LABOLATORIUM Z BIOTECHNOLOGII

KINETYKA PROCESÓW FERMENTACYJNYCH

Prowadzący:

dr inż. Celina Kubik

Wykonała:

Karolina Sędkowska

Data wykonania: 14 kwietnia 2008 r.

Ochrona Środowiska

Grupa dziekańska I

Poniedziałek 8.15-12.00

WSTĘP TEORETYCZNY

Kinetyka wzrostu drobnoustrojów jest uwarunkowana zarówno rodzajem drobnoustrojów, dostępnością substratów oraz ilością tlenu, jak i rodzajem procesu. Inaczej przebiega rozwój drobnoustrojów w klasycznym procesie biosyntezy (hodowle okresowe), a inaczej w procesach ciągłych czy półciągłych.

Według klasyfikacji Gadena produkty fermentacyjne podzielono na trzy grupy. Do pierwszej z nich zalicza się produkty syntezowanie podczas wzrostu drobnoustrojów i zanikające w fazie stacjonarnej hodowli. Druga grupa to taka, gdzie gromadzenie produktu jest pośrednio związane ze wzrostem - zachodzi zarówno w komórkach rosnących jak i nierosnących. W trzeciej grupie tworzenie produktu nie jest związane ze wzrostem komórek drobnoustrojów, ma miejsce tylko w komórkach nierozwijających się.

Aby móc wydajnie kierować procesem biosyntez mikrobiologicznej, ważne jest, aby poznać zależność pomiędzy wzrostem szczepu a tworzeniem produktu, fizjologie drobnoustrojów, a także fazowości procesów mikrobiologicznych.

Do badań użyto kwasu cytrynowego wytworzonego przez szczep Aspergillus niger oraz dekstranazy powstałej w wyniku hodowli szczepu Penicillium funiculosum.

Kwas cytrynowy występuje w niewielkich ilościach w większości organizmów żywych, gdyż spełnia ważną rolę w ich metabolizmie - jest ważnym produktem przejściowym w cyklu Krebsa. W większych ilościach występuje w niektórych owocach, np. w cytrynach, w których stanowi nawet do 8% suchej masy. Kwas cytrynowy jest używany jako regulator kwasowości i przeciwutleniacz w przemyśle spożywczym. Sole kwasu cytrynowego - cytryniany - są stosowane jako leki przy niedoborze określonego metalu w organizmie.

Dekstran to polimer glukozy połączonej głównie wiązaniami α-1,6-D-glikozydowymi. Wytwarzany jest przez bakterie kwasu mlekowego. Ma wysoki ciężar cząsteczkowy i jest rozpuszczalny w wodzie. Stosuje się go jako płyn krwiozastępczy. W technologii żywności można by stosować go jako zagęstnik, dzięki któremu można uzyskać półstałą konsystencję produktów. Dekstran nie jest jednak dopuszczony przez FAO/WHO jako dodatek do żywności. Stanowi surowiec do produkcji materiałów chromatograficznych, tzw. żeli dekstranowych. Bakterie zasilające przewód pokarmowy człowieka i zwierząt są zdolne do rozkładu dekstranu, co powoduje szybki wzrost zawartości cukru we krwi oraz glikogenu w wątrobie.

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest poznanie relacji między wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem produktów na przykładzie dwóch procesów biotechnologicznych: biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus Niger oraz dekstranazy przez Penicillium funiculosum.

WYKONANIE ĆWICZENIA

1. Oznaczenie suchej masy grzybni (Aspergillus Niger i Penicillium funiculosum).

25 ml wyrośniętej, wgłębnej grzybni oddzielono od podłoża na lejku Büchnera, używając do tego celu bibuły filtracyjnej. Następnie pozostałość na lejku przemyto acetonem i wysuszono w suszarce. Suchą masę grzybni zważono przy pomocy wagi analitycznej. Ilość biomasy podano w gramach na 1000 ml płynu pohodowlanego. W tym celu masę odczytaną z wagi pomnożono razy 40. Wyniki przedstawia tabela 1.

Tabela 1. Ilość biomasy w zależności od czasu hodowli.

Doba	Biomasa [g/l]
		Aspergillus Niger	Penicillium funiculosum
2	4,7	4,5
3	4,1	7,8
4	5,5	4,0
5	-	2,7
6	5,9	3,1
7	5,1	-

2. Oznaczenie kwasowości ogólnej przesączu (Aspergillus Niger)

Pobrano po 2 ml przesączu po oddzieleniu grzybni Aspergillus Niger i miareczkowano 0,1 n roztworem wodorotlenku sodu w obecności fenoloftaleiny. 1 cm³ 0,1 n NaOH użytego do miareczkowania przesączu odpowiada 0,0064 g kwasu cytrynowego.

Przykładowe obliczenie dla przesączu po 2 godzinach hodowli:

gdzie:

x - masa wytworzonego kwasu cytrynowego, [g / l];

V_NaOH - objętość 0,1 n NaOH użytego do miareczkowania 2 ml przesączu, [ml];

500 - przeliczenie na masę kwasu cytrynowego w 1000 ml płynu po hodowli.

Pozostałe obliczenia dla kwasu cytrynowego wykonano w analogiczny sposób. Wyniki zestawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Ilość otrzymanego kwasu cytrynowego z hodowli Aspergillus niger zależnie od czasu hodowli.

Doba	Kwas cytrynowy [g / l]
		I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	Średnia
2	2,2	2,1	2,2	1,6	1,9	2,6	1,9	2,2	2,1
3	8,6	-	8,3	8,3	8,3	6,4	7,7	8,6	8,0
4	10,9	8,8	9,0	11,2	9,3	10,2	10,0	9,2	9,8
5	18,2	15,3	16,6	18,2	16,3	16,0	18,6	15,7	16,9
6	33,0	30,6	30,7	31,7	30,4	33,6	31,0	29,9	31,4
7	35,2	32,2	36,5	34,9	33,6	33,9	33,6	32,5	34,1

Rysunek 1. Zmiany stężenia biomasy Aspergillus niger oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w ciągu 7 dni hodowli.

Rysunek 2. Zmiany stężenia biomasy Aspergillus niger oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w kolejnych dobach hodowli.

3. Oznaczenie aktywności dekstranazy (Penicillium funiculosum).

Oznaczenie aktywności dekstranazy rozpoczęto od wykonania rozcieńczeń przesączu po oddzieleniu biomasy Penicillium funiculosum.

Tabela 3. Wartości rozcieńczeń cieczy pohodowlanej w zależności od czasu hodowli szczepu Penicillium funiculosum.

Doba	Rozcieńczenie
2	200
3	400
4	400
5	600
6	600

Do probówek wprowadzono po 0,5 ml roztworu dekstranu 110 oraz 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonej cieczy pohodowlanej. Reakcję prowadzono w temperaturze 45 ⁰C przez dokładni 10 minut. Po upływie tego czasu do mieszaniny reakcyjnej wprowadzono 1 ml odczynnika miedziowego i umieszczono całość na kolejne 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie roztwory schłodzono i dodano po 1 ml odczynnika Nelsona. Barwne mieszaniny rozcieńczono zależnie od intensywności barwy (dopełniano do 10 ml, 25 ml lub 50 ml objętości). W między czasie wykonano próbę kontrolną, analogicznie jak próby właściwe, lecz zamiast cieczy pohodowlanej w probówce umieszczono 0,5 ml wody destylowanej. Absorbancję zmierzono przy długości fali 520 nm wobec próby kontrolnej.

Na podstawie krzywej wzorcowej obliczono ilość μg izomaltozy w 1 ml badanego roztworu. Przykładowe obliczenie dla roztworu, który zawierał ciecz po 2 dobach hodowli szczepu Penicillium funiculosum:

0,1 - 325 [μg/ml]

0,01 - A [μg/ml]

A = 32,5 [μg/ml]

Dalej obliczono aktywność dekstranazy korzystając ze wzoru:

gdzie:

X - aktywność dekstranazy, [J/ml];

A - ilość μg izomaltozy w 1 ml badanego roztworu, odczytana z krzywej wzorcowej, [μg/ml];

2 - rozcieńczenie enzymu w mieszaninie reakcyjnej;

R - rozcieńczenie cieczy pohodowlanej;

342 - mikromol izomaltozy;

10 - czas trwania reakcji enzymatycznej, [min].

Za 1 jednostkę dekstranazy (1 J) przyjmuje się ilość enzymu, która z dekstranu 110 uwalnia cukry redukujące w ilości równoważnej jednemu mikromolowi izomaltozy w ciągu 1 minuty, w temperaturze 50 ⁰C, w pH 5,4.

Przykładowo:

Pozostałe obliczenia wykonano w analogiczny sposób. Wyniki zestawiono w tabeli 4.

Tabela 4. Aktywność dekstranazy w zależności od czasu hodowli szczepu Penicillium funiculosum.

Doba	Aktywność dekstranazy [J/ml]
		I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	Średnia
2	-	-	-	3,8	58,9	-	-	11,4	24,7
3	-	-	-	136,8	87,4	-	-	159,6	127,9
4	-	-	-	129,2	106,4	-	-	136,8	124,1
5	-	-	-	171,1	125,4	-	-	199,6	165,4
6	-	-	-	205,3	193,7	-	-	153,9	184,3

Rysunek 3.Zmiany stężenia biomasy Penicillium funiculosum oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w ciągu 7 dni hodowli.

Rysunek 4.Zmiany stężenia biomasy Penicillium funiculosum oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w kolejnych dobach hodowli.

WNIOSKI

Patrząc na Rysunek 1 oraz Rysunek 3 zauważyć można, że tworzenie produktu ma miejsce zarówno podczas namnażania się komórek drobnoustrojów jak i wówczas, kiedy wzrost biomasy ustabilizuje się. Dotyczy to zarówno hodowli szczepu Aspergillus niger jak i Penicillium funiculosum. Zgodnie z tym stwierdzeniem badane procesy biosyntezy zaliczyć należy do drugiej grupy według klasyfikacji Gadena. Porównując te obserwacje z danymi literaturowymi obserwuje się błędną analizę w stosunku do produkcji dekstranazy - powszechnie zaliczana jest ona do trzeciej grupy Gadena.

W hodowli Penicillium funiculosum obserwuje się maksymalne stężenie biomasy w trzeciej dobie trwania procesu (Rysunek 3). Patrząc na dynamikę wzrostu biomasy Aspergillus niger (Rysunek 1) nie dostrzega się takiego maksimum - stężenie biomasy wzrasta w tym przypadku podczas trwania całego procesu.

Obserwując Rysunek 2 i Rysunek 4 wnioskuje się, że maksymalny przyrost biomasy Aspergillus niger oraz Penicillium funiculosum ma miejsce od początku trwania hodowli do drugiej doby, a następnie przyrost ten maleje. Produkcja kwasu cytrynowego jest najbardziej wydajna w szóstej dobie biosyntezy, a produkcja dekstranazy w trzeciej.

9