie, rozdrobnienie itp. w celu wyodrębnienia porcji analitycznej w sposób minimalizujący wielkość błędu; reprezentatywna część próbki laboratoryjnej, wymagana do jednej analizy

- wielkość próbki - liczba jednostek lub ilość materiału, na który składa się próbka

- jednostka - najmniejsza część partii, jaka może być z niej pobrana, stanowiąca całość lub część próbki pierwotnej; przykłady:

świeże owoce/warzywa - cały owoc/warzywo lub postać w jakiej występuje w sposób naturalny (np. kiście winogron)

małe zwierzęta, ich części, narządy - całe zwierzę lub cała część/narząd

duże zwierzęta, ich części i narządy - część lub całość narządu

materiały opakowane - najmniejsze oddzielne opakowanie jednostkowe

duże opakowania (beczki, sery) - materiał pobrany za pomocą przyrządu do pobierania próbek.

3. Pobieranie próbek do badania mikrobiologicznego:

- pobieranie musi być prowadzone w sposób wykluczający dodatkowe zanieczyszczenie ich drobnoustrojami

- wszystkie operacje podczas otwierania opakowań należy przeprowadzić aseptycznie, np.:

kiełbasy parzone lub surowe, w naturalnych/syntetycznych osłonkach - zdezynfekować w połowie długości batona na całym obwodzie, zwilżając osłonkę etanolem i opalając; następnie nacinając jałowym nożykiem zdjąć osłonkę

puszki po zdezynfekowaniu otwierać jałowym nożem

konserwy o konsystencji zestalonej - puszkę otworzyć z obu stron i wypchnąć zawartość na jałową tacę

mięso i przetwory mięsne nie opakowane - umieścić na sterylnej tacy i opalić, następnie jałowym nożem usunąć opaloną część (w przypadku oceny stanu mikrobiologicznego powierzchni produktu próbek nie należy opalać)

produkty w małych opakowaniach, konserwy pasteryzowane i sterylizowane - pobieranie w oryginalnych opakowaniach

produkty z dużych opakowań - pobieranie do jałowych naczyń z hermetycznym zamknięciem lub toreb plastikowych

- próbki do badań należy pobierać losowo

- cechy idealnego pojemnika do przechowywania próbek żywności:

nie powinien stwarzać zagrożenia z powodu np. obecności szkła w żywności

- podczas pobierania próbek należy spisać protokół pobrania:

wielkość partii, którą próba reprezentuje

4. Transport i przechowywanie próbek żywności do analizy mikrobiologicznej:

5. Liczba próbek pobranych do badań (n):

częstość występowania drobnoustrojów niebezpiecznych dla zdrowia

grupa konsumentów, dla której żywność jest przeznaczona

ocena partii większości środków spożywczych n = 5

bakterie szczególnie niebezpieczne (np. Salmonella spp.) n = 10

w Polsce n zależy od wielkości badanej partii żywności

- wielkość próbki produktu do badań mikrobiologicznych nie powinna być mniejsza niż 250g (dla niektórych produktów jednorodnych dopuszcza się 100g)

- kontrola procesu produkcji - pobranie próbek minimum 2 razy (na początku i końcu procesu produkcyjnego).

6. Plan dwu- lub trzyklasowy pobierania i oceny próbek żywności (stosowany w zależności od stopnia ważności oznaczanych drobnoustrojów):

gdy zachodzi podejrzenie występowania w żywności drobnoustrojów niebezpiecznych

jeden limit mikrobiologiczny „m” (wartość, która pozwala na akceptację próbki); umożliwia podział próbek na dwie klasy:

„c” - maksymalna dopuszczalna liczba próbek nie odpowiadająca wymaganiom; dla niektórych drobnoustrojów wynosi 0 (np. Salmonella spp.)

stosowany jeżeli w ilości jednostkowej dopuszczalna jest pewna liczba drobnoustrojów (np. mogących powodować szybsze psucie produktu)

- „m” - górny limit dobrej praktyki produkcyjnej; wysoka jakość, gdy próbki o wartości ≤m (pełna dopuszczalność do obrotu)

- „M” - granica, poza którą poziom skażenia jest niebezpieczny lub niedopuszczalny; przekroczenie M zawsze powoduje odrzucenie partii

próbki o wartościach pomiędzy m i M mogą być warunkowo uznane, jeśli „c” nie jest większa od ustalonej

7. Przygotowanie laboratoryjne próbek żywności do badań mikrobiologicznych:

- wstępne przygotowanie próbek konserw i produktów zamrożonych:

mrożone mięso i jego przetwory rozmrażać w temperaturze 0-2^oC do całkowitego rozmrożenia (nie dłużej niż przez 24h)

próbki konserw poddać próbie szczelności - badanie szczelności konserw metalowych zamkniętych hermetycznie:

- I metoda - umieszczenie konserwy w eksykatorze próżniowym, wypompowanie powietrza pod ciśnieniem 135 hPa na 2-3 min; po wyjęciu dokładnie obejrzeć złącza

- II metoda - zanurzenie konserwy w szklanym naczyniu z wodą o temperaturze 90-95^oC; nieszczelność - pęcherzyki gazu spod szwów lub wieczka

konserwy w nieuszkodzonych opakowaniach oraz o utwierdzonej szczelności poddać próbie termostatowej - badanie trwałości metodą termostatową:

- do produktów sterylizowanych i pasteryzowanych, zamkniętych hermetycznie, o długim okresie przydatności do spożycia

- konserwy inkubuje się w cieplarce wyposażonej w termograf lub termometr w temperaturze 37^oC:

dla konserw o masie <1 kg czas inkubacji wynosi 7 dób

dla konserw o masie >1 kg czas inkubacji wynosi 10 dób

- po inkubacji konserwy schładza się pod bieżącą wodą do temperatury 18-20^oC i poddaje badaniom

- wynik uznaje się za dodatni, jeżeli konserwa wykazała chociaż jedną z następujących cech:

niezestalenie się (jeśli norma przewiduje zestalenie)

- przygotowanie rozcieńczeń próbek żywności:

minimum 10g/10cm³ próbki odważamy i przenosimy do homogenizatora

do naważki dodajemy 9-krotnie większą objętość określonego rozpuszczalnika (np. woda peptonowa, płyn Ringera) i homogenizujemy (na tym etapie rozcieńczenie wynosi 1:10)

stopień dalszego rozcieńczenia próbki należy ustalić na podstawie przewidywanego stopnia mikrobiologicznego zanieczyszczenia produktu; podstawowe zasady prawidłowego wykonania rozcieńczenia próbek żywności:

- każde rozcieńczenie wykonywać inną pipetą

- pipetę zanurzać maksymalnie na 2,5 cm

- woda użyta do przygotowania rozpuszczalnika powinna być destylowana, dejonizowana i wolna od substancji hamujących wzrost bakterii

w przypadku produktów płynnych mieszamy rozpuszczalnik z produktem.

- oglądanie drobnoustrojów w tzw. ciemnym polu widzenia (obiekty są jasne)

- specjalny kondensor nie przepuszcza promieni centralnych, a jedynie boczne (odbite od oglądanych obiektów i padające pod pewnym kątem)

- zastosowanie w obserwacji mikroorganizmów w płynach ustrojowych oraz elementów przezroczystych, których nie można zauważyć w jasnym polu widzenia

- wykorzystuje zjawisko fluorescencji (własnej lub wtórnej fluorochromów - auramina, rodamina, fluoresceina) obiektów oświetlonych niewidzialnym światłem UV

- część optyczna (kryształ górski) przepuszcza promieniowanie UV

- zastosowanie - wykrywanie prątków, diagnostyka kiły, identyfikacja grzybów, badania serologiczne (immunofluorescencja)

- obserwacje w świetle przechodzącym bezbarwnych obiektów przezroczystych dzięki specjalnej optyce, która uwzględnia różnice w gęstości materiału biologicznego i ich współczynniki załamania światła

- obserwacja żywych, niebarwionych komórek w kropli wody, niezabarwionych tkankach

- ocena ruchliwości i ilości niektórych bakterii, odróżnienie struktur komórkowych bez barwienia

- źródło światła - lampa kwarcowo-rtęciowa

- soczewki kwarcowo-fluorytowe przepuszczają tylko promieniowanie UV

- nieoptyczny (elektronowy) - wykonanie bardzo cienkich skrawków materiałów biologicznych za pomocą ultramikrokonu, wyposażonego w noże szklane lub diamentowe; skrawki impregnowane solami metali ciężkich (cieniowane), co pozwala uzyskać obraz 3D; obraz oglądany na ekranie fluoryzującym lub rejestrowany na kliszy; powiększenie do kilku milionów razy; rodzaje:

- strumień elektronów nie przenika przez preparat, a jedynie go „omiata”

- obraz przestrzennej budowy drobnoustrojów

- zastosowanie - obserwacja morfologii bakterii i ich wnikania do komórek makroorganizmów

- umożliwia obserwację struktury, zależności krystalograficznych (tworzenie obrazu dyfrakcyjnego z wybranego obszaru próbki), obserwację próbki „na wskroś”

- rejestruje elektrony przechodzące przez próbkę.

układ mechaniczny - rewolwer, statyw, tubus, śruba makrometryczna (szukanie obrazu), śruba mikrometryczna (ustawienie ostrości obrazu), podstawa, śruba przesuwu preparatu

- obiektyw - zbiera światło wychodzące z przedmiotu; tworzy jego powiększony obraz; rodzaje obiektywów:

suche (powietrzne) - powiększają do 60x; przestrzeń robocza wypełniona jest powietrzem i promienie świetlne po przejściu przez preparat wchodzą do ośrodka optycznie rzadszego, w którym ulegają załamaniu i rozproszeniu → część z nich nie trafia więc do soczewki obiektywu, co powoduje, że obraz mikroskopowy nie jest wyraźny

immersyjne (zanurzeniowe) - przestrzeń roboczą wypełnia ciecz immersyjna (współczynnik załamania światła zbliżony do szkła), a promienie świetlne po wyjściu z preparatu trafiają do ośrodka o współczynniku załamania światła zbliżonym do szkła → nie następuje rozproszenie promieni świetlnych (wszystkie promienie trafiają do soczewki), a powstały obraz jest jasny i wyraźny

- kondensor z przesłoną - skupia wiązki promieni świetlnych

obliczanie powiększenia: powiększenie = powiększenie okularu x powiększenie obiektywu

maksymalne możliwe powiększenie - 2500x (obiektyw 100x, okular 25x)

- umożliwia obserwację drobnoustrojów głównie w postaci zabitej i barwionej

- barwienie proste pozwala na ocenę kształtu, wielkości i ułożenia drobnoustrojów

- korzystając ze specjalnych technik barwienia można zaobserwować dodatkowe struktury:

rzęski - przy pomocy kwasu taninowego, który osadza się na powierzchni rzęsek i czyni je bardziej widocznymi

3. Ocena morfologii drobnoustrojów:

- ocena morfologii komórki (przy użyciu mikroskopu):

wynik barwienia (metoda Grama - Gram+ [fioletowe] i Gram- [różowe])

- kulisty (ziarniaki; Coccus) - np. Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus

pałeczki (Coccobacillus; pojedyncze, pary, skupiska) - np. Salmonella typhi, Escherichia coli, Yersinia pestis (pałeczka dżumy)

laseczki (długość ich komórki jest dużo większa niż szerokość) - np. Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Corynebacterium diphteriae (maczugowiec błonicy), Lacdobacillus acidophilus

wielkość komórek - wirusy < bakterie (zwykle 0,4-1 μm szerokości i 0,5-10 μm długości; widoczne przy powiększeniu 100x; występują w jednym, określonym kształcie) < grzyby (widoczne przy powiększeniu 40x; mogą przybierać różne kształty)

- jedna płaszczyzna podziału - dwoinki (pary), łańcuszek (paciorkowce, np. Streptococcus pyogenes; niektóre laseczki)

- dwie płaszczyzny podziału - tetrada (czworaczki; np. Micrococcus spp.)

- trzy płaszczyzny podziału - pakietowiec (sześcianka; Sarcina)

- nieregularne ugrupowania - np. Staphylococcus aureus

układ, obecność i ułożenie rzęsek; typy urzęsienia:

- jednorzęse - monotricha (V. cholerae)

- dwubiegunowe - amfitricha (Spirillum spp.)

- wkołorzęse - peritricha (Salmonella spp.)

- bezrzęse - atricha (większość ziarnikaów)

obecność otoczki - wykrywanie przy pomocy barwienia pozytywnego/negatywnego

obecność, kształt, wielkość i ułożenie przetrwalników (endospor):

- ocena morfologii kolonii (bez użycia mikroskopu).

- bezpośrednie (np. z materiału klinicznego; oprócz drobnoustrojów widoczne jest też tło) i pośrednie (z hodowli; widoczne są jedynie drobnoustroje).

- bakterie prawie nie załamują światła, dlatego aby je uwidocznić należy użyć barwnych związków chemicznych

- jest procesem drastycznym i prowadzi do śmierci komórki (z wyjątkiem preparatów przyży6ciowych, gdzie stosuje się duże rozcieńczenie barwnika, aby delikatnie zabarwić komórki bez ich zabijania)

wykazanie obecności bakterii w preparacie

ocena morfologii, układu przestrzennego i sposobu barwienia drobnoustrojów

przy zastosowaniu specjalnych technik barwienia można dodatkowo wykazać obecność rzęsek, otoczek, przetrwalników, ciał wolutynowych

- rzadko stosowane ze względu na powolne wnikanie barwników

- zastosowanie - obserwacja ruchliwości, żywotności (odróżnienie komórek żywych od martwych), sposobu rozmnażania, czasami do wykrywania substancji zapasowych; najczęściej stosowane do obserwacji drożdży i pleśni (ze względu na ich budowę i rozmiar), natomiast u bakterii służy jedynie do oceny ruchliwości

polega na wprowadzeniu do żywych komórek nietoksycznego barwnika o dużej kontrastowości i w dużym rozcieńczeniu

wykonywane na szkiełku podstawowym (w kropli spłaszczonej) lub na szkiełku z wgłębieniem (tzw. komora Lindnera, w kropli wiszącej; obserwacja w ciemnym polu widzenia)

- przygotowanie szkiełka podstawowego - odtłuszczenie (chemiczne, np. przy użyciu alkoholu; fizyczne - poprzez opalenie)

- nałożenie bakterii (wykonanie rozmazu) - kropla 0,85% NaCl + 1 kolonia bakteryjna (w przypadku podłoża płynnego - jedno oczko ezy)

- umieszczenie (obok kropli zawiesiny drobnoustrojów) kropli barwnika, zmieszanie obu kropli ezą

4. Przygotowanie i barwienie preparatu utrwalonego:

- przygotowanie szkiełka podstawowego (odtłuszczenie)

- nałożenie bakterii i wykonanie rozmazu

- wysuszenie rozmazu (na „powietrzu”, preparat musi wyschnąć samoistnie)

- utrwalenie (poprzez przeciągnięcie preparatu 3x w płomieniu palnika); cel:

przygotowanie do barwienia (denaturacja białek)

przyklejenie drobnoustrojów do szkiełka

- zastosowanie barwników grubodyspersyjnych, które nie przenikają do komórek (nigrozyna, tusz chiński, czerwień kongo)

pozytywne - barwienie komórek, tło pozostaje bezbarwne:

- proste - zastosowanie jednego barwnika

- złożone - kilka barwników, odbarwiacze (np. alkohol), bejce (ułatwiają zatrzymanie barwnika w komórce)

- barwienie elementów komórki bakteryjnej i tła

- zastosowanie - obserwacja otoczek, przetrwalników (przetrwalniki i tło ulegają zabarwieniu, natomiast komórka pozostaje bezbarwna)

różna barwliwość zależy od składu chemicznego komórek bakteryjnych

bakterie Gram(+) zawierają kwasy tejchojowe oraz rybonukleinian magnezu połączony z białkiem; fiolet krystaliczny, po połączeniu z rybonukleinianem magnezu i jodem z płynu Lugola tworzy nierozpuszczalny w alkoholu związek - p-jodorozanilinę; jod wiąże się ze ścianą komórkową i nie jest wypłukiwany odbarwiaczem

bakterie Gram(-) mają inną budowę chemiczną i dlatego barwniki wypłukiwane są alkoholem z komórek; w dalszym etapie komórki przyjmują barwnik dodatkowy - fuksynę (w celu wybarwienia bakterii Gram(-))

- odbarwienie roztworem alkoholu (30-60 sekund)

właściwości grup w reakcji na barwienie metodą Grama:

- większość ziarenkowców to bakterie Gram(+)

- większość pałeczek to bakterie Gram(-)

- wszystkie laseczki i grzyby to są Gram(+)

- przecinkowce i Spirillum spp. są w większości Gram(-)

- krętki - nie barwią się przy pomocy metody Grama

1. Pożywki (podłoża) - płynne, półpłynne lub stałe mieszaniny związków chemicznych, w których (na których) namnażają się drobnoustroje.

- odpowiednia zawartość substancji odżywczych:

źródło węgla - najczęściej glukoza

źródło azotu - np. związki organiczne

acidofile (pH ≤ 5,4) - Lactobacillus spp., grzyby

neutrofile (pH 5,4-8,5) - większość bakterii ma optimum pH w granicach 7

alkalofile (pH > 8,5-11,5) - Vibrio cholerae

- klarowna i jednorodna - wszystkie substancje powinny być rozpuszczalne

stałe (1,5-3% agaru lub 12-15% żelatyny)

pożywki zestalać można nie tylko agarem, ale również żelatyną, lecz jest ona rzadko wykorzystywana w diagnostyce mikrobiologicznej ze względu na temperaturę zestalenia (w standardowej temperaturze hodowli drobnoustrojów pożywka z żelatyną jest płynna)

- ze względu na zawarte substancje (skład):

syntetyczne - wyłącznie związki chemiczne, całkowicie znany skład chemiczny pożywki

półsyntetyczne - na bazie substancji chemicznych + dodatek składników naturalnych; znany skład tylko związków nieorganicznych

naturalne - owoce i warzywa oraz ich wyciągi, krew, wyciągi mięsne; nieznany skład ilościowy i jakościowy (lub znany w przybliżeniu)

- ze względu na ilość i jakość składników odżywczych:

proste (podstawowe) - dla organizmów o niskich wymaganiach odżywczych; np. woda peptonowa, agar zwykły

złożone (wzbogacone) - dla organizmów o zwiększonych wymaganiach odżywczych; np. bulion mózgowo-sercowy (BMI), agar z krwią baranią

wybiórczo-namnażające (wybiórcze) - zawierające składniki hamujące wzrost niektórych gatunków drobnoustrojów i stwarzające korzystne warunki rozwoju innym gatunkom; np. bulion z żółcią (hamowanie większości drobnoustrojów, poza Salmonella spp.)

wybiórczo-różnicujące (różnicujące) - rosną na nich wybrane bakterie, które dodatkowo są różnicowane na drodze właściwości biochemicznych (np. podłoże Chapmana, MacConkey'a MCA) - umożliwiają określenie swoistych cech biochemicznych gatunku drobnoustrojów; składają się z podłoża odżywczego, substratu dla bakterii, wskaźnika, czasem zbiornika na gaz (w podłożach płynnych)

specjalne - hodowla drobnoustrojów „wybrednych”, o specjalnych wymaganiach wzrostowych; często zawierają węglowodany, witaminy, antybiotyki, krew poddaną lizie, surowicę końską; np. agar czekoladowy, podłoże Löfflera, podłoże Löwensteina-Jensena, bulion z tioglikolanem sodu

transportowe - umożliwiają przeżycie drobnoustrojów w czasie transportu (zawierają odpowiednie sole mineralne i bufory zapewniające żywotność drobnoustrojów obecnych w materiale)

transportowo-namnażające - ich skład chemiczny umożliwia namnażanie się bakterii w czasie transportu.

3. Charakterystyka wybranych podłoży:

wybiórczo-różnicujące dla gronkowców

czynnik wybiórczy - 7,5% NaCl (hamuje wzrost większości drobnoustrojów; poza gronkowcami na podłożu tym czasami rosną Bacillus i inne)

gronkowce rozkładające mannitol powodują zmianę zabarwienia pożywki (różowy żółty), ponieważ środowisko ulega zakwaszeniu

mannitolo(+) - S. aureus; mannitolo(-) - S. Epidermidis

wybiórcz-różnicujące podłoże dla pałeczek Gram(-)

czynniki wybiórcze - dezoksycholan sodu, fiolet krystaliczny (hamują wzrost bakterii Gram(+) oraz szczególnie wymagających Gram(-))

czynnik różnicujący - laktoza (bakterie rozkładające laktozę tworzą różowo zabarwione kolonie; czasem obserwuje się dodatkowo rozkład dezoksycholanu sodu - wytrąca się kwas dezoksycholowy, co obserwuje się w postaci „mgiełki”, zmętnienia)

laktozo(+) - E. coli; laktozo(-) - Proteus vulgaris, Salmonella (bakterie laktozo(-) rosną w postaci przezroczystych kolonii)

wybiórczo-różnicujące podłoże dla paciorkowców kałowych Enterococcus spp.

czynniki wybiórcze - azydek sodu (pozwala na wzrost paciorkowców kałowych), 6,5% NaCl, żółć (hamują wzrost pozostałych drobnoustrojów)

czynnik różnicujący - eskulina; Enterococcus rozkładają eskulinę do eskuletyny (widoczne jest to w postaci zaczernienia podłoża); na podłożu tym rośnie także Staphylococcus, ale nie powoduje rozkładu eskuliny

wybiórczo-namnażające podłoże dla Pseudomonas

czynnik wybiórczy - cetrymid (hamuje wzrost bakterii Gram(+) i większości Gram(-), a nie hamuje wzrostu i wytwarzania barwników przez Pseudomonas spp.)

charakterystyczny zapach (kredki świecowe, jaśminowiec) spowodowany wytwarzaniem trimetyloaminy

różne gatunki Pseudomonas mogą wytwarzać różne barwniki (od żółtozielonego do brązowego)

obniżone pH, dodatek antybiotyków (cykloheksymid, gentamycyna, chloramfenikol)

zawiera łagodnie zhemolizowaną krew (zagotowanie agaru z krwią; następuje uwolnienie czynników wzrostowych z krwinek - X (hemina) i V (NAD))

podłoże dla Haemophilus spp., Neisseria spp.

specjalne podłoże dla Corynebacterium diphteriae

zawiera zieleń malachitową, która hamuje wzrost innych drobnoustrojów

tioglikolan sodu i cysteina obniżają potencjał oksydacyjno-redukcyjny i utrzymują warunki beztlenowe

zawiera także heminę i witaminę K (niezbędna do wzrostu niektórych niesporujących bakterii beztlenowych).

- pożywka wraz z rozwijającymi się w niej (na niej) drobnoustrojami

monokultura (czysta hodowla) - zawiera drobnoustroje jednego gatunku

mieszana - zawiera drobnoustroje z różnych gatunków

- odróżnienie hodowli czystej od mieszanej - na podstawie morfologii kolonii

- bezwzględne tlenowce - atmosfera tlenowa (normalne warunki hodowli)

- mikroaerofilne - pojemniki z generatorami chemicznymi (najczęściej w formie woreczków z substancją pochłaniającą nadmiar O₂), cieplarki z CO₂

- beztlenowce - anaerostaty z pompą próżniową, pojemniki z generatorami chemicznymi (np. GasPak), bulion z tioglikolanem sodu

- termormofile - hipertermofile, termofile właściwe; w gnijących resztkach, sianie, gorących źródłach; np. Thermococcus spp.

- psychrofile - bakterie z dna oceanów itp.; np. Flavibacterium spp.

5. Wzrost drobnoustrojów na podłożach płynnych ma postać:

- jednolitej zawiesiny (wzrost dyfuzyjny) - względne beztlenowce (np. E. coli)

- kożuszka lub błonki - bezwzględne tlenowce (np. Micrococcus spp., Pseudomonas spp.)

- osadu - bezwzględne beztlenowce; przy ich hodowli probówkę należy dodatkowo zalepić parafiną (np. Clostridium spp.)

- w pewnym oddaleniu od powierzchni - mikroaerofile (do 5% tlenu; np. Helicobacter pylori).

6. Wzrost drobnoustrojów na podłożach stałych (płytki, skosy, słupki)

- na podłożach stałych na płytkach drobnoustroje tworzą kolonie:

kolonia - widoczne gołym okiem skupiska komórek, rozwijające się najczęściej z pojedynczej komórki; na agarze skośnym i w słupkach drobnoustroje nie tworzą kolonii ze względu na zbyt małą powierzchnię

ocena morfologii kolonii - wymiar, kształt, barwa, wyniosłość, powierzchnia, struktura, brzegi, przezroczystość, zawieszalność w płynach (ocena czy dana kolonia daje się zawiesić, czy nie), zapach, inne (np. typ hemolizy na agarze z krwią)

CFU (Colony Forming Unit) = tkj (tworzące kolonie jednostki (jednostka wzrostowa (komórki bakteryjne pochodzące z jednej komórki wyjściowej - jednostka taka, mnożąc się na podłożu stałym, wytworzy pojedynczą kolonię)

- agar skośny - drobnoustroje mogą rosnąć:

na całej powierzchni skosu (bakterie ruchliwe lub wydzielające dużo śluzu)

ruchliwości (drobnoustroje nieruchliwe - wzrost tylko w miejscu wkłucia; drobnoustroje ruchliwe - zmętnienie wokół wkłucia)

upłynnienia żelatyny (enzym - żelatynaza)

7. Hemoliza - zależy od stopnia lizy komórek:

- typ α - częściowa liza wokół kolonii - liza błony erytrocytów (zielone zabarwienie wokół kolonii); hemoglobina przekształca się w metHb; np. S. pneumoniae

- typ β - całkowita liza komórek wokół kolonii (widoczne przejaśnienie wokół kolonii); np. S. pyogenes

- typ γ - brak hemolizy; np. S. epidermidis.

8. Posiew - przeniesienie drobnoustrojów z hodowli lub badanego materiału do jałowej pożywki.

Posiew redukcyjny - posiew z izolacją w celu uzyskania pojedynczej kolonii.

9. Identyfikacja biochemiczna - badanie metabolizmu drobnoustrojów:

- metody biochemiczne umożliwiają zidentyfikowanie gatunków drobnoustrojów na podstawie znajomości wybranych komórkowych produktów przemian metabolicznych (katabolity - produkty rozpadu; anabolity - produkty syntezy)

odpowiednie podłoże odżywcze - zawiera określony substrat i wskaźnik wykazujący rozkład/brak rozkładu (np. Chapman, MCA); nie wystarcza do identyfikacji drobnoustrojów

szeregi biochemiczne - kilka/kilkanaście pożywek w probówkach, służących do wykrywania pojedynczych cech badanego szczepu (np. test IMVC [wytwarzanie indolu, reakcja z czerwienią metylową, reakcja Voges-Proskauera, test z cytrynianem sodu] - obecnie stosowany tylko dla Salmonella i Shigella w Sanepidzie); zasada - rozkład/brak rozkładu konkretnego związku (np. test z wytwarzaniem indolu)

gotowe testy chromogenne - w formie plastikowych szablonów z rzędem zagłębień, na dnie których znajdują się wysuszone/odwodnione preparaty; w wyniku rozkładu substratu powstaje barwny produkt; odczyt wizualny lub komputerowy

chromatografia gazowo-cieczowa - najczęściej wykorzystywana wyłącznie do badań naukowych ze względu na koszty; pozwala wykrywać śladowe ilości produktów metabolicznych; do identyfikacji beztlenowców

- identyfikacja i oznaczanie lekowrażliwości

- wyniki uzyskiwane w ciągu 5-10h (pałeczki Gram(-), ziarniaki Gram(+), Neisseria, Haemophilus, Corynebacterium, bakterie beztlenowe) lub 18h (drożdżaki)

METODY HODOWLI I IDENTYFIKACJI GRZYBÓW.

W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH PLEŚNI I DROŻDŻY

preparat mokry, w kropli NaCl, najczęściej niezabarwiony

barwienie metodą Grama - głównie w diagnostyce drożdży (formy nieregularne); grzyby nie są Gram(+), ponieważ ich ściana komórkowa nie posiada peptydoglikanu, ale barwią się tak, jak bakterie Gram(+), czyli na kolor fioletowy

preparat barwiony metodą negatywną - głównie w celu wykrywania otoczki

- blastospory - spory wytwarzane przez grzyby w drodze pączkowania

- postać inwazyjna - z niektórych blastospor wystają wypustki cytoplazmatyczne (ich obecność zawsze świadczy o zakażeniu)

izolacja prowadząca do powstania monokultury

ocena makroskopowa morfologii kolonii na podłożu stałym

podłoże klasyczne - podłoże Sabourauda:

- podstawowe podłoże do hodowli grzybów

- antybiotyki - chloramfenikol, gentamycyna

- do wykrywania chlamydosporów (grubościenne zarodniki przetrwalnikowe powstające ze strzępek grzybni, w wyniku wytworzenia się grubych ścian komórkowych) - podłoże Nickersona

- do wykrywania chlamydosporów i pseudogrzybni - podłoże PCB (ziemniaczano-marchwiowo-żółciowe)

- w bloczku agaru Sabourauda na szkiełku podstawowym

- głównie w diagnostyce grzybów pleśniowych i nitkowatych, niektórych drożdży

- cechy morfologiczne kolonii - barwa, czas wzrostu, kształt blastospor, tworzenie artrospor (komórki o charakterze zarodników przetrwalnikowych występujące u nitkowatych form sinic i u niektórych glonów)

+ podłoża selektywne - ChromAgar Candida, Candi Selected 4

- zdolność wytwarzania charakterystycznych wypustek w surowicy lub innych płynach ustrojowych

- wytwarzane po 1-3 h inkubacji w temperaturze 37^oC badanej kolonii z surowicą króliczą lub ludzką

- wynik dodatni - szczepy C. albicans i C. dubliniensis (te ostatnie bardzo rzadko powodują zakażenia)

- podłoża zubożałe - agar ryżowy z Tween80 lub podłoże kukurydziane (corn meal agar)

- inkubacja w 25 lub 30^oC; po 24-48h mikrohodowlę ogląda się w mikroskopie świetlnym pod małym powiększeniem

- wytwarzają grzybnię (mycelium) złożoną z rozgałęzionych komórek (strzępek - hyphae); u grzybów niższych strzępki są jednokomórkowe, zwykle wielojądrowe, natomiast u grzybów wyższych są podzielone poprzecznymi przegrodami (septami), a każda oddzielna komórka ma jedno jądro

powietrzna - rozwija się na powierzchni podłoża, często w formie puchu lub pleśni

substratowa (pożywkowa) - grzybnia wnikająca w podłoże

- dla większości optymalna temperatura mieści się w zakresie 18-22^oC (mała odporność na podwyższoną temperaturę - giną >60-70^oC; przeżywają tylko zarodniki), pH 5-6

- rosnąc powierzchniowo na podłożach mogą korzystać z dużych ilości tlenu " szybsze przyswajanie substancji odżywczych z podłoża.

- pleśnie wykorzystywane w produkcji żywności - niektóre gatunki grzybów są stosowane do produkcji enzymów proteolitycznych, amylolitycznych, celulolitycznych i innych, a także do produkcji kwasów organicznych (np. cytrynowego, glukonowego) i serów pleśniowych:

enzymy - Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma i inne

żywność orientalna (sosy sojowe) - Aspergillus flavus-oryzae

sery pleśniowe - Penicillium roqueforti, P. camemberti.

wzrost pleśni na produktach żywnościowych wywołuje niekorzystne zmiany (barwne naloty na powierzchni, mięknięcie, powstawanie śluzów, upłynnienie produktu)

rozwijają się na produktach suchych przechowywanych w wilgotnych warunkach oraz na produktach o bardzo dużym stężeniu cukru lub soli

w psuciu żywności biorą udział przedstawiciele różnych klas:

rodzaj Rhizopus i Mucor - szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, powodują psucie różnego rodzaju produktów żywnościowych (np. miękką zgniliznę owoców i warzyw, psucie mięsa przechowywanego w chłodni)

Rhizopus rozwija się często na chlebie (pleśń chlebowa)

najczęściej występują M. mucedo i R. nigricans

- najważniejsze znaczenie ma A. glaucus o szarozielonej barwie kolonii - powoduje psucie produktów suchych, a także o wysokiej zawartości cukru lub soli

- A. niger - tworzy czarne kolonie, jest przyczyną ciemnych plam na chlebie, warzywach, owocach

- kolonie o barwie niebieskiej, niebieskoszarej lub szarozielonej

- powoduje miękką zgniliznę owoców cytrusowych, psucie mięsa i jaj przechowywanych w chłodniach, pleśnienie serów, chleba i innych artykułów

Penicillium spp. i Aspergillus spp. zalicza się do tzw. pleśni magazynowych (rozwijają się na ziarnie zbożowym podczas przechowywania, powodując jego psucie oraz obniżenie wartości technologicznej i siewnej)

wiele szczepów wytwarza związki toksyczne - mykotoksyny:

- aflatoksyny - wytwarzane głównie przez A. flavus

- ochratoksyny - wytwarzane głównie przez A. ochraceus

- należy tu pleśń mleczna (Geotrichum lactis) będąca szkodnikiem produktów mleczarskich (rośnie na nich w postaci białego meszku; wykorzystując kwas mlekowy podwyższa pH, umożliwiając rozwój niepożądanych bakterii)

- przyczyna psucia chleba, owoców cytrusowych i mięsa przechowywanego w chłodni

rodzaj Monilia (Neurospora) - tworzy luźną, różowo zabarwioną grzybnię i często rozwija się na chlebie

rodzaje Cladosporium, Alternaria, Stemphylium - przyczyna ciemnienia lub powstawania czarnych plam na ziarnie, owocach, warzywach, mięsie, jajach

rodzaj Fusarium (czerwona pleśń) - powoduje psucie różnych produktów; gatunki tego rodzaju mogą wytwarzać mykotoksyny (np. zearalenon, grupa trichotecenów).

- preparat mikroskopowy - najczęściej przyżyciowy w kropli spłaszczonej

agar z brzeczką (półprodukt stosowany przy produkcji piwa lub miodu pitnego)

podłoże Chapka (brak wzrostu Rhizopus)

cechy morfologiczne kolonii obserwuje się zwykle do 2-3 tygodni

metoda zalewowa - nanoszenie płynnego rozcieńczenia na płytkę, a następnie zalanie jej płynnym podłożem

oznaczenie liczby pleśni należy wykonać tylko z jednego rozcieńczenia, z którego wyrosło ≤100 kolonii.

- ok. 1500 gatunków, z czego kilkanaście wykorzystuje się w procesach biotechnologicznych

- jednokomórkowce; rozmnażają się głównie przez pączkowanie

- optymalna temperatura wzrostu 20-30^oC przy pH 5-6

- tlenowce; w warunkach beztlenowych przeprowadzają fermentację alkoholową, która polega na beztlenowym rozkładzie cukrów prostych oraz niektórych dwu- i trójcukrów na alkohol etylowy i CO₂:

C₆H₁₂O₆ 2CH₃CH₂OH + 2CO₂ + 117 kJ (28 kcal)

- specyficzny składnik cytoplazmy - wolutyna (ziarnistości metachromatyczne, zapasowe źródło fosforanów; gromadzą się w komórkach podczas fermentacji, często brakuje ich w szybko rozmnażających się drożdżach

- w środowisku zasobnym w cukier mogą gromadzić glikogen (zużywany po wyczerpaniu węglowodanów

drożdże szlachetne - stosowane w przemyśle fermentacyjnym:

- paszowe - S. cerevisiae, Candida utilis, C. tropicalis, C. plucherrima, Rhodotorula

- winiarskie - S. cerevisiae, S. ellipsoideus

- browarnicze - S. cerevisiae, S. carlsbergensis

drożdże dzikie - szkodniki w przemyśle fermentacyjnym i przetwórstwie żywności; zanieczyszczenia:

najczęściej drożdże są oporne na wysokie stężenia SO₂ (używany często do konserwacji moszczów owocowych - sulfitacja moszczów)

przy dostępie tlenu rozwijają się Candida spp. i Pichia spp., które przeprowadzają przemianę etanol kwas octowy ester etylooctowy (zjełczały zapach wina)

mogą być przyczyną śluzowacenia i drożdżowego posmaku win

Pichia spp. i Kloeckera spp. biorą udział w przemianach związków siarki w winach, co w obecności etanolu sprzyja tworzeniu merkaptanów (nadają winom ostry, nieprzyjemny zapach)

Torulopsis, Pichia, Hansenula, Candida, Saccharomyces, Kloeckera

jedna z przyczyn mętnienia i drożdżowego posmaku piwa

zakażenie ograniczone dużym stężeniem alkoholu etylowego

w zacierach fermentacyjnych spotyka się głównie C. mycoderma (ma zdolność rozkładu etanolu do CO₂i H₂O zmniejszenie stężenia alkoholu w piwie)

- drożdże killerowe - produkują toksyny białkowe lub glikoproteinowe, które zabijają wrażliwe komórki drożdży tego samego lub innego gatunku

zdolność do wzrostu przy dużych stężeniach glukozy (60%)

rozwijają się na produktach o niskiej A_w (aktywność wody; minimum wody niezbędne dla rozwoju drobnoustrojów - czysta chemicznie woda ma wartość A_w = 1)

powodują psucie miodu, dżemu, syropów owocowych, soków

rozwijają się w marynatach i solankach (np. S. rouxi, S. mellis)

- inne drożdże niepożądane w żywności:

na osłonkach wędlin przechowywanych w lodówce - kredowe naloty

drożdże kożuchujące - psucie kiszonek

gatunki o właściwościach lipolitycznych - plamy na maśle i margarynie.

preparat bezpośredni - jeżeli badany materiał jest suchy (np. nalot na wędlinie) przed wykonaniem preparatu należy go rozetrzeć w 0,9% NaCl

preparat pośredni - np. połączony z barwieniem metodą Grama (drożdże są Gram(+))

preparat przyżyciowy niezabarwiony - najczęściej

barwienie przyżyciowe - oznaczenie żywotności ,wykrywanie substancji zapasowych

specjalne podłoża ubogie w składniki odżywcze (np. McClavy).

oznaczanie % zawartości martwych komórek:

- drożdże prasowane ≤5% martwych komórek

- drożdże suszone ≤25% martwych komórek

czerwonobrunatne ziarnistości glikogenu widoczne na tle jasnożółtej cytoplazmy

- badanie na obecność tłuszczu - zabarwienie komórek roztworem Sudanu krople tłuszczu barwią się na granatowo.

8. Cechy morfologiczne i fizjologiczne ważne w identyfikacji drożdży:

- kształt komórek - 6 podstawowych kształtów, często charakterystycznych dla poszczególnych rodzajów (kulisty, elipsoidalny, cytrynkowaty, butelkowaty, cylindryczny, nitkowaty)

- wielkość komórek - pomiar minimum 20 komórek; zwykle 1-8 μm długości i 1-6 μm szerokości

pseudogrzybni (pseudomycelium) - nitkowate struktury, często rozgałęziające się, złożone wyłącznie z komórek pączkujących lub pojedyncza, nitkowata komórka, mogąca rozgałęziać się, nieposiadająca przegród poprzecznych

- zdolność do wytwarzania zarodników:

następuje w warunkach głodowych populacji i jest sposobem na przerwanie niekorzystnych warunków środowiska

najlepiej tworzą się przy małej ilości węglowodanów w podłożu oraz przy dobrym dostępie tlenu

- fermentacja cukrów - posiew na podłoże z dodatkiem 2% badanego cukru

- wykorzystanie azotanu jako źródła azotu - posiew na podłoże zawierające witaminy, ale bez innych źródeł azotu

- wykorzystanie etanolu jako źródła węgla - posiew na podłoże z dodatkiem etanolu

- bezwzględne pasożyty wewnątrzkomórkowe

- posiadają białka wiążące receptor znajdujący się na powierzchni komórki

- wirion - pojedyncza cząsteczka wirusa

- wirusy powodujące choroby rozprzestrzeniane z żywnością:

2. Cechy odróżniające wirusowe choroby pokarmowe od bakteryjnych:

- zatrucie może wywołać obecność kilku cząsteczek wirusowych w żywności; w przypadku bakterii z reguły musi to być wysoka dawka

- duża liczba cząsteczek wirusa jest wydzielana z kałem przez osobę zakażoną; w przypadku bakterii zależy to od rodzaju i gatunku (np. Salmonella nie jest zakaźna dla otoczenia przez człowieka)

- nie mogą namnażać się w produktach żywnościowych i wodzie (muszą mieć gospodarza)

- wirusy pokarmowe są stosunkowo stabilne i kwasooporne poza komórkami żywiciela

- ich obecność w żywności jest trudna do stwierdzenia - zakażone produkty zachowują normalny zapach, wygląd i smak.

- rodzina Picornaviridae, rodzaj Hepatovirus

oporny na eter, chloroform, kwaśne pH (do 3)

ulega częściowej inaktywacji w temperaturze 60^oC (10 min), całkowitej w 85^oC (5 min) lub 90^oC (90 sek)

inaktywacja także pod wpływem chloraminy

- niezróżnicowany antygenowo jeden serotyp (po zachorowaniu odporność trwała)

- droga zakażenia - fekalno-oralna, rzadziej kontakt bezpośredni

- źródło zakażenia - zanieczyszczona woda i żywność:

mleko i produkty mleczne (zwłaszcza śmietana)

- wysoce inwazyjny - penetruje przez śluzówkę jelita do wątroby (komórkami docelowymi są hepatocyty), gdzie ulega replikacji:

okres inkubacji 15-50 dni (średnio 28 dni)

objawy penetracji - gorączka, bóle brzucha, nudności, później żółtaczka (możliwe też przypadki bezżółtaczkowe), wzrost aktywności aminotransferaz, powiększenie wątroby

większość zakażeń u dzieci poniżej 6 r.ż. przebiega bezobjawowo lub skąpoobjawowo, natomiast u starszych dzieci i dorosłych 70-80% ma przebieg objawowy

- wydalanie wirusa - zwykle 14-21 dni przed i 7 dni po wystąpieniu żółtaczki; mogą wystąpić nawroty choroby i wtedy wydalanie cząsteczek wirusa może trwać do 90 dni

- prawdopodobnie wiek pacjenta i dawka wirusa są wprost proporcjonalne do nasilenia objawów choroby

przestrzeganie higieny osobistej i sanitarnej

obróbka termiczna półproduktów żywnościowych

unikanie wtórnych zanieczyszczeń gotowych produktów

stosowanie w produkcji tylko wody zdatnej do picia

szczepionka (zawiera inaktywowany formaldehydem wirus HAV) - zalecana u osób narażonych na kontakt z zakażeniem (ryzyko zawodowe, kontakt z osobą zakażoną, częste przyjmowanie zastrzyków, duża liczba partnerów seksualnych)

metody bezpośrednie - wykrywanie obecności i identyfikacja wirusa, jego antygenów lub kwasu nukleinowego w materiale klinicznym

metody pośrednie - ocena odpowiedzi immunologicznej organizmu na zakażenie (oznaczenie w surowicy przeciwciał anty-HAV w klasie IgM i IgG):

pojawiają się w okresie wylęgania choroby

najwyższe stężenie między 2 a 3 tygodniem ostrego okresu choroby

mogą utrzymywać się do 3-6 miesięcy w typowo przebiegających przypadkach

wykrywanie swoistych IgM - obecne lub niedawno przebyte zakażenie

pojawiają się w ostrym okresie choroby

mają charakter przeciwciał odpornościowych

wykrywanie swoistych IgG (bez IgM) - wskazuje na przebyte zakażenie, lecz bez możliwości określenia czasu

metody biologii molekularnej - RT-PCR (wykrywanie HAV-RNA we krwi lub kale); nie są stosowane w rutynowej diagnostyce.

4. Wirusy wywołujące zapalenie żołądka i jelit (gastroenteritis):

- namnażają się w przewodzie pokarmowym zakażonej osoby, wydalane są z kałem

materiały opakowaniowe - papier, wata, aluminium, porcelana, lateks, polistyren

najczęstszy czynnik etiologiczny ostrych biegunek u niemowląt i małych dzieci do 2 r.ż. (grypy żołądkowe)

droga zakażenia - fekalno-oralna, możliwa także kropelkowa

okres inkubacji 1-3 dni; wydalany z kałem przez 4-8 dni

wysoce zakaźne (10-100 wirusów) i wysoce oporne na środki dezynfekcyjne

objawy - wymioty, biegunka, gorączka, bóle brzucha, osłabienie, złe samopoczucie, jadłowstręt; zdarzają się zakażenia bezobjawowe

prawie każde dziecko ulega zakażeniu przed ukończeniem 5 r.ż.

ochronne działanie ma świeże krowie mleko - zawiera zwykle przeciwciała neutralizujące wirusy

- przestrzeganie higieny osobistej i sanitarnej

- obróbka termiczna półproduktów żywnościowych

- unikanie zanieczyszczeń wtórnych gotowych produktów

- dostępne szczepionki doustne (poniżej 5 miesiąca życia) - nie na wszystkie serotypy, nieobowiązkowe, niefinansowane

najczęściej zakażenia dróg oddechowych i oczu

serotypy 40 i 41 podrodzaju F wywołują ostre zapalenie żołądka i jelit (głównie u dzieci)

powikłania - wgłębienie jelit (wsunięcie się jednego odcinka jelita do drugiego, np. końcowego odcinka jelita cienkiego do jelita grubego; może powodować ostrą niewydolność jelit)

- ulega inaktywacji w temperaturze 56^oC (10 min)

- diagnostyka rotawirusów i adenowirusów:

wykrycie wirusów w materiale klinicznym nie oznacza zakażenia

mikroskopia elektronowa - nie stosowana rutynowo

w hodowlach komórkowych namnażają się trudno lub wcale (permidywność - nie wszystkie wirusy namnażają się we wszystkich liniach komórkowych; wirus zakaża i replikuje się tylko w takiej linii komórkowej, które zawiera odpowiednie dla niego receptory):

- adenowirusy - np. hodowla komórek z nerki małpy, HeLa

- rotawirusy - np. pierwotna hodowla z małpiej nerki

immunochromatograficzny test do jednorazowego wykrywania w kale rotawirusów i adenowirusów - test jakościowy, którego zasada działania opiera się na wiązaniu specyficznych przeciwciał monoklonalnych (znakowanych substancją barwną) z odpowiednimi wirusami.

produkt	temperatura transportu [^oC]	wykonanie analizy
świeży i schłodzony	0-4	- 24h od przyjęcia próbki do badań - >24h to konieczne jest obniżenie temperatury do -18^oC
mrożony i niskomrożony	≤-18	przed upływem terminu przydatności do spożycia
w uszkodzonym opakowaniu	0-4	<48h
trwały i pasteryzowany	pokojowa	przed upływem terminu przydatności do spożycia

środek spożywczy	rodzaj drobnoustroju	n	c	limit w 1g
	rodzaj drobnoustroju	n	c				m	M
	wędliny surowe i surowo wędzone	bakterie z grupy coli	5	1	0	-
		Salmonella	5	0	0	-
		S. aureus	5	1	10²	5 x 10²
		wszystkie próbki <„m”			akceptacja partii
		≤„c” próbek z „n”>„m”			akceptacja partii
		>„c” próbek z „n”>„m”			odrzucenie partii

środek spożywczy	rodzaj drobnoustroju	n	c	limit w 1g
								m	M
	wędliny surowe i surowo wędzone	bakterie z grupy coli	5	1	0	-
		Salmonella	5	0	0	-
		S. aureus	5	1	10²	5 x 10²
		wszystkie próbki <„m”			akceptacja partii
		≤„c” próbek z „n”>„m” oraz ≤„M”
		>„c” próbek z „n”>„m” oraz ≤„M”					odrzucenie partii
		jakakolwiek próbka >M

Nazwa metody	Wynik
barwienie proste pozytywne
metoda Löfflera	jednolite niebieskie zabarwienie (wyjątek - Corynebacterium; zabarwione nierównomiernie)
barwienie safraniną	jednolite czerwone zabarwienie
barwienie proste negatywne
barwienie nigrozyną	tło ciemne drobnoustroje niezabarwione
barwienie złożone pozytywno-negatywne
metoda Burri-Ginsa	ciemne tło jasne otoczki (uwidocznienie otoczek) czerwone komórki bakteryjne
metoda Dornera	ciemne tło czerwone przetrwalniki
barwienie złożone pozytywne
metoda Grama	Gram(+) - fioletowe Gram(-) - czerwone/różowe Gram-chwiejne - czerwono-fioletowe (np. Corynebacterium)
metoda Neissera	komórki bakterii żółto-zielone ziarna metachromatyczne (Babesa-Ernst'a) granatowe
metoda Waysona (barwienie preparatów bezpośrednich)	komórki bakterii ciemnogranatowe inne komórki (nabłonki, leukocyty) jasnofioletowo-granatowe
metoda Wirtza-Conklina	komórki bakterii czerwone przetrwalniki zielone (metoda barwienia przetrwalników)
barwienie złożone pozytywne - metody barwienia bakterii kwasoopornych
metoda Ziehl-Neelsena	bakterie kwasooporne (np. prątki) czerwone tło i pozostałe bakterie niebieskie
metoda Kinyoun-Gabett'a	efekt barwienia j.w.
metoda Kinyoun	bakterie kwasooporne czerwone tło i pozostałe bakterie zielone