1. Rola słabych oddziaływań molekularnych.

Odwracalne oddziaływania molekularne stanowią istotę funkcjonowania życia. Słabe, niekowalencyjne siły wiązania pełnią kluczową rolę w wiernej replikacji DNA, zwijaniu się białek w struktury trójwymiarowe, w rozpoznawaniu specyficznych substratów przez enzymy i wykrywaniu cząsteczek sygnałowych. Istotnie wszystkie biologiczne struktury i procesy zależą od współgrania zarówno oddziaływań niekowalencyjnych jak kowalencyjnych.

Wyróżniamy trzy zasadnicze rodzaje wiązań niekowalencyjnych, różnią się geometrią, siłą i specyficznością:

1Wiązania elektrostatyczne (jonowe). Obdarzona ładunkiem grupa substratu może przyciągać przeciwnie naładowaną grupę znajdującą się na cząsteczce enzymu. Siłę (F) tego przyciągania elektrostatycznego określa prawo Coulomba:

q₁ q₂

E = k __

r D

Gdzie: q₁ i q₂- ładunki obu grup, r- odległość pomiędzy nimi, D- stała dielektryczna środowiska. Przyciąganie elektrostat. najsilniejsze jest w próżni (D=1), a najsłabsze np. w wodzie (D=80), k- stała proporcjonalności k= 1389 kJ/mol

2 Wiązania wodorowe. Atom wodoru może stać się wspólny dla dwóch wzgędnie elektroujemnych innych atomów. Atom, z którym wodór jest ściślej związany, jest donorem wodoru, a drugi atom- akceptorem wodoru. Atom akceptorowy ma ładunek ujemny, który powoduje przyciąganie at. wodoru. Wiązanie wodorowe jest to stan przejściowy w proc. przeniesienia wodoru z kwasu do zasady. Donorem wodoru jest atom tlenu lub azotu, kowalencyjnie związany z at. wodoru. Akceptorem wodoru jest tlen albo azot. Wiązania wod.są silniejsze od wiązań van der Waalsa, ale dużo słabsze od wiązań kowalencyjnych. Ważną cechą wiązań wod. jest ich ściśle ukierunkowany charakter.

3Wiązanie van der Waalsa, niespecyficzna siła przyciągania pojawiająca się kiedy dwa atomy zbliżają się na odległość od 0,3 do 0,4 nm. Jest spowodowane zachodzącymi w czasie zmianami rozkładu ładunków elektronowych wokół atomu. W określonej chwili rozkład ładunków nie jest dokładnie symetryczny. Ta przejściowa asymetria ładunków elektronowych wokół atomu narusza rozkład elektronów w atomach sąsiednich. Siła przyciągania się dwóch at. rośnie , kiedy odległość między nimi maleje do odległości van der Waalsa. Zbliżenie na mniejsze odległości powoduje pojawienie się większych sił odpychających, wywołanych nakładaniem się zewnętrznych chmur elektronowych atomów. Znaczenie sił van der Waalsa w wiązaniu międzycząsteczkowym pojawia się wtedy, kiedy w jednej parze cząsteczek wiele atomów jednej cząsteczki wchodzi jednocześnie w bliski kontakt z licznymi atomami drugiej cząsteczki. Jest to możliwe gdy kształty cząsteczek są do siebie dopasowane.

2. Funkcje białek.

Białka odgrywają decydującą rolę właściwie we wszystkich procesach biologicznych.

Funkcje:

1 Kataliza enzymatyczna.

Prawie wszystkie reakcje enzymatyczne zachodzące w układach żywych są katalizowane przez enzymy, które są bardzo silnymi katalizatorami. Zwiększają szybkość reakcji chem. przynajmniej milion razy. Prawie wszystkie znane enzymy są białkami. Białka zatem są odpowiedzialne za kierunek przemian w układach biologicznych.

2 Transport i magazynowanie.

Transport wielu małych cząsteczek i jonów zachodzi z udziałem białek. Np. hemoglobina, przenosząca tlen w krwinkach czerwonych oraz mioglobina odpowiedzialna za transport tlenu w mięśniach.

3 Ruch uporządkowany.

Są głównym składnikiem mięśni. Przesunięcie się dwu rodzajów włókien białkowych względem siebie prowadzi do skurczu mięśnia.

4 Funkcje mechaniczno- strukturalne.

5 Ochrona immunologiczna.

Białka o dużej swoistości, które rozpoznają substancje obce dla ustroju i łączą się z nimi to przeciwciała. Odgrywają więc istotną rolę w rozróżnianiu między tym, co własne i obce dla danego organizmu.

6 Wytwarzanie i przekazywanie impulsów nerwowych

Reakcja komórek nerwowych na specyficzne bodźce przebiega z udziałem białek receptorowych, np. rodopsyny.

7 Kontrola wzrostu i różnicowania

Kontrola odpowiedniej kolejności ekspresji informacji genetycznej jest zasadniczym warunkiem uporządkowania wzrostu i różnicowania komórek. Aktywność różnych komórek koordynują hormony, wiele z nich jest białkami np. insulina. Białka funkcjonują w komórkach jako czujniki kontrolujące przepływ energii i materii.

3. Aminokwasy wchodzące w skład białek.

Aminokwasy są podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek. Aminokwas jest zbudowany z grup: karboksylowej, aminowej, atomu wodoru oraz charakterystycznej grupy R, które wiążą się kowalencyjnie z atomem węgla, określanym jako węgiel α. Ten atom węgla nazwano α , ponieważ sąsiaduje on z grupą karboksylową (kwaśną). Grupę R nazywamy łańcuchem bocznym aminokwasu.

Białka zbudowane są wyłącznie z L- aminokwasów. W białkach powszechnie występuje 20 aminokwasów, których łańcuchy boczne różnią się wielkością, kształtem, ładunkiem elektrycznym, zdolnością do tworzenia wiązań wodorowych oraz reaktywnością chemiczną. Najprostszym aminokwasem wyst.w białkach jest glicyna, której łańcuchem bocznym jest tylko atom wodoru, następnym jest alanina z grupą metylową stanowiącą łańcuch boczny.Większe łańcuchy występują w walinie, leucynie i izoleucynie.Łańcuchy boczne tych aminokwasów mają charakter hydrofobowy, co polega na awersji do wody i skłonności do grupowania się. Jest to czynnik stabilizujący strukturę przestrzenną białek rozpuszczonych w wodzie.

COO ⁻ COO⁻ H COO⁻

| | | |

⁺H₃N_ C _H ⁺H₃N _ C _ H ⁺H₃N_ C _ COO^{− +}H₃N_ C _ H

| | | |

H CH₃ CH CH₂

• \ |

H₃C CH₃ CH

/ \

H₃C CH₃

Glicyna (Gly, G) Alanina (Ala, A) Walina (Val, V) Izoleucyna (Ile, I)

Prolina ma łańcuch boczny różniący się od pozostałych 19 aminokwasów. Łańcuch b. jest związany nie tylko z węglem α, ale również z grupą aminową. Fenyloalanina zawiera pierścień fenylowy, połączony z grupą metylenową. Pierścień aromatyczny tyrozyny zawiera grupę hydroksylową, która sprawia, że tyrozyna jest mniej hydrofobowa od fenyloalaniny. Tryptofan ma pierścień indolowy połączony z grupą metylenową.

COO⁻



⁺H₂N _ C _ H

• |

H₂C CH₂

\ /

CH₂

Prolina (Pro, P)

Atom siarki występuje w łańcuchu bocznym dwóch aminokwasów. Cysteina zawiera grupę hydrosulfidową (_SH), a metionina ma atom siarki związany tioestrowo (_S_CH₃). Oba te łańcuchy zawierające siarkę mają charakter hydrofobowy. Seryna i treonina w alifatycznym łańcuchu bocznym zawierają grupy hydroksylowe, które powodują, że te aminokwasy są bardziej hydrofilowe i reaktywne niż alanina i walina.

W pH obojętnym lizyna i arginina są naładowane dodatnio. Histydyna nat.może być obojętna lub mieć ładunek dodatni zależnie od jej lokalnego otoczenia. W zestawie tych aminokwasów znajdują się również dwa z kwasowymi łańcuchami bocznymi, są to kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Ich boczne łańcuchy w pH fizjologicznym są niemal zawsze ujemnie naładowane. Glutamina i asparagina- to pochodne glutaminianu i saparaginianu , które nie mają ładunku w łańcuchu bocznym na skutek pojawienia się grupy amidowej.

Skrótowe oznaczenia aminokwasów:

1 Alanina Ala A

2 Arginina Arg R

3 Asparagina Asn N

4 Kwas asparaginowy Asp D

5 Asparagina lub kwas asparaginowy Asx B

6 Cysteina Cys C

7 Fenyloalanina Phe F

8 Glicyna Gly G

9 Glutamina Gln Q

• Kwas glutaminowy Glu E

• Glutamina lub kwas glutaminowy Glx Z

• Histydyna His H

• Izoleucyna Ile I

• Leucyna Leu L

15 Lizyna Lys K

16 Metionina Met M

17 Prolina Pro P

18 Seryna Ser S

19 Treonina Thr T

20 Tryptofan Trp W

21 Tyrozyna Tyr Y

22 Walina Val V

4. Główne grupy aminokwasów.

1 Glicyna, alanina.

2 Walina, leucyna, izoleucyna.

3 Prolina

4 Fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan.

5 Cysteina, metionina

6 Seryna, tronina

7 Lizyna, arginina, histydyna, asparaginian(kw.asparaginowy), glutaminian (kw.glutaminowy), asparagina, glutamina.

Reszty aminokwasowe można pogrupować w zależności od ich potencjalnych możliwości tworzenia wiązań wodorowych:

1 Łańcuchy boczne tryptofanu i argininy służą wyłącznie jako donory w wiązaniach wodorowych.

2 Łańcuchy boczne asparaginy, seryny i treoniny, podobnie jak ugrupowania peptydowe, mogą służyć jako donory i akceptory w wiązaniach wodorowych.

3 Możliwości tworzenia wiązań wodorowych przez lizynę (oraz końcową grupę aminową), kwas glutaminowy i asparaginowy (oraz końcową grupę karboksylową), tyrozynę i histydynę, zmieniają się w zależności od pH. Wymienione grupy mogą służyć jako akceptory i donory wodoru w pewnych zakresach pH oraz jako akceptory, albo donory (lecz nie jednocześnie) w innych zakresach pH.

5. Podać wzory: alaniny, seryny, cysteiny i fenyloalaniny.

6. Podać wzory: adeniny, adenozyny i adenozynomonofosforanu.

7. Wiązanie peptydowe.

W białkach wiązanie peptydowe (amidowe) łączy grupę karboksylową jednego aminokwasu z grupą aminową drugiego aminokwasu. Wiele aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym tworzy łańcuch polipeptydowy. Jednostkę aminokwasu wbudowaną w łańcuch polipeptydowy nazywamy resztą tego aminokwasu. W łańcuchach polipeptydowych możemy wyznaczyć kierunek, ponieważ jego składniki mają dwa różne końce. Z jednej strony aminową, a z drugiej grupę karboksylową. Jako początek łańcucha polipeptydowego umownie przyjęto jego koniec aminowy, czyli koniec N i dlatego sekwencją aminokwasową łańcucha polopeptydowego zapisuje się poczynając od reszty aminokwasowej z wolną (końcową) grupą α-aminową. Łańcuch polipeptydowy jest złożony z powtarzających się regularnie fragmentów, tworzących łańcuch główny, oraz z fragmentów zmiennych charakterystycznych łańcuchów bocznych różnych aminokwasów. Łańcuch główny czasem nazywa się szkieletem.

8. Punkt izoelektryczny białka.

Punkt izoelektryczny (pI) -jest to takie pH, przy którym jego wypadkowy ładunek jest równy zeru. W tym pH ruchliwość elektroforetyczna jest równa zeru, ponieważ wypadkowy ładunek cząsteczki białka wynosi zero.

Metoda rozdzielenia białek ze względu na ich punkt izoelektryczny nazywa się ogniskowaniem izoelektrycznym.

9. Poziomy struktury białek

Strukturę białek najprościej można podzielić na 4 poziomy organizacji strukturalnej, zwane rzędowością. Wyróżniamy strukturę pierwszorzędową, drugorzędową, trzeciorzędową i czwartorzędową.

Reszty aminokwasów w łańcuchach polipeptydowych mogą występować w różnej liczbie i kolejności. Kolejność -SEKWENCJA AMINOKWASÓW-jest charakterystyczna dla poszczególnych białek i jest zdeterminowana genetycznie. Określa się ją jako PIERWSZORZĘDOWĄ STRUKTURĘ BIAŁEK.

Łańcuchy polipeptydowe białka mają określoną budowę przestrzenną (konformację).

Układ przestrzenny atomów głównego łańcucha polipeptydowego, bez uwzględnienia konformacji łańcuchów bocznych, nazwano DRUGORZĘDOWĄ STRUKTURĄ.

Najważniejsze typy struktury drugorzędowej białek:

α- helisa (zostaje utworzona jeżeli wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy wiązaniami peptydowymi w obrębie tego samego łańcucha)

β-harmonijka (zostaje utworzona jeżeli wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy wiązaniami peptydowymi różnych łańcuchów).

Pomiędzy fragmentami łańcucha polipeptydowego o zdeterminowanej strukturze drugorzędowej mogą występować oddziaływania grup funkcyjnych łańcuchów bocznych, prowadzące do wytworzenia między tymi grupami różnych wiązań: jonowych, disiarczkowych, hydrofobowych, a także wodorowych.

Istnienie wymienionych oddziaływań w łańcuchu polipeptydowym powoduje, iż łańcuch ten tworzy przestrzennie pofałdowane i powyginane skupiska. Jest to tzw. TRZECIORZĘDOWA STRUKTURA CZĄSTECZKI BIAŁKA.

Białka o dużej masie cząsteczkowej mają tzw. budowę oligomeryczną i składają się z podjednostek -protomerów, tj. łańcuchów polipeptydowych o określonej strukturze pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowej.

Pomiędzy protomerami mogą występować wiązania identyczne z tymi, które odpowiedzialne są za stabilizację struktury trzeciorzędowej białek. Łańcuchy polipeptydowe zajmują w stosunku do siebie określone pozycje i to wzajemne przestrzenne ułożenie (dopasowanie) takich łańcuchów, które tworzą konformację białka oligomerycznego, nosi nazwę CZWARTORZĘDOWEJ STRUKTURY.

10. Struktura β

β -struktura „harmonijkowa”, zwana strukturą „pofałdowanej kartki”.

W tej strukturze nie występują wiązania wodorowe w obrębie jednego łańcucha.

β- struktura pofałdowanej kartki występuje w wielu białkach, zarówno w globularnych, rozpuszczalnych, jak i wielu włókienkowych (np. w fibroinie jedwabiu).

• Jest bardziej rozbudowaną strukturą niż α - helisa i jest „spłaszczona”, ponieważ wiązania C-C są tetrahedryczne i nie leżą w linii prostej.

• Łańcuchy leżą obok siebie, wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy grupą -CO jednego wiązania peptydowego i grupą -NH wiązania peptydowego sąsiedniego łańcucha.

• Łańcuchy mogą przebiegać w tym samym kierunku, tworząc równoległą β -strukturę pofałdowanej kartki, lub mogą przebiegać w przeciwnych kierunkach, jak to czynią w przypadku białka globularnego, gdzie wydłużony łańcuch zawija się na sobie w przeciwnym kierunku, tworząc antyrównoległą β -strukturę pofałdowanej kartki.

β - zwój jest najściślejszym zwojem, jaki może przybrać łańcuch polipeptydowy, chociaż jest wiele możliwych sposobów zwinięcia go. β - zwój wynika z przybrania całkowicie odwrotnego kierunku łańcucha polipeptydowego w obrębie czterech reszt aminokwasowych.

11. Struktura helisy α

Śrubowo zwinięty łańcuch w kształcie prawoskrętnej linii śrubowej tzw. „α - heliks”. Stabilność tej strukturze nadają wiązania wodorowe pomiędzy poszczególnymi skrętami ( atomem tlenu grupy karbonylowej > CO, a protonem grupy - NH).

α - helisa jest rurkowatą strukturą, w której wiązania peptydowe zwijają się, ściśle wewnątrz, a łańcuchy boczne sterczą na zewnątrz.

• Każde- CO jest związane wodorem z - NH wiązania peptydowego, które jest oddalone o 4 reszty w obrębie tego samego łańcucha.

• Na jeden skręt helisy przypada 3,6 reszty aminokwasowej, a helisa jest prawoskrętna ( tj. obroty spirali wokół osi są zgodne z ruchem zegara).

12. Wiązania stabilizujące strukturę II rzędową białek

Ważną cechą charakterystyczną struktury drugorzędowej jest tworzenie wiązań wodorowych (wiązania H) pomiędzy grupą -CO jednego wiązania peptydowego i grupą -NH sąsiedniego wiązania

• Jeżeli wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy wiązaniami peptydowymi w obrębie tego samego łańcucha, zostaje utworzona bądź struktura heliksalna, taka jak α- helisa, bądź rozbudowana ze zwrotami β (β- zwój).

• Jeżeli wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy wiązaniami peptydowymi różnych łańcuchów, zostaje utworzona rozbudowana struktura, tak zwana β struktura pofałdowanej kartki (dywanowa, harmonijkowa).

13. Struktura pierwszorzędowa białek

Reszty aminokwasów w łańcuchach polipeptydowych mogą występować w różnej liczbie i kolejności. Kolejność -SEKWENCJA AMINOKWASÓW-jest charakterystyczna dla poszczególnych białek i jest zdeterminowana genetycznie. Określa się ją jako PIERWSZORZĘDOWĄ STRUKTURĘ BIAŁEK.

• Struktura pierwszorzędowa jest kowalencyjnym „szkieletem” polipeptydu utworzonego przez specyficzną sekwencję aminokwasów.

• Sekwencja ta jest zakodowana w DNA i określa końcowy trójwymiarowy kształt, jaki przybiera białko w stanie rodzimym.

• Struktura pierwszorzędowa - czyli najniższy poziom organizacji strukturalnej cząsteczki jest wyznaczona przez sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Jest ona uwarunkowana jeszcze zanim zostanie zsyntetyzowany łańcuch polipeptydowy, gdyż informacja o kolejności aminokwasów w cząsteczce białka jest zakodowana w DNA, w postaci sekwencji nukleotydowej. Dzięki procesom transkrypcji, a po niej translacji sekwencja nukleotydowa zostaje odczytana w trakcie syntezy odpowiedniego polipeptydu.
  

14. Struktura białek globularnych - struktura III i IV rzędowa

Struktura trzeciorzędowa określa przestrzenne oddziaływania bardziej odległych reszt.

• Zwinięcie. Łańcuch białka rozpuszczalnego ułożony w drugorzędową strukturę ma tendencje do fałdowania się w struktury globularne, w których reszty hydrofobowe położone wewnątrz struktury unikają wody, a zewnętrzne hydrofilowe reszty kontaktują się z wodą. Takie zwinięcie wynika z asocjacji fragmentów o strukturze α- helisy, rozbudowanych β- struktur lub innych drugorzędowych struktur i wykazuje najniższą energię ( tj. najwyższą stabilność) w przypadku danego białka.

Struktura czwartorzędowa określa przestrzenne oddziaływania pomiędzy poszczególnymi łańcuchami polipeptydowymi w wielołańcuchowym białku.

• Białka o dużej masie cząsteczkowej mają tzw. budowę oligomeryczną i składają się z podjednostek -protomerów, tj. łańcuchów polipeptydowych o określonej strukturze pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowej.

• Pomiędzy protomerami mogą występować wiązania identyczne z tymi, które odpowiedzialne są za stabilizację struktury trzeciorzędowej białek. Łańcuchy polipeptydowe zajmują w stosunku do siebie określone pozycje i to wzajemne przestrzenne ułożenie (dopasowanie) takich łańcuchów, które tworzą konformację białka oligomerycznego, nosi nazwę CZWARTORZĘDOWEJ STRUKTURY.

15. Wiązania stabilizujące strukturę III i IV rzędową białek.

Struktura trzeciorzędowa dotyczy przestrzennego ułożenia aminokwasów zarówno odległych w sekwencji liniowej jak i tych, które ze sobą sąsiadują. Końcowa struktura jest determinowana przez sekwencję aminokwasów. Biologicznie aktywna (natywna) przestrzenna konformacja białka jest utrzymywana dzięki oddziaływaniom hydrofobowym oraz przez siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe i jeśli obecne kowalencyjne wiązania dwusiarczkowe. Siły elektrostatyczne obejmują wiązania jonowe między przeciwstawnie naładowanymi grupami i liczne słabe oddziaływania van der Wasala między ściśle upakowanymi alifatycznymi łańcuchami bocznymi we wnętrzu białka.

W przypadku białek zawierających więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy występuje najwyższy poziom organizacji białka nazywany strukturą czwartorzędową. Struktura ta dotyczy przestrzennego ułożenia polipeptydowych podjednostek i natury oddziaływań między nimi. Tymi oddziaływaniami mogą być wiązania kowalencyjne (np. dwusiarczkowe) lub oddziaływania niekowalencyjne (siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe).

Stabilność białka

Natywna przestrzenna konformacja białka utrzymywana jest przez zestaw wiązań niekowalencyjnych (siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe) i wiązania kowalencyjne, czyli wiązania dwusiarczkowe i wiązania peptydowe między kolejnymi aminokwasami.

• Siły elektrostatyczne - to oddziaływania między dwoma grupami jonowymi o przeciwstawnym ładunku, często nazywane parą jonową lub mostkiem solnym. Tego typu oddziaływanie zachodzi np. między grupą aminową lizyny i grupą karboksylową asparaginianu. Do tego typu oddziaływań zalicza się także niekowalencyjne połączenia między elektrycznie obojętnymi cząsteczkami określane jako oddziaływania van der Wasala. Polegają one na oddziaływaniach elektrostatycznych między trwałymi i/lub indukowanymi dipolami, takimi jak grupy karbonylowe w wiązaniach peptydowych.

• Wiązania wodorowe - to najczęściej oddziaływania elektrostatyczne między grupą donorową będącą słabym kwasem oraz akceptorowym atomem zawierającym wolną parę elektronów i posiadającym dzięki temu cząstkowy ładunek ujemny, co jest czynnikiem przyciągającym atom wodoru. W układach biologicznych grupą donorową jest atom tlenu lub azotu połączony kowalencyjnie z atomem wodoru, a akceptorem jest atom tlenu lub azotu. Wiązania wodorowe są silniejsze od oddziaływań van der Wasala, ale dużo słabsze niż wiązania kowalencyjne. Odgrywają istotną role w tworzeniu struktury przestrzennej białek, ale także innych makrocząsteczek, jak dwuniciowa helisa DNA lub ich zestawów jak dwuwarstwa lipidowa. Ponad to wiązania wodorowe są podstawą zarówno właściwości wody jak i jej roli jako rozpuszczalnika biochemicznego.

• Oddziaływania hydrofobowe - są odpowiedzialne za minimalizowanie powierzchni kontaktu niepolarnych cząsteczek z otaczającą je wodą. Można je łatwo zaobserwować w przypadku cząsteczek amfipatycznych jak lipidy i detergenty, tworzących micele w roztworze wodnym. W procesie powstawania struktury przestrzennej białka dochodzi także do eliminowania kontaktu między niepolarnymi łańcuchami bocznymi i roztworem wodnym. Oddziaływania te są istotnym elementem warunkującym strukturę białek, ich fałdowanie się i stabilność.

• Wiązania dwusiarczkowe - to wiązania kowalencyjne powstające między dwiema resztami cysteiny położonymi blisko siebie w końcowej strukturze przestrzennej białka, której funkcja polega na stabilizacji tej struktury. Powstają w utleniającym środowisku retikulum endoplazmatycznego i możną je znaleźć głównie w białkach zewnątrz komórkowych i podlegających sekrecji.

16. Mioglobina i hemoglobina - porównanie struktury i funkcji

Hemoglobina i mioglobina to dwa białka wiążące tlen, występujące w dużych wielokomórkowych organizmach. Hemoglobina transportuje tlen do krwi i znajduję się erytrocytach; mioglobina stanowi magazyn tlenu w mięśniach.

Mioglobina- białko globularne, utworzone przez pojedynczy łańcuch polipeptydowi złożony z 153 aminokwasów i fałdujący się w 8 alfa helis. Grupa prostetyczna w postaci hemu jest umiejscowiona w hydrofobowym zagłębieniu pofałdowanego łańcucha.

Hemoglobina - ma strukturę czwartorzędową, ponieważ jest zbudowana z czterech łańcuchów polipeptydowych; dwóch łańcuchów alfa i dwóch beta, z których każdy zawiera grupę prostetyczną. Mimo niewielkiego podobieństwa struktury pierwszorzędowej, poszczególne łańcuchy polipeptydowe hemoglobiny wykazują strukturę przestrzenną niemal identyczną z łańcuchem polipeptydowym mioglobiny.

Hemowa grupa prostetyczna składa sie z pierścienia protoporfiryny IX i centralnie położonego atomu Fe2+, który tworzy 4 wiązania z pierścieniem porfiryny. Poza tym po jednej stronie płaszczyzny pierścieniem porfiryny Fe2+ tworzy wiązanie z histydyną proksymalna- ósmym aminokwasem w helisie F hemoglobiny. Szóstym wiązaniem Fe2+ łączy się z cząsteczką tlenu. W pobliżu miejsca wiązania tlenu (O2) znajduje się druga reszta histydyny, histydyna dystalna, która przeciwdziała wiązaniu się tlenku węgla.

Hemoglobina jest białkiem allosterycznym. Wiązanie O2 jest kooperatywne; związanie O2 z jedną podjednostką ułatwia jego wiązanie przez kolejne podjednostki. Krzywa dysocjacji tlenu dla hemoglobiny ma kształt sigmoidalny, natomiast dla mioglobiny - hiperboliczny. Mioglobina wykazuje większe powinowactwo w stosunku do O2 niż hemoglobina.

Struktura czwartorzędowa hemoglobiny utlenowanej różni się od struktury czwartorzędowej hemoglobiny nieutlenowanej. Związanie O2 z Fe2+ zniekształca grupę hemowa i przesuwa histydynę proksymalną. To z kolei powoduje przesuniecie helisy F i zmianę oddziaływań miedzy czterema podjednostkami.

H+, CO2, i 2,3-bisfosforoglicerynian są regulatorami allosterycznymi, ułatiajacymi uwalnianie O2 z hemoglobiny. H+ i CO2 wiążą się z różnymi częściami łańcuchów polipeptydowych, a 2-3-bisfosforoglicerynian wiąże się w środkowej przestrzeni cząsteczki między czterema podjednostkami.

Hemoglobina F wystepujaca u płodu ssaka składa się z dwóch łańcuchów alfa i dwóch gamma. Wiąże 2,3-bisfosforoglicerynian słabiej niż hemoglobina dorosłych, dzięki czemu wykazuje większe powinowactwo względem O2, co ułatwia przenoszenie O2 z krwi matki do krwi płodu.

Porównanie sekwencji hemoglobin różnych gatunków doprowadziło do twierdzenia, że niezmiennych jest tylko dziewięć aminokwasów. Niektóre aminokwasy podlegają konserwatywnej substytucji przez reszty o podobnych właściwościach, inne w wyniku niekonserwatywnej substytucji zostają zastąpione przez reszty o innych właściwościach. Hemoglobinopatie to choroby będące skutkiem nieprawidłowej hemoglobiny. Np. niedokrwistość sierpowata - wywołana niekonserwatywną substytucją glutaminianu przez walinę, prowadzącą do powstania hydrofobowych lepkich miejsc na powierzchni białka. Miejsca te są odpowiedzialne za tworzenie się długich agregujących włókien deformujących kształt krwinek czerwonych. Heterozygoty względem genu sierpowatowości są bardziej odporne na malarie niż homozygoty względem prawidłowego genu.

17. Mechanizm wiązania tlenu przez mioglobinę i hemoglobinę, efekt allosteryczny.

Mioglobina i hemoglobina są białkami przenoszącymi tlen u kręgowców. Mioglobina służy jako magazyn tlenu i ułatwia jego transport w obrębie tkanki mięśniowej. Hemoglobina zawarta w erytrocytach służy jako nośnik tlenu we krwi.

Zdolność mioglobiny i hemoglobiny do przenoszenia tlenu wiąże się z obecnością w nich niebiałkowej grupy hemowej. Hem składa się z części organicznej i atomu żelaza. Część organiczna jest zbudowana z 4 grup pirolowych. Grupy te są połączone mostkami metinowymi tworząc pierścień czteropirolowy. Do niego przyłączone są łańcuchy boczne. Atom żelaza grupy hemowej umieszczony jest w centrum pierścienia i wiąże się z 4 atomami azotu. Atom żelaza w hemie występuje w postaci jonu żelazawego (+2) lub żelazowego (+3). Tylko forma żelazawa może wiązać tlen.

Grupa hemowa mieści się w niepolarnym zagłębieniu cząsteczki, chroniącym ją przed utlenieniem do formy żelazowej. Atom żelaza hemu wiąże się bezpośrednio z atomem azotu łańcucha bocznego histydyny. Zajmuje ona piątą pozycję koordynacyjną atomu żelaza. Szósta pozycja - po przeciwnej stronie płaszczyzny hemu - stanowi miejsce wiązania tlenu. Utlenowanie mioglobiny polega więc na przyłączeniu tlenu w szóstej pozycji koordynacyjnej, gdzie wiąże się on z hemowym atomem żelaza.

Hemoglobina składa się z 4 łańcuchów polipeptydowych. Każdy łańcuch wiąże się z jedną grupa hemową - cząsteczka hemoglobiny ma wiec 4 miejsca wiązania tlenu.

Wiązanie z tlenem to wiazanie słabe, odwracalne. Tlen musi być łatwo wiązany i łatwo oddawany.

Hb wiąże tlen z niskim powinowactwem. Związanie pierwszej cząsteczki powoduje taka zmianę, że kolejne są wiązane z większym powinowactwem. Związanie tlenu przez pierwszą grupę hemową ułatwia dalsze wiązania z pozostałymi grupami - jest to efekt allosteryczny. Właściwości allosteryczne Hb pojawiają się w wyniku oddziaływań pomiędzy podjednostkami α i β.

18. Jednostka aktywności enzymatycznej:

Aktywność enzymatyczną mierzy się w jednostkach enzymatycznych. Jest to taka ilość enzymu, która przekształca 1 mikromol substratu w ciągu jednostki czasu w warunkach standardowych (25⁰ C, pH = 7). Mierzy się więc ilość enzymów.

19. Liczba obrotów:

Liczba obrotów enzymu - oznacza liczbę cząsteczek substratu przekształconych w produkt reakcji na jednostkę czasu, w warunkach pełnego wysycenia enzymu substratem.

np. liczba obrotów anhydrazy węglanowej wynosi 600000 obrotów na sekundę; dla większości enzymów jest w granicach 1 do 10⁴ na sekundę.

Jeżeli stężenie miejsc aktywnych [ET] jest znane to szybkość maksymalna - V max - ujawnia liczbę obrotów enzymu (przy maksymalnym stężeniu enzymu)

V max = k₂ [ET]

gdzie: k₂ - stała katalityczna (wyznacznik aktywności enzymatycznej enzymu) jest liczbą cząsteczek substratu, przekształconych w reakcji w jednostce czasu przez pojedyncze miejsca katalityczne w warunkach pełnego wysycenia enzymu substratem.

20. Cechy enzymów

a) duża aktywność katalityczna:

- enzymy przyspieszają reakcje chemiczne co najmniej milionkrotnie. Przy braku enzymów większość reakcji w układach biologicznych zachodzi tak wolno, że są one nie zauważalne.

b) duża specyficzność działania (są specyficzne dla konkretnego substratu):

- duża specyficzność zarówno pod względem katalizowanej reakcji chemicznej jak i wyboru związków biorących w niej udział, czyli substratów. Jeden enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję chemiczną lub grupę ściśle pokrewnych reakcji (np. reakcją katalizowaną przez enzymy proteolityczne jest hydroliza wiązania peptydowego)

c) aktywność wielu enzymów podlega regulacji:

- niektóre enzymy są syntetyzowane w formie nieczynnych prekursorów, które ulegają aktywacji dopiero w zgodnym z wymaganiami fizjologicznymi czasie i miejscu;

np. enzym trawienny trypsyna jako czynny pojawia się w jelicie cienkim dopiero w wyniku hydrolizy wiązania peptydowego w trypsynogenie, który jako prekursor trypsyny jest syntetyzowany w trzustce.

Inny mechanizm kontroli aktywności polega na kowalencyjnym przyłączeniu małej grupy chemicznej do cząsteczki enzymu (modyfikacje kowalencyjne).

d) przekształcają różne rodzaje energii:

- w wielu reakcjach biologicznych energia substancji reagujących jest przekształcana z dużą wydajnością w inną formę energii.

np. w fotosyntezie energia świetlna jest zamieniana na energię wiązania chemicznego; w mitochondriach energia małych cząsteczek pochodzących z pożywienia jest kumulowana w wiązaniach chemicznych ATP.

Te przekształcanie energii przeprowadzane są przez cząsteczki enzymów.

e) nie mają wpływu na równowagę reakcji:

- enzym jest katalizatorem i nie może zmieniać stanu równowagi reakcji chemicznej (enzym zwiększa w dokładnie jednakowym stopniu szybkość reakcji zachodzącej w obu kierunkach).

f) obniżają energię aktywacji katalizowanych reakcji

- Aby rozpocząć reakcję potrzebna jest energia aktywacji, której potrzeba mniejszą ilość z użyciem katalizatora. Enzymy (jako katalizatory) przyspieszają reakcje przez obniżenie energii aktywacji - enzym obniża barierę aktywacji poprzez stan przejściowy. Stan przejściowy to taki stan substratu, w którym podatny jest on na przemiany. Im więcej stanów przejściowych, tym większa możliwość, że reakcja zajdzie.

22. Regulacja aktywności enzymatycznej.

• regulacja aktywności nieczynnych prekursorów - niektóre enzymy są syntetyzowane w formie nieczynnych prekursorów, które ulegają aktywacji dopiero w zgodnym z wymaganiami fizjologicznymi czasie i miejscu

• modyfikacja kowalencyjna - mechanizm regulacji aktywności polegający na kowalencyjnym przyłączeniu małej grupy chemicznej (np. fosforylowej) do cząsteczki enzymu

• hamowanie zwrotne - enzym katalizujący pierwszy etap szlaku biosyntetycznego jest inhibowany produktem końcowym (np. biosynteza izoleucyny)

• kontrola fizjologiczna (np. synteza laktozy w gruczole mlecznym)

• inhibicja - zahamowanie aktywności enzymatycznej przez reakcje związku (substratu) z enzymem

23. Kinetyka reakcji enzymatycznej - stała Michaelisa - Menten:

Dla wielu enzymów szybkość katalizy zmienia się ze stężeniem substratu. Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji V prawie liniowo zależy od stężenia substratu [S].

Przy dużych [S] V jest prawie niezależnie od [S]. Kinetyczne własności niektórych enzymów opisuje model Michaelisa - Menten.

W modelu tym enzym (E) łączy się z substratem [S] tworząc kompleks enzym - substrat (ES); reakcję charakteryzuje stała szybkość k₁. Istnieją dwie drogi rozpadu kompleksu ES:

- może on dysocjować do E i S ze stałą szybkością k₂ lub może tworzyć produkt (P) ze stałą szybkością k₃

k₁ k₃

E + S ES E + P

k₂

Szybkość (V) tworzenia produktu podaje równanie Michaelisa - Menten:

[S]

V = Vmax

[S] + K_M

gdzie:

V max - szybkość reakcji w warunkach wysycenia enzymu substratu.

K_M - stała Michaelisa, jest stężeniem substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę wartości maksymalnej.

k₂ + k₃

K_M =

k₁

Znaczenie K_M:

- K_M oznacza takie stężenie substratu, przy którym połowa miejsc aktywnych jest obsadzona.

- K_M wiąże się ze stałymi szybkości, charakterystycznymi dla poszczególnych etapów katalizy.

24. Centrum aktywne enzymu:

• miejsce aktywne enzymu to obszar, który wiąże substraty oraz dostarcza reszt aminokwasowych, biorących bezpośredni udział w tworzeniu i zrywaniu wiązań. (Te reszty nazywa się grupami katalicznymi)

• miejsce aktywne zajmuje stosunkowo małą część całkowitej objętości cząsteczki enzymu.

• centrum aktywne jest układem przestrzennym, złożonym z grup chemicznych.

• specyficzność wiązania zależy od precyzyjnie określonego ułożenia atomów w miejscu aktywnym. Substrat musi mieć odpowiedni kształt, by mógł pasować do miejsca aktywnego (dotyczy to enzymów o sztywnej strukturze)

Kształt miejsca aktywnego niektórych enzymów może ulegać modyfikacji na skutek związania substratu (to tzw. wymuszone dopasowanie).

• w połączeniach substratów z enzymami w miejscu aktywnym biorą udział stosunkowo słabe siły wiązania.

• centrum aktywne znajduje się w zagłębieniu powierzchni enzymu.

25. Kompleks enzym - substrat, dowody występowania:

Tworzenie lub zrywanie wiązań chemicznych w obecności enzymu poprzedzone jest powstaniem kompleksu enzym - substrat (ES).

Substrat ulega związania w miejscu aktywnym enzymu, tworząc kompleks ES, który może się przekształcać, tworząc produkt (P) lub dysocjować z powrotem do E i S:

k₁ k₂

E + S ES E + P

k _-1

Dowody występowania:

• kompleksy ES obserwowano bezpośrednio, stosując mikroskopię elektronową i rentgenografię.

• własności fizyczne enzymu (tj. rozpuszczalność lub stabilność termiczna) często ulegają zmianie na skutek utworzenia kompleksu ES.

• w wyniku utworzenia kompleksu ES zmienia się charakterystyka spektralna wielu enzymów.

• w czasie tworzenia kompleksu ES ujawnia się jego duża stereospecyficzność.

• kompleks ES można czasem wyizolować w czystej postaci.

• przy odpowiednio dużych stężeniach substratu wszystkie miejsca katalityczne zostają obsadzone i szybkość reakcji osiąga swoje maksimum (dalsze zwiększenie stężenia substratu nie powoduje zwiększenia szybkości reakcji).

26. Mechanizmy katalizy enzymatycznej.

Mechanizmy katalizy enzymatycznej:

a) mechanizm „klucza i zamka” - dotyczy enzymów o strukturze sztywnej. Substrat dokładnie pasuje do enzymu, musi mieć odpowiedni kształt by mógł związać się z miejscem aktywnym enzymu.

b) deformacja geometryczna - np. mechanizm katalityczny lizozymu. Enzym w procesie wiązania zmusza substrat do przyjęcia geometrii stanu przejściowego, odpowiadającej jonowi przejściowemu. (Stan przejściowy to taki stan substratu, w którym podatny jest on na przemiany). Czynnikami sprzyjającymi utworzeniu jonu przejściowego i przyspieszającymi katalizę są: czynnik elektrostatyczny (obecność ujemnie naładowanej grupy karboksylowej) i czynnik geometryczny (zmieniona konformacja)

c) indukowane dopasowanie - wiązaniu substratu towarzyszą duże zmiany w strukturze samego enzymu. Np. mechanizm katalityczny karboksypeptydazy A: sposób wiązania substratu z karboksypeptydazą opracowano na podstawie badań struktury kompleksu enzymu i glicylotyrozyny. Oddziaływanie z glicylotyrozyna jest identyczne jak z właściwym substratem. Wiązaniu temu towarzyszą zmiany strukturalne w miejscu aktywnym enzymu.

d)deformacja rozkładu elektronów - w miejscu aktywnym enzymu znajduje się atom cynku (w przypadku karboksypeptydazy A) i inne grupy chemiczne, które indukują zmiany w rozkładzie elektronów cząsteczki substratu, czyniąc ją bardziej podatną na hydrolizę.

27. Klasy enzymów.

W układach biologicznych reakcje chemiczne rzadko zachodzą przy braku katalizatora. Katalizatorami są swoiste białka - enzymy.

Ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji wyróżniamy następujące klasy enzymów:

• oksydoreduktazy - przeprowadzają reakcje redukcji - utleniania

• transferazy - katalizują wymianę grup chemicznych między związkami; biorą udział w przenoszeniu grup z jednego substratu na inny

• hydrolazy - przeprowadzają rozkład związków z przyłączeniem cząsteczki wody

• liazy - powodują rozszczepienie jednego związku chemicznego na dwa lub połączenie dwóch substancji w jedną

• izomerazy - przenoszenie grup wewnątrz cząsteczki substratu, katalizują przekształcenie substratu w jego izomer

• ligazy - (synteazy) tworzą wiązania między substratami z użyciem ATP

28. Pro-enzymy (zymogeny)

Zymogeny - to enzymatycznie nieczynne (nieaktywne) prekursory enzymów proteolitycznych. Prekursory uzyskują pełną aktywność enzymatyczną w wyniku hydrolizy jednego lub kilku wiązań peptydowych, np. włókna kalogenu powstają z rozpuszczalnego prekursora prokolagenu.

Nieaktywny prekursor jest syntetyzowany w trzustce. Proces trawienia białek w dwunastnicy wymaga równoczesnego współdziałania kilku enzymów proteolitycznych - w tym samym czasie muszą więc ulegać aktywacji różne enzymy.

Aktywacja zymogenów odgrywa główna rolę w kontroli procesów krzepnięcia krwi. Przedwczesna aktywacja zymogenów może prowadzić do śmierci (np. ostre zapalenie trzustki polega na przedwczesnej aktywacji enzymów trzustki wewnątrz tego narządu).

31. Witaminy/ witaminy rozpuszczalne w tłuszczach

Witaminy to związki organiczne o zróżnicowanej budowie chemicznej, których niewielkie ilości wprowadzone wraz z pokarmem do organizmu warunkują prawidłowy przebieg procesów życiowych.

Nieodzowność witamin pochodzi stad, ze wchodzą one jako koenzymy (aktywne centrum enzymu) w skład niektórych ważnych enzymów komórkowych. Witaminy nie mogą być trawione. W razie strawienia byłyby dla organizmu stracone bezpowrotnie.

Dobowe zapotrzebowanie człowieka na witaminy jest zróżnicowane. Brak witaminy prowadzi do schorzenia zwanego awitaminozą, nadmiar także bywa szkodliwy i nosi nazwe hiperwitaminozy.

Rośliny potrafią same syntetyzować witaminy, natomiast zwierzęta i czło­wiek muszą je otrzymywać w postaci gotowej lub jako prowitaminy. Z prekur­sorów witamin, czyli prowitamin, organizm zwierzęcy może wytwarzać witaminę A (pod wpływem enzymów jelitowych) i witaminę D (pod wpływem promieni ultrafioletowych).

Witaminy nie podlegają trawieniu-w razie strawienia byłyby dla organizmu stracone bezpowrotnie dlatego są bezpośrednio wchłaniane do krwiobiegu przez ścianę jelit. Niektóre, np. z grupy B i K, są syntetyzowane przez bakterie żyjące w jelicie cienkim i grubym zwierząt i człowieka. Witaminy, podobnie jak enzymy, nie stanowią źródła energii; kwalifikuje się je do biokatalizatorów. Witaminy dzieli się na:

— rozpuszczalne w tłuszczach — witaminy A, D, E, K,

— rozpuszczalne w wodzie — witaminy Bi_1, B₂, B₆, B₁₂, PP, biotyna oraz witamina C.

Witamina	Rola w organizmie		Objawy awitaminozy			Występowanie
1		2		3	4
A akseroftol		warunkuje normalny stan skóry i nabłonków, siat­kówki oka, prawidłowy wzrost; wzmaga odporność na za­każenia ropne		ślepota zmierzchowa (tzw kurza ślepota), choroby śluzówek, gruczo­łów potowych, łzowych zahamowanie wzrostu	tran, wątroba, mleko, masło prowitamina (karoten) w korzeniach marchwi, liściach szpinaku, owo­cach, w tym pomidorów i papryki
D kalcyferol		prawidłowy rozwój kości, wchłanianie jonów wapnia		krzywica tracenie zębów łatwość złamań kości	tran rybi, jaja. mleko jej prowitaminy w droż­dżach, nowalijkach i w tkankach zwierzęcych
E tokoferol		prawidłowy przebieg pro­cesów rozmnażania, prze­bieg ciąży		choroby gonad nieprawidłowy rozwój ciąży zwyrodnienie mięśni	olej lniany, sałata, kiełki pszenicy wołowina, jaja, mleko, wą­troba
K filochinon		krzepnięcie krwi, utlenia­nie biologiczne		obniżenie krzepliwości krwi	szpinak, lucerna, kapusta mięso, wątroba
C kwas askorbinowy		aktywator wielu enzymów, wzmaga odporność orga­nizmu, uczestniczy w procesach utleniania biologicznego		szkorbut (gnilec), trudne gojenie ran. obniżenie odporności orga­nizmu	owoce porzeczki, cytryny, pomarańczy kapusta kiszona, ogórki, liście pietruszki, sałaty
H Biotyna (należy do grupy B)		składnik niektórych en­zymów; wpływa na stan skóry i włosów		zapalenie skóry wypadanie włosów	mleko, wątroba, jaja, mar­chew, maliny, drożdże
PP niacyna (na­leży do grupy B)		reguluje procesy biologicz­nego utleniania		choroby skóry (pelagra), przewodu pokarmowego, nerwowego	otręby, drożdże, nasiona fa­soli, grochu wątroba, nerki, ryby
B1 tianina (na­leży do grupy B)		przemiany węglowodanów i tłuszczów, utlenianie biologiczne; warunkuje pra­widłowy stan tkanki nerwowej		choroby układu nerwowe­go, serca beri - beri zaburzenia metabolizmu	drożdże, marchew, pomi-dory, jabłka mleko, jaja, wątroba, mózg, otręby ryżowe

1	2	3		4
B2 rybo/lawina (należy do grupy B)	składnik enzymów oddy­chania podnosi ogólną odporność organizmu	choroby oczu, skóry (łojo-tok, zajady) zahamowanie wzrostu		drożdże wątroba, nerki, jaja jarzyny ser biały
B6, (należy do grupy B)	składnik enzymów, regulu­je przemiany aminokwa­sów bierze udział w procesach krwiotwórczych	anemia łojotok epilepsja schorzenia skóry depresja		kiełki pszenicy, otręby ryżowe, drożdże mięso, wątroba, mleko
B12 kobalamina (należy do grupy B)	warunkuje rozwój i dojrze­wanie erytrocytów	anemia, ogólne osłabienie		wątroba, mleko bakterie (Streptomyces)

32. Kaskady enzymatyczne enzymów ich znaczenie -(chyba o to chodzi)

Pewne enzymy oscyluja (skłaniają się raz w jedna raz w druga strone, wahac się) miedzy stanem aktywnym i nieaktywnym. Mogą być one syntetyzowane w postaci nieaktywnych prekursorów, które zostają aktywowane w czasie i miejscu fizjologicznie właściwym. Przykładem tego typu kontroli, zwanej aktywacją proteolityczną, są enzymy trawienne. Na przykład, trypsynogen syntetyzowany jest w trzustce, a ak­tywowany w jelicie cienkim do formy aktywnej enzymu - trypsyny - przez rozszczepienie wiązania peptydowego. Ten typ kontroli jest także wielokrotnie używany w sekwencji reakcji enzymatycznych prowadzących do krzepnięcia krwi.

Nieaktywne enzymatycznie prekursory enzymów protolitycznych nazwano zymogenami (proenzymami).

Wiele enzymów jest syntetyzowanych w postaci nieaktywnych prekursorów, które sa nastepnie aktywowane przez specyficzna hydrolizę jednego lub kilku wiązań peptydowych.

Aktywacja proteolityczna może zachodzić na zewnątrz komórki, ponieważ nie wymaga stałej obecności źródła energii (ATP). Aktywacja proteolityczna może zajść tylko jeden raz w życiu cząsteczki enzymu.

W układach biologicznych znamy wiele przykładów enzymów i innych białek ulegających aktywacji w wyniku specyficznej proteolizy. Oto kilka z nich:

1. Enzymy trawienne hydrolizujące białka syntetyzowane są w żołądku i trzustce w postaci zymogenów

Zymogeny żołądka i trzustki:

Miejsce syntezy Zymogen Aktywny enzym

Żołądek pepsynogen pepsyna

Trzustka chymotrypsynogen chymotrypsyna

Trzustka trypsynogen trypsyna

Trzustka prokarboksypeptydaza karboksypeptydaza

Trzustka proelastaza elastaza

2. Krzepnięcie krwi zachodzi dzięki kaskadowemu procesowi aktywacji proteolitycznej, który umożliwia szybką i wzmocnioną reakcję na uraz.

3. Niektóre hormony białkowe są syntetyzowane w formie nieaktywnych prekursorów. Między innymi insulina powstaje z proinsuliny w wyniku usunięcia peptydu podczas reakcji proteolitycznej.

4. Włókna kolagenu, białka występującego w skórze i kościach, powstają z rozpuszczalnego prekursora — prokolagenu.

5. Wiele procesów rozwojowych kontrolowanych jest przez aktywację zymogenów.

Podczas przeobrażenia kijanki w żabę, w ciągu kilku dni duża ilość kolagenu zostaje usunięta z ogona. Przemiana prokolagenazy w kolagenazę, aktywną proteazę, jest precyzyjnie zsynchronizowana z prze­biegiem procesów przeobrażania. Kokonaza, enzym mający zasadnicze znaczenie w rozwoju owadów, jest syntetyzowana także w postaci nieaktyw­nego prekursora .

33. Aktywacja enzymów proteolitycznych przewodu pokarmowego.

Rozpatrzymy mechanizm aktywacji trzech głównych enzymów trawiennych - chymotrypsyny, trypsyny

i pepsyny.

1. Chymotrypsynogen jest aktywowany przez specyficzną hydrolizę jednego wiązania

peptydowego

Chymotrypsyna jest enzymem trawiennym, który hydrolizuje białka w jelicie cienkim. Jej nieaktywny prekursor, chymotrypsynogen, jest syntetyzowany w trzustce. Miejscem syntezy enzymów i zymogenów są komórki pęcherzykowe trzustki, gdzie są one następnie przechowywane w postaci ziaren w pęcherzykach błonowych. Ziarna zymogenu gromadzą się na szczycie komórki pęcherzykowej, skąd na skutek stymulacji hormonalnej lub pod wpływem impulsu nerwowego są wydzielane do przewodu prowadzącego do dwunastnicy.

Chymotrypsynogen, będący pojedynczym łańcuchem polipeptydowym złożonym z 245 reszt aminokwasów, jest całkowicie pozbawiony aktywności katalitycznej. Zamiana chymotrypsynogenu w pełni aktywny enzym następuje w wyniku hydrolitycznego działania trypsyny na wiązanie peptydowe, łączące argininę 15 z leucyną 16. Powstały wówczas aktywny enzym, nazywany chymotrypsyną π, oddziałuje z innymi cząsteczkami chymotrypsyny π, prowadząc do ich przekształcenia w formę stabilną, chymotrypsynę λ, a to przez usunięcie dwóch dipeptydów. Powstałe w ten sposób trzy łańcuchy chymotrypsyny λ są połączone ze sobą dwoma wiązaniami dwusiarczkowymi. Ponieważ chymotrypsyna λ jest już w pełni aktywna enzymatycznie, dodatkowe cięcia wiązań peptydowych przy przejściu od formy π do λ są zasadniczo zbyteczne. Cechą procesu aktywacji chymotrypsynogenu jest fakt, że hydroliza jednego, określonego wiązania peptydowego prowadzi do przekształcenia białka z formy katalitycz­nie nieaktywnej w postać w pełni aktywną enzymatycznie.

Chymotrypsynogen (nieaktywny)

trypsyna

Chymotrypsyna π (aktywna)

chymotrypsyna

dwa dipeptydy

Chymotrypsyna λ (aktywna)

łańcuch A łańcuch B łańcuch C

Aktywacja proteolityczna chymotrypsygenu. Trzy łańcuchy chymotrypsyny λ polaczone są dwoma międzyłańcuchowymi wiązaniami dwusiarczkowymi ( łancuch A z łańcuchem łańcuch, i B z C).

2. W procesie aktywacji trypsynogenu następuje uporządkowanie rejonu o rozluźnionej strukturze

W procesie aktywacji trypsynogenu,cztery rozfałdowane odcinki polipeptydu, podlegają zasadniczej zmianie konformacyjnej. Odcinki te, nazywane rejonem aktywacji, mają w zymogenie całkowicie rozluźnioną strukturę, natomiast w trypsynie przyjmują konforma­cję wysoce uporządkowaną. Dziura oksyanionu w trypsynogenie jest zbyt odległa od histydyny, aby uczestniczyć w tworzeniu tetraedrycznego stanu przejściowego.

Proces trawienia białek w dwunastnicy wymaga równoczesnego współ­działania kilku enzymów proteolitycznych. Zatem różne zymogeny muszą ulegać aktywacji w tym samym czasie. Skoordynowana kontrola tych procesów dokonuje się z udziałem trypsyny, która jest wspólnym aktywatorem wszystkich zymogenów trzustki — trypsynogenu, chymotrypsynogenu, proelastazy i prokarboksypeptydazy. Jak dochodzi do powstania trypsyny? Komórki wyścielające dwunastnicę wytwarzają enzym enterokinazę, która po wnik­nięciu trypsynogenu do dwunastnicy hydrolizuje jedyne występujące w jego sekwencji wiązanie peptydowe między lizyną i izoleucyną. Powstała w ten sposób niewielka ilość trypsyny aktywuje dalsze cząsteczki trypsynogenu i innych zymogenów. Zatem powstanie trypsyny z udziałem enterokinazy stanowi zasadniczy etap w procesie aktywacji.

3. Aktywna pepsyna powstaje w wyniku autokatalitycznej reakcji hydrolizy pepsynogenu, zachodzącej w środowisku kwasowym

Pepsyna katalizuje rozkład białek w silnie kwasowym środowisku żołądka (optymalna aktywność w pH 2). Pepsyna zawiera w swoim miejscu aktywnym dwie reszty asparaginianu; jedną w postaci niezjonizowanej (COOH), drugą w postaci zjonizowanej (COO~). W części końca N cząsteczki pepsynogenu (zymogenu) znajduje się odcinek prekursorowy złożony z 44 reszt aminokwasowych, usuwany proteolitycznie podczas tworzenia pepsyny. Proces ten, jednoznaczny z aktywacją pepsynogenu, zachodzi spontanicznie poniżej pH 5. Decydujące znaczenie dla jego przebiegu ma hydroliza wiązania peptydowego między leucyną 16 i izoleucyną 17, które znajduje się w odcinku prekursorowym. Aktywacja jest wewnątrzcząsteczkowa.

Odcinek prekursorowy jest silnie zasadowy, natomiast pepsyna ma charakter silnie kwasowy. W cząs­teczce pepsynogenu miejsce aktywne jest całkowicie uformowane, jednakże w pH neutralnym dostęp do niego jest zablokowany przez reszty aminokwasowe należące do odcinka prekursorowego (zasadowego). Sześć łańcuchów bocznych lizyny i argininy z odcinka prekursorowego tworzy wiązania jonowe z karboksylowymi łańcuchami bocznymi glutaminianu i asparaginianu z części cząsteczki zymogenu tworzącej pepsynę. Co najważniejsze, łańcuch boczny lizyny odcinka prekursorowego oddziałuje elektrostatycznie z dwoma resztami asparaginianu w miejscu aktywnym.

Zmniejszenie pH powoduje zerwanie wiązań jonowych między odcinkiem prekursorowym i częścią cząsteczki pep­synogenu, która tworzy pepsynę. Wywołane w ten sposób zmiany konformacyjne prowadzą do wyeksponowania miejsca aktywnego, które hydrolizuje wiązanie peptydowe między odcinkiem prekursorowym i pozostałą częścią cząsteczki pepsynogenu.

34. Chymotrypsyna

Chymotrypsyna, jest enzymem trawien­nym ssaków. Funkcja chymotrypsyny polega na prowadzeniu hydrolizy białek w jelicie cienkim. Enzym ten działa wybiórczo na wiązania peptydowe po karboksylowej stronie aromatycznych łańcuchów bocznych tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny oraz dużych reszt hydrofobowych, takich jak metionina. Dodatkowe znaczenie chymotrypsyny wynika z jej przynależności do ważnej rodziny białek nazywanych proteazami serynowymi.

Chymotrypsyna składa się z trzech łańcuchów polipeptydowych połączo­nych dwoma międzyłańcuchowymi wiązaniami dwusiarczkowymi. Syntetyzowana jest w formie pojedynczego łańcucha polipeptydowego, który stanowi nieaktywny prekursor nazywany chymotrypsynogenem.

Ma ona strukturę upakowaną w kształcie elipsy. Kilka fragmentów cząsteczki chymotrypsyny przybiera konformację antyrównoległej struktury β a nieliczne — konformację λ helisy. Wszystkie naładowane grupy, z wyjąt­kiem trzech, które pełnią decydującą rolę w katalizie, znajdują się na powierzchni cząsteczki enzymu.

35. Krzepniecie krwi

(pytanie to podzieliłam na 2 części :A i B- A jest ogólne natomiast B ze Strayera i raczej o nie chodzi)

A. Trombocyty ssaków, zwane płytkami krwi odgrywają ważną rolę w hemostazie, a więc mechanizmie kontrolującym procesy krwawienia i krzepnię­cia krwi. Uszkodzone naczynie krwionośne zwęża się, a tym samym zmniejsza się tempo utraty krwi. Płytki przyklejają się do ostrych krawędzi w uszkodzonym naczyniu krwionośnym, czopując je w miejscu uszkodzenia. Płytki gromadzące się w pobliżu uszkodzenia wydzielają ADP, co przyciąga kolejne płytki do miejsca zranienia. W ciągu zaledwie 5 minut od zra­nienia tworzy się okresowy skrzep płytkowy, który pełni do­raźnie funkcję „plastra".

W tym czasie powstaje trwalszy skrzep. Ponad 30 rodzajów związków bierze udział w tym złożonym procesie. Seria reak­cji, które ostatecznie prowadzą do wytworzenia skrzepu, jest inicjowana z chwilą, gdy jeden spośród czynników za ten proces współodpowiedzialnych zostaje uczynniony w wyniku kontaktu ze zranioną tkanką.

W obecności czynników uwolnionych przez uszkodzoną tkankę, jonów wapnia i związ­ków uwalnianych przez płytki krwi protrombina ulega prze­mianie w trombinę. W dalszych etapach trombina katalizuje przemianę rozpuszczalnego białka osocza - fibrynogenu w nierozpuszczalne białko fibrynę. Pojedyncze cząsteczki

fibryny polimeryzują w długie łańcuchy, które przyklejają się do uszkodzonej powierzchni tkanki, tworząc osnowę skrzepu. Nici tej osnowy przechwytują krwinki i płytki krwi, co prowa­dzi do wzmocnienia skrzepu.

Etap 1.

Etap 2.

Etap 3.

B. Krzepnięcie krwi zachodzi w kaskadowym procesie aktywacji zymogenów

Skrzep powstaje w wyniku serii następujących po sobie aktywacji zymogenów. W tej enzymatycznej kaskadzie zaktywowana forma jednego z czynników krzepnięcia katalizuje aktywację następnego.

Z uwagi na katalityczny charakter procesów aktywacji, do ich przebiegu wystarczają niewielkie ilości czynników inicjujących. Na każdym z etapów następuje silne zwielokrotnienie liczby aktywowanych cząsteczek, co umożliwia szybką reakcję na uraz. Kaskada reakcji, prowadząca do powstania skrzepu ilustruje pewne ogólne zasady uruchamiania i kontroli sekwencji reakcji.

Badania różnych zaburzeń tego procesu, polegających na niedoborze pojedynczego białka w którymkolwiek z układów wykazały, że prawidłowe krzepnięcie krwi wymaga obu tych układów.

36. Rola witaminy K w krzepnieciu

Proces wytwarzania protrombiny i innych bialek wiązących wapń wymaga obecności wit. K

Prawidłowa forma protrombiny wiąze jony Ca²⁺ a nieprawidłowa nie wiąże tych jonów.

Zdolność do wiazania jonów Ca²⁺ związana jest z odcinkiem na końcu N. Ruchliwość elektroforetyczna peptydu przy końcu N u nieprawidłowej formy protorombiny różni się zasadniczo od prawidłowej formy tego białka.

Prawidłowa forma protrombiny zawiera γ-karboksyglutaminian. Nieprawidłowa forma protrombiny nie zawiera tego zmo­dyfikowanego aminokwasu. W rzeczywistości, w odcinku przy końcu N protrombiny pierwsze dziesięć reszt glutaminianu ulega karboksylacji do γ-karboksyglutaminianu w wyniku działania systemu enzymatycznego zależ­nego od witaminy K.

Zależna od witaminy K reakcja karboksylacji prowadzi do przekształcenia glutaminianu w

γ-karboksyglutaminian, a więc słabego chelatora jonów Ca²⁺ w silny.

Po przyłączeniu jonów Ca²⁺ protrombina zakotwicza się w błonach fosfolipidowych, uwalnianych z płytek krwi na skutek uszkodzenia tkanki. Znaczenie funkcjonalne wiązania protrombiny z powierzchnią błony fosfolipidowej polega na umożliwieniu jej bliskiego kontaktu z dwoma białkami uczestniczącymi w przekształceniu protrombiny w trombinę. Są to: czynnik X_a (proteaza serynowa) i czynnik V (białko stymulacyjne). Fragment przy końcu N cząsteczki protrombiny, zawierający miejsca wiązania Ca²⁺, zostaje usunięty w procesie aktywacji, dzięki czemu powstała cząsteczka trombiny zostaje uwolniona z powierzchni fosfolipidowej do osocza, gdzie uczestniczy w aktywacji fibrynogenu.

Dikumarol, pochodna kumaryny, stosowany jest w lecznictwie jako antykoagulant zapobiegający powstawaniu skrzepów u chorych o zwiększonej krzepliwości krwi.

Dikumarol i inny analog witaminy K, warfaryna, są również skutecznymi truciznami na szczury. Obecność dikumarolu w pożywieniu krów powoduje powstanie nieprawidłowej formy protrombiny, która w odróżnieniu od formy prawid­łowej nie wiąże jonów Ca²⁺.

37. Trombina i antytrombina III

Trombina ze względu na wiązania peptydowe miedzy argininą i glicyną wskazuje na duże podobieństwo do trypsyny. Powstanie aktywnej trombiny poprzedzone jest proteolitycznym rozszczepieniem cząsteczki zymogenu (protrombiny), które zachodzi kolejno w dwóch miejscach. Jako pierwsze ulega hydrolizie wiązanie peptydowe między argininą 274 i treoniną 275, czemu towarzyszy uwolnienie fragmentu o pewnej masie, a następnie wiązanie między argininą 323 i izoleucyną 324. W trombinie występuje również para jonów, podobna do istniejącego w chymotrypsynie układu między dodatnio naładowaną grupą aminową izoleucyny 16 i ujemnie naładowanym asparaginianem 194, która stabilizuje aktywną postać trombiny.

Trombina przekształca fibrynogen w skrzep fibrynowy (to tez może być do krzepniecia)

Najlepiej poznanym etapem procesu krzepnięcia krwi jest przemiana fibrynogenu w fibrynę, zachodząca z udziałem trombiny. Trombina katalizuje powstanie fibryny i równocześnie uruchamia inaktywację enzymatycznej kaskady prowadzacej do powstania skrzepu.

Cząsteczka fibrynogenu ma postać trzech kulistych jednostek połączonych dwoma pręcikami. W skład cząsteczki fibrynogenu wchodzą pary trzech rodzajów łańcuchów: Aλ, Bβ i γ. W rejonach o postaci pręcika występują trójniciowe a helisy zwinięte w superhelisę. Trombina hydrolizuje cztery wiązania peptydowe między argininą i glicyną, znajdujące się w środkowym kulistym rejonie cząsteczki fibrynogenu, uwalniając w ten sposób peptyd A, ( z łańcuchów łańcuchów), i peptyd B, (z łańcuchów łańcuchów). Peptydy A i B nazywane są fibrynopeptydami, a cząsteczka fibrynogenu pozbawiona fibrynopeptydów - monomerem fibryny. Podjednostki tego monomeru tworzą strukturę ( λ,β,γ)_2.

Monomery fibryny ulegają spontanicznej agregacji tworząc fibrynę, która ma postać długich nierozpuszczalnych włókien. Dlaczego monomery fibryny ulegają agregacji, natomiast ich macierzyste cząsteczki fibrynogenu pozostają w roztworze? Fibrynopeptydy charakteryzuje duży ujemny ładunek wypadkowy. Obecność dużej liczby ujemnie naładowanych grup w fibrynopeptydach, powoduje odpychanie cząsteczek fibrynogenu, zabezpieczając je przed asocjacją.

Odszczepienie fibrynopeptydów przez trombinę prowadzi do powstania monomerów fibryny, które mając zróżnicowy rozkład ładunków powierzchniowych ulegają specyficznej agregacji. Nowo powstały skrzep stabilizowany jest wiązaniami peptydowymi między łańcuchami bocznymi lizyny i glutaminy różnych cząsteczek włókna fibryny. Reakcję tworzenia wiązań poprzecznych katalizuje enzym transglutaminaza (czynnik XIIIa.)

Antytrombina III nieodwracalnie hamuje trombinę i inne proteazy serynowe uczestniczące w krzepnięciu krwi

Najważniejszym inhibitorem przy zakończeniu procesu powstawania skrzepu jest antytrombina III. Występuje ona w osoczu i inaktywuje trombinę, tworząc z nią trwały kompleks. Antytrombina III silnie hamuje trombinę. Hamuje ona również inne proteazy serynowe uczestniczące w kaskadowym procesie krzepnięcia krwi, a mianowicie czynniki: XII_a, XI_a, IX_a i X_a. Hamujące działanie antytrombiny III ulega nasileniu w obecności heparyny. Heparyna działa jako antykoagulant. Przyspiesza tworzenie trwałych kompleksów między antytrombiną III a czynnikami krzepnięcia krwi, będącymi proteazami serynowymi. Antytrypsyna i anty­trombina należą do rodziny inhibitorów proteaz serynowych, nazywanych serpinami.

Ilość trombiny i antytrombiny we krwi jest precyzyjnie utrzymywana w równowadze, co zapewnia szybkie powstawanie skrzepu ograniczone do miejsca uszkodzenia. Zburzenie tej równowagi może doprowadzic do śmierci z powodu powstałej skazy krwotocznej.

--Przykład śmierci jednego chłopaka. Przyczyna śmierci była mutacja antytrypsyny ck hamującej elastazę. Polegała ona na zastąpieniu metioniny 358, resztą argininy. Zamiana jednej reszty aminokwasowej cał­kowicie zmieniła specyficzność tego białka hamującego, które na skutek obecności argininy w pozycji 358 stało się antytrombina. Doprowadziło to do zredukowania aktywności trombiny i powstania skazy krwotocznej.

W normalnych warunkach po pojawieniu się zranienia następuje wzrost aktywności antytrypsyny λ, co zapewnia usunięcie nadmiaru elastazy. Aktywność trombiny omawianego chorego osiągnęła tak niski poziom, że doprowadziło to do powstania śmiertelnej skazy krwotocznej. Mamy więc tutaj do czynienia z przykładem zmiany specyficzności białka zachodzącej w wyniku zastąpienia jednej reszty aminokwasowej inną.

38. Hemofilia.

W chorobie zwanej hemofilią mechanizm krzepnięcia krwi jest upośledzony na skutek braku jednego z czynników krzepnięcia.

Do wyjaśnienia mechanizmów krzepnięcia krwi w znacznym stopniu przyczyniły się badania pacjentów ze skazami krwotocznymi.

Hemofilia A jest najlepiej poznaną skazą krwotoczną, dziedziczoną w sposób recesywny sprzężony z płcią. Bezobjawowymi nosicielami hemofilii są kobiety. Znaną nosicielką tej choroby była królowa Wiktoria, która przeniosła ją do królewskich rodzin w Prusach, Hiszpanii i Rosji. Hemofilię A wywołują zaburzenia układu wewnątrzpochodnego, polegające na braku lub wyraźnym zmniejszeniu aktywności czynnika VIII (czynnik przeciwhemofilowy), który nie jest proteazą ani zymogenem. Działanie tego czynnika polega na przyspieszeniu aktywacji czynnika X, katalizowanej przez czynnik IX_a (proteazą serynowa). Czynnik X jest końcową proteazą w układzie wewnątrzpochodnym. Zatem w hemofilii występują poważne zaburzenia w aktywacji układu wewnątrzpochodnego.

39. Plazminogen i plazmina

Krzepnięcie krwi jest kontrolowane obecność antytrombiny III i innych proteaz serynowych uczestniczących w kaskadowym procesie krzepnięcia krwi.

Skrzepy nie są strukturą trwałą, ulegają rozpuszczeniu po przywróceniu strukturalnej integralności uszkodzonego obszaru. Rozpad fibryny katalizowany jest przez plazminę - proteazę serynową - która hydrolizuje wiązania peptydowe w odcinkach łączących cząsteczki fibryny. Palzmina powstaje w wyniku aktywacji proteolitycznej nieaktywnego prekursora - plazminogenu - katalizowanej przez tkankowo specyficzny aktywator plazminogenu TPA.

40. Inhibitory enzymów

Inhibitor - Cząsteczka hamująca działanie enzymu / unieczynnienie enzymu /; enzym przestaje działać w wyniku nieodwracalnej reakcji chemicznej związanej z enzymem.

Rodzaje inhibicji:

Inhibicja niekompetycyjna - Mechanizm hamowania aktywności enzymu. Cząsteczka działająca jako inhibitor nie wchodzi w centrum aktywne enzymu, ale przyłącza się do innego miejsca na cząsteczce enzymu i hamuje jego działanie.

Inhibicja kompetycyjna - Sposób hamowania działania enzymu. Cząsteczka będąca inhibitorem ma podobną budowę do substratu hamowanego enzymu. Inhibitor wchodzi w centrum aktywne enzymu, blokuje centrum aktywne i uniemożliwia łączenie enzymu z substratem.

Inhibicja enzymów może być procesem odwracalnym lub nieodwracalnym. W inhibicji nieodwracalnej inhibitor łączy się kowalencyjnie z enzymem lub łączy się tak silnie, że jego dysocjacja jest bardzo powolna. Enzym przestaje działać poprzez nieodwracalną reakcję chemiczną; np.: działanie gazów paraliżujących układ nerwowy, polega na zatruciu enzymu - acetylocholinoesterazy - pełniącego ważną rolę w przekazywaniu impulsów nerwowych.

40. Inhibitory enzymów

Inhibitory enzymów to substancje hamujące działanie enzymów. Enzymy mogą ulegać inhibicji przez specyficzne cząstki. W wyniku inhibicji enzym przestaje działać przez nieodwracalne reakcje chemiczne związku z enzymem.

Inhibitory enzymów mogą być:

• nieodwracalne - inhibitor łączy się kowalencyjnie z enzymem lub tak silnie, że jego dysocjacja jest bardzo powolna.

Inhibitorem nieodwracalnym jest np.diizopropylofluorofosforan. Związek ten reaguje z seryna w centrum aktywnym enzymu powodując jego unieczynnienie.

Inhibitory denaturujące cząsteczkę białka - np. mocznik, sole metali ciężkich, temperatura

Inhibitory samobójcze - np. penicylina

• odwracalne - charakteryzuje je szybkie osiągnięcie stanu równowagi przez układ enzym-inhibitor, Inhibitory te hamują aktywność enzymatyczną, jednak po usunięciu cząsteczki hamującej można przywrócić aktywność.

Inhibitory odwracalne dzielimy na:

• kompetycyjne (konkurencyjne) - cząstka podobna do substratu tworzy kompleks z enzymem, ale nie jest przekształcana do produktu. Wiązanie substratu i inhibitora wzajemnie się wykluczają. Inhibitor kompetencyjny zmniejsza szybkość reakcji przez zmniejszenie liczby cząstek enzymu wiążących substrat.

• niekompetycyjne - reagują w innym centrum niż centrum aktywne, tak że połączenia enzymu z substratem nie mogą mieć miejsca. Inhibitor i substrat mogą jednocześnie wiązać się z cząsteczką enzymu. Działalność inhibitora niekompetycyjnego polega na zmniejszeniu liczby obrotów enzymu.

• allosteryczne - gdy jedno miejsce aktywne enzymu może oddziaływać na drugie miejsce aktywne tej samej cząsteczki enzymu

43. INHIBITORY KOMPETENCYJNE / konkurencyjne / - cząsteczka, która jest podobna do substratu, tworzy kompleks z enzymem, ale nie jest przekształcona do produktu; enzym jest w pełni aktywny.

Inhibicję odwracalną charakteryzuje szybka dysocjacja kompleksu enzym-inhibitor. Najprostszym przykładem i.o. jest i. kompetencyjna, w której enzym może wiązać substrat (tworząc kompleks ES) lub inhibitor (tworząc kompleks EI), ale nie oba na raz (ESI). Inhibitor kompetencyjny podobny jest do substratu i wiąże się w miejscu aktywnym enzymu, zapobiegając wiązaniu substratu z tym miejscem.

Inhibitor kompetencyjny zmniejsza szybkość katalizy przez zmniejszanie liczby cząstek enzymu wiążących substrat. Inhibicję kompetencyjną można przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu.

W inhibicji niekompetencyjnej, która jest także odwracalna, inhibiotor i substrat mogą się jednocześnie wiązać z cząsteczką enzymu. Oznacza to, że ich miejsca wiązania nie zachodzą na siebie. Działanie INHIBITORA NIEKOMPETECYJNEGO polega na zmniejszeniu liczby obrotów enzymu, nie na zmniejszeniu liczby cząsteczek enzymu wiążących substrat. Inhibicji niekompetencyjnej nie można przezwyciężyć przez zwiększenie stężenia substratu

41. Inhibitory samobójcze

/Przykłady inhibitorów samobójczych: Penicylina; Tosylo-l-phenyloalanino-chlorometylo-keton TPCK /

--> Penicylina [Author:JK] hamuje wzrost bakterii, jednak w środowisku hipertonicznym bakterie podatne na działanie penicyliny mogą rosnąć w jej obecności - komórki w tym środowisku /protoplasty/ pozbawione są ścian komórkowych.

Penicylina przeszkadza w syntezie komórkowych ścian bakterii, blokuje ostatni etap biosyntezy bakteryjnych ścian komórkowych, tzn. reakcję tworzenia wiązań poprzecznych między różnymi łańcuchami peptydoglikanu

/Peptydoglikan to makrocząsteczka budująca ścianę komórkową, zbudowana z liniowych łańcuchów usieciowanych przez krótkie peptydy/

Podczas formowania ściany komórkowej, reakcja usieciowania poprzez wiązania poprzeczne, katalizowana jest przez transpeptydazę glikopeptydową. Penicylina hamuje transpeptydazę glikopeptydową; łatwo jest przyjmowana przez aktywne miejsca transpeptydazy, następnie penicylina tworzy wiązanie kowalencyjne z seryną w miejscu aktywnym enzymu. Taki penicyloiloenzym już nie działa, a transpeptydaza zostaje nieodwracalnie zahamowana

Penicylina jest efektywnym inhibitorem transpept ydazy, z powodu:

• silnej reaktywności pierścienia, który ma prawdopodobnie strukturę podobną do struktury stanu przejściowego normalnego substratu, który w tym właśnie stanie silnie oddziałuje z enzymem; podsumowując:

dla trasnspeptydazy penicylina jest analogiem stanu przejściowego.

42. Inhibitory allosteryczne W enzymach allosterycznych związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmienić właściwości drugiego miejsca aktywnego tej samej cząsteczki enzymu.

tabele

Pomiary szybkości katalizy przy różnych stężeniach substratu i inhibitora pozwalają odróżnić i. kompetencyjną od niekompetencyjnej

43. Rodzaj inhibicji - niekompetencyjna

W przypadku inhibicji niekompetencyjnej rozcieńczenie inhibitora z substratami nie ma znaczenia, bo substrat nie konkuruje z inhibitorem, wiąże się w innym miejscu, wielkość cząsteczki nie ulega zmianie.

Efekt reakcji zależy od liczby cząstek enzymów

Stężenie substratu niezależne jest od prędkości

Inhibitor niekompetencyjny nie wpływa na K_M , natomiast zmniejsza wartość Vmax

80. RODZAJ INHIBICJI - kompetencyjna / rysunek na tej samej zasadzie wg tabeli /

W przypadku inhibicji kompetencyjnej można efekt inhibitorów wyeliminować stosując nadmiar substratu.

Brak wpływu inhibitora kompetencyjnego na Vmax reakcji enzymatycznej

W obecności i przy braku inhibitora kompetencyjnego Vmax pozostaje niezmienione, natomiast zwiększeniu ulega wartość K_M

44. Analogi stanu przejściowego

Skutecznym rodzajem inhibicji kompetencyjnej jest inhibicja typu analogów stanu przejściowego.

A B C D E

Substancja E nie jest podobna do substancji A albo B / inhibicja I reakcji przemiany A w B /

Enzym obniża barierę aktywacji poprzez stabilizację substratów w postaci stanu przejściowego; stabilizuje stany przejściowe - im większe stężenie substratów w stanie przejściowym, tym większe prawdopodobieństwo, że reakcja zajdzie.

Związki będące analogami stanów przejściowych są doskonałymi inhibitorami kompetencyjnymi.

Przeciwciała katalityczne - są enzymami - przekształcają substrat w produkt.

Możliwości katalityczne białek wynikają z faktu, że są one zdolne do wiązania cząsteczki biologicznej i stabilizacji jej stanu przejściowego.

Enzymy wykazują aktywność katalityczną w odpowiednim czasie i miejscu.

Reakcja chemiczna, w której z substratu S tworzony jest produkt P przechodzi przez stan przejściowy, który ma energię swobodną wyższą niż S i P.

K^± V

( substrat ) S S^± P ( produkt )

Stan przejściowy

/ ± - podwójny znak plus oznacza termodynamiczną jakość stanu przejściowego /

Stan przejściowy występuje najrzadziej w całym przebiegu reakcji, z powodu swej najwyższej wolnej energii.

Związki przypominające stan przejściowy katalizowanej reakcji określano jako analogi stanu przejściowego i są one silnymi inhibitorami enzymów.

--> Drogą [Author:JK] syntezy związków, które przypominają bardziej stan przejściowy niż sam substrat, można otrzymać silne i specyficzne inhibitory enzymów. Siła, z jaką analogi stanu przejściowego działają jako inhibitory, jest potwierdzeniem katalizy, którą jest selektywne wiązanie stanu przejściowego.

Znaczenie analogów stanu przejściowego:

• pozwalają one na wgląd w mechanizmy katalityczne

• mogą służyć jako silne i specyficzne inhibitory enzymów

• mogą być użyte jako immunogeny do wytwarzania wielu nowych katalizatorów

45. Rodzaje kwasów nukleinowych

Kwasy nukleinowe są obok białek podstawowymi składnikami komórek zwierzęcych, roślinnych i drobnoustrojów. Występują one we wszystkich elementach komórkowych i w rozpuszczalnych frakcjach komórek. Biorą udział w podstawowych procesach biologicznych, takich jak synteza białka, podział komórki, przenoszenie cech dziedzicznych. Związki te są głównym materiałem genetycznym.

W komórkach występują 2 rodzaje kwasów nukleinowych:

1. KWAS DEOKSYRYBONUKLEINOWY (DNA)

2. KWAS RYBONUKLEINOWY (RNA)

Kwasy nukleinowe są polimerami nukleotydów, w skład których wchodzą:

1. pięciowęglowy cukier (ryboza lub deoksyryboza)

2. grupa fosforanowa

3. zasada azotowa, związek zawierający w swojej cząsteczce azot. Zasadą azotowa może być albo jednopierścieniowa puryna albo dwupierścieniowa pirymidyna.

W DNA występują 2 puryny: adenina(A) i guanina(G) oraz 2 pirymidyny: cytozyna(C) i tymina(T).

RNA zawiera 2 puryny: adeninę (A) i guaninę(G) oraz 2 pirymidyny: cytozę(C) i uracyl(U).

Charakterystyka DNA

Biopolimer zbudowany z czterech rodzajów deoksyrybonukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi w długi, nierozgałęziony łańcuch (polideoksyrybonukleotyd). Liczba deoksyrybonukleotydów w łańcuchu może wynosić od kilku tysięcy do kilku milionów, tak więc cząsteczki DNA są największymi ze wszystkich biopolimerów. DNA zwykle występuje w postaci dwuniciowej, tj. dwóch łańcuchów leżących równolegle do siebie i razem śrubowato skręconych. Kolejność ułożenia poszczególnych deoksyrybonukleotydów stanowi zaspis informacji genetycznej, decydujący o właściwościach komórki. Informacja ta jest „instrukcją” przy syntezie RNA (→transkrypcja), a za pośrednictwem RNA przy syntezie białek (→translacja). Dzięki budowie dwuniciowej DNA może być przy podziałach komórek łatwo powielany (→replikacja DNA) i w ten sposób zawarta w nim informacja jest przekazywana komórkom potomnym, a przy rozmnażaniu-także organizmom potomnym. Tak więc DNA pełni 2 funkcje:

1. w skali życia jednej komórki jest wzorcem, matrycą do syntezy RNA,

2. w dłuższych przedziałach czasu stanowi powielające się archiwum, zawierające wszystkie informacje o komórce.

DNA występuje w niektórych wirusach, we wszystkich bakteriach i jądrach wszystkich komórek eukariotycznych (w postaci chromatyny), w mitochondriach, plastydach i prawdopodobnie w centriolach, niekiedy w postaci plazmidu także w cytozolu.

Charakterystyka RNA

Biopolimer zbudowany z czterech podstawowych rodzajów rybonukleotydów, połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi w nierozgałęziony łańcuch (polirybonukleotyd). Liczba rybonukleotydów w łańcuchu może wynosić od ok. 70 do kilkudziesięciu tysięcy. W RNA stosunkowo często występują zasady rzadkie. RNA zazwyczaj występuje w postaci jednoniciowej, ale w obrębie jednej cząsteczki może tworzyć obszary dwuniciowe(→struktura drugorzędowa RNA); w niektórych wirusach występuje w postaci dwuniciowej. Uczestniczy w przekazywaniu informacji genetycznej zawartej w DNA (→transkrypcja) oraz w procesach jej odczytywania (→translacja) i modyfikowania (→modyfikacje postsyntetyczne RNA, →rybozymy), w niektórych wirusach jest materiałem genetycznym.

We wszystkich komórkach występują 3 podstawowe rodzaje RNA:

1. informacyjny RNA (mRNA)

2. przenoszący, przekaźnikowy, przenośnikowy RNA (tRNA)

3. rybosomalny RNA (rRNA)

Ad. 1

Jego zawartość wynosi zaledwie kolka procent całkowitej ilości komórkowego RNA. Wytwarzany jest w jądrze, przy udziale DNA chromosomów, a jego skład nukleotydowy jest komplementarny do składu jądrowego DNA, z tą różnicą, że zamiast tyminy występuje w nim uracyl. Cząsteczki mRNA są jednołańcuchowe i niejednorodne. Ich masy cząsteczkowe są rzędu kilkuset tysięcy do miliona. mRNA przenosi z chromosomów do rybosomów informację o sekwencji aminokwasów dla białka, które ma być syntezowane.

Ad. 2

tRNa otrzymuje się z płynu nad osadem uzyskanym po odwirowaniu elementów komórkowych siłą odśrodkową. tRNA występuje w materiale zwierzęcym, w roślinach wyższych, drożdżach i bakteriach, gdzie stanowi ok. 15% ogólnej zawartości RNA. Jego zadaniem jest wiązanie i przenoszenie aminokwasów do miejsca syntezy białka.

Ad. 3

Stanowi 50-80% pełnej zawartości RNA komórki. Występuje on w rybosomach, mikrosomalnych cząsteczkach, w których jest przeprowadzana biosynteza białka. Wszystkie rRNA są związane przez jon magnezowy z zasadowym białkiem, a powstałe nukleoproteidy są głównym materiałem , z którego są zbudowane rybosomy. rRNA zbudowany jest z 4 nukleotydów: adeninowego, guaninowego, uracylowego, cytozynowego. rRNA bierze czynny udział w procesie translacji, m.in. katalizując przyłączanie aminokwasów do syntetyzowanego łańcucha polipeptydowego.

46. Budowa DNA.

• DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy jest nośnikiem informacji genetycznej. Stanowi
  bardzo długą , nitkowatą makrocząsteczkę zbudowaną z wielu nukleotydów. W skład nukleotydu wchodzą: jedna z 4 zasad azotowych, reszta fosforanowa i cukier dezoksyryboza. Informację genetyczną przenoszą zasady purynowe i pirymidynowe. Grupy fosforowe i cukrowe spełniają rolę strukturalną.

• Szkielet DNA stanowią dezoksyrybozy, połączone mostkami fosfodwuestrowymi. Grupa 3'-hydroksylowa reszty cukrowej jednego nukleotydu łączy się wiązaniem fosfodwuestrowym z grupą 5'-hydroksylową sąsiedniej reszty cukrowej. W wyniku tego powstaje łańcuch polinukleotydowy. Cząsteczka DNA zbudowana jest z 2 takich łańcuchów.

• w DNA występują 4 rodzaje zasad. Są nimi 2 puryny: adenina (A) i guanina (G) oraz 2 pirymidyny: tymina (T) i cytozyna (C).Dwa łańcuchy łączą się ze sobą wiązaniami wodorowymi między parami zasad A=T i G=C

• 2 helisy DNA zwijają się dookoła własnej osi i biegną w przeciwnych kierunkach (zasady znajdują się wewnątrz, a fosforany i dezoksyrybozy - na zewnątrz helisy)

• łańcuch DNA wykazuje biegunowość. Na jednym końcu łańcucha jest wolna grupa 5'-OH, na drugim 3'-OH nie połączona z innym nukleotydem. Kolejność zasad zapisana jest w kierunku 5'→3'

47. Budowa RNA

• RNA - kwas rybonukleinowy zbudowany z jednej nici polinukleotydowej

• składa się z nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodwuestrowymi 3'→ 5'

• nukleotyd składa się z: reszty fosforanowej, jednej z 4 zasad azotowych - adenina (A), guanina(G), cytozyna (C) i uracyl (U), jednostką cukrową w RNA jest ryboza. Uracyl tworzy parę a adeniną.

• Istnieją 3 rodzaje cząsteczek RNA: informacyjny RNA (mRNA), transferowy (tRNA), rybosomalny (rRNA)

• Cząsteczki RNA są matryca dla syntezy białek. Przepływ informacji genetycznej odbywa się w kierunku od DNA przez RNA do białka

50. Mechanizm replikacji DNA.

Replikacja DNA jest semikonserwatywna - tzn. jedna z nici każdej potomnej cząsteczki DNA jest syntetyzowana na nowo, a druga pochodzi z rodzicielskiej cząsteczki DNA. Każda potomna cząsteczka otrzymuje zatem jedną nić cząsteczki rodzicielskiej.

Podczas replikacji, gdy syntetyzowane są nowe łańcuchy, obie nici podwójnej helisy rozplatają się i rozwijają. Każda nić rodzicielska działa jako matryca przy tworzeniu nowej nici komplementarnej. Replikacja jest procesem złożonym, przeprowadzanym przez liczne białka, w tym 3 rodzaje polimeraz DNA i ligazę DNA.

W miejscu inicjacji nastepuje przyłączenie polimerazy. Pod jej wpływem następuje rozerwanie wiązań wodorowych między zasadami, w wyniku tego powstają widełki replikacyjne. Na wprost lużnych łańcuchów polimeraza przyłącza wolne nukleotydy zgodnie z regułą komplementarności. W wyniku tego pękają kolejne wiązania wodorowe i proces się powtarza.

51. Kaseta TATA (TATA-box)

Transkrypcja w komórkach eukariotycznych, podobnie jak transkrypcja w komórkach prokariotycznych, wymaga promotora, z którym wiążę się polimeraza RNA. W wielokomórkowych organizmach eukariotycznych polimeraza RNA wiąże się z sekwencją zasad pod nazwą „kasety TATA”, zlokalizowaną około 30 par zasad powyżej miejsca inicjacji transkrypcji. Rejon promotorowy powyżej kasety TATA zawiera również jeden lub więcej elementów liczących 8-12 par zasad i znanych jako elementy promotorowe powyżej TATA. Znajdują się one w niewielkiej odległości od miejsca wiązania polimerazy RNA. Wydajność promotora zależy od liczby i rodzaju tych elementów. Zatem gen konstytutywny zawierający jeden taki element wyrażany będzie z niewielką wydajnością, podczas gdy gen zawierający pięć lub sześć takich elementów będzie aktywnie transkrybowany.

52. Elementy odpowiadające za wierność translacji

Translacja wymaga udziału maszynerii komórkowej, która potrafi rozpoznać i odszyfrować kodony w mRNA. Kluczowym elementem tej maszynerii są cząsteczki tRNA. Każda cząsteczka tRNA jest „adaptorem”, który potrafi połączyć się ze specyficznym aminokwasem i rozpoznać właściwy dla tego aminokwasu kodon w mRNA. Rozpoznanie kodonów możliwe jest dzięki obecności w każdej cząsteczce tRNA sekwencji trzech zasad, zwanej antykodonem , który łączy się z kodonem w mRNA, tworząc komplementarne pary zasad.

Translacja wymaga również połączenia aminokwasów we właściwym porządku. Dokonują tego rybosomy.

53. Replicacja, tarnskrypcja, translacja.

Translacja - proces, w którym następuje odczyt informacji genetycznejz mRNA i synteza białka. Biorą w nim udział oprócz matrycy ( mRNA ) i aminokwasów także cząsteczki tRNA ( dostarczające aminokwasów ), rybosomy oraz szereg czynników wspomagających. Przetransportowany do cytoplazmy mRNA może ulec translacji, bądź też zostać szybko zdegradowany, jeśli białko jakie jest przezeń zakodowane występuje w komórce w dostatecznej ilości. I tak na przykład mRNA dla histonów jest bardzo stabilne w fazie S cyklu komórkowego, tj. w tym momencie, kiedy obserwuje się najwyższe zapotrzebowanie na histony. Zatem w fazie S następuje translacja mRNA histonowego. W innych fazach cyklu komórkowego stabilność tych transkryptów jest ok. 5-krotnie niższa, co oznacza, że ulegają one degradacji. Wniosek z tego, że synteza białka zachodzi w zależności od potrzeb komórki, a zatem regulacja ekspresji informacji genetycznej odbywa się także na etapie poprzedzającym translację.

Translacja mRNA zachodzi w kierunku 5'(R) 3', zatem pierwszy aminokwas syntetyzowanego polipeptydu zakodowany jest przez kodon ( patrz Kod genetyczny ) leżący bliżej 5' końca transkryptu. Natomiast najwcześniej wbudowanymi aminokwasami powstającego białka są te, które stanowią jego N - terminalną część. Wynika to z mechanizmu tworzenia wiązań peptydowych między sasiadujacymi aminokwasami ( patrz "Chemiczne podstawy biologii molekularnej" ).Translację podzielić można na trzy zasadnicze etapy: inicjację, elongację, terminację.

Transkrypcja to proces, w którym informacja zawarta w DNA - zapisana w formie sekwencji deoksyrybonukleotydów - przepisana zostaje na język rybonukleotydów w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) podczas reakcji katalizowanej przez enzym zwany polimerazą II RNA. Jak już wspomniano, każdy z etapów ekspresji jest bardzo złożony. Sama transkrypcja nie jest wyjątkiem, dzieli się ją bowiem dalej na trzy następujące po sobie zdarzenia: inicjację transkrypcji, elongację łańcucha pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA), terminację.

Podsumowanie: Transkrypcją rządzi zasada komplementarności., wydłużanie nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) zachodzi w kierunku 5'-> 3', Równolegle z elongacją pierwotnego transkryptu zachodzi modyfikacja jego 5' końca tj. tworzenie struktury czapeczki., Produktem reakcji katalizowanej przez polimerazę II RNA jest pre-mRNA tzn. cząsteczka zawierająca introny.

Replikacja DNA eplikacja jest procesem, w którym zachodzi podwojenie ilości materiału genetycznego w komórkach mających wejść w podział - mitotyczny lub mejotyczny - to znaczy będących w fazie S cyklu komórkowego. Znaczenie replikacji jest najwyraźniej widoczne, kiedy poruszony zostaje temat "losu informacji genetycznej" danego organizmu w rozwoju embrionalnym. Wiadomo jest, że wszystkie organizmy wielokomórkowe ( m.in. ludzie, których ciała liczą biliony komórek ) wzięły swój początek z pojedynczych zygot, w k tórych zdeponowany został materiał genetyczny obojga rodziców. Kolejne podziały prowadzące do wzrostu liczby komórek związane są z koniecznością podwajania ilości DNA w komórkach rosnącego zarodka. Za powielanie informacji zgromadzonej w DNA odpowiedzial ne są enzymy zwane polimerazami DNA, których działanie jest bardzo precyzyjne. Dzięki temu materiał genetyczny w każdej komórce jest w zasadzie identyczny, a zatem niesie identyczną informację. W replikacji DNA głównym problemem jest precyzyjna duplikacja sekwencji nukleotydowych, co zachodzi dzięki parowaniu komplementarnemu. Proces replikacji jest semikonserwatywny, co oznacza, że wyprodukowane podwójne helisy zawierają jedną nić rodzicielską i jedną nowoutworzoną. Replikacja zachodzi od 5' do 3' końca dzięki polimerazom DNA. Enzymy te nie mogą rozpocząć syntezy nowej nici bez primera (zwykle krótka cząsteczka RNA). Podczas replikacji ( jak również innych procesów związanych z DNA m.in. transkrypcji ) konieczne jest rozluźnienie strukury chromatyny w celu umożliwienia oddziaływań aparatu enzymatycznego ( replikacyjnego ) z DNA. Rozluźnienie to dotyczy poszczeg ólnych fragmentów, przez które - w danym momencie - przechodzą widełki replikacyjne, a nie całego chromosomu. Eliminację struktur nukleosomowych, a co za tym idzie wypętlenie odcinka mającego ulec replikacji, umożliwiają tzw. białka struktur jądrowych. D emontaż rdzenia nukleosomowego prawdopodobnie zainicjowany jest dysocjacją bądź usunięciem dimeru H2A : H2B. Dopiero do tak wyeksponowanego nagiego DNA mają dostęp białka replikacyjne. Po przejściu przez dany fragment widełek replikacyjnych tj. po dosynte tyzowaniu nowych nici DNA ( tzw. potomnych ) następuje odbudowa struktury nukleosomowej. Interesujący jest fakt, że "stare" histony ( tj. pochodzące z demontażu ) wykorzystywane są przez tę cząsteczkę DNA, która zawiera nić wiodącą ( patrz Genetyka moleku larna Procaryota ).

53. Replikacja, transkrypcja, translacja

REPLIKACJA DNA , biosynteza DNA to enzymatyczny proces powielania DNA polegający na rozpleceniu wyjściowej („matczynej”) dwuniciowej cząsteczki i dosyntetyzowaniu do każdej z nici drugiej, komplementarnej, w wyniku czego powstają dwie identyczne dwuniciowe cząsteczki potomne. Ponieważ każda z cząsteczek potomnych zawiera jedną nić „matczyną” i jedną nowo zsyntetyzowaną, replikacja DNA jest określana jako semikonserwatywna. Substratem do replikacji DNA są nukleozydotrifosforany. W replikacji DNA obok polimeraz DNA, uczestniczy bardzo wiele innych enzymów (m.in. ligaza, primaza) i białek nieenzymatycznych. W ciągu sekundy replikacji ulega odcinek długości ok. 80 nukleotydów w eukariotach, a długości ok. 800 nukleotydów w bakteriach. Replikacja DNA jest najdokładniejszym z zachodzących w przyrodzie procesów enzymatycznych.

**

Replikacja DNA to synteza DNA, w czasie której komplementarna nić DNA służy jako matryca.

TRANSKRYPCJA to proces biosyntezy RNA na matrycy DNA, katalizowany przez polimerazy RNA. Podczas transkrypcji dwuniciowa cząsteczka DNA ulega lokalnemu rozpleceniu i transkrypcji podlega tylko jedna nić. Substratem do transkrypcji są nukleozydotrifosforany, od których ulega odłączeniu pirofosforan, a monofosfonukleozydy są przyłączane kolejno i tworzą syntetyzowany łańcuch RNA. Wynikiem transkrypcji są tzw. pierwotne transkrypty, których sekwencja nukleotydów jest wierna komplementarną kopią jednej nici DNA. Pierwotne transskrypty w wyniku modyfikacji postsyntetycznych ulegają przekształceniu w dojrzałe cząsteczki RNA. Proces zapoczątkowania transkrypcji, zwany inicjacją transkrypcji, jest najważniejszym etapem regulacji ekspresji informacji genetycznej. Obok polimeraz RNA w transkrypcji uczestniczy wiele innych białek, m.in. rozpoznające specyficzne sekwencje nukleotydowe w DNA i enzymy rozplatające DNA. U eukariotów transkrypcja zachodzi w jądrze komórkowym, plastydach i mitochondriach a u prokariotów w nukleoidzie.

**

Synteza RNA polega na kopiowaniu informacji zawartej w jednym kwasie nukleinowym (DNA) na informację zawartą w innym kwasie nukleinowym (RNA), nazywamy ten proces transkrypcją (przypisywaniem)

TRANSLACJA, biosynteza białka to proces biosyntezy łańcucha polipeptydowego na matrycy mRNA zachodzący w rybosomach. Substratem do translacji są aminokwasy przyłączone do tRNA (aminoacylo-tRNA). W procesie translacji kolejne cząsteczki aminoacylo-tRNA są przyłaczane do nowo syntetyzowanego łańcucha polipeptydowego w taki sposób, że łańcuch stale na końcu jest przyłączany do cząsteczki tRNA. O kolejności przyłączania poszczególnych aminoacylo-tRNA decydują kodony (kolejne trójki nukleotydów) w mRNA zgodnie z kodonem genetycznym. Po przyłaczeniu kolejnej cząsteczki aminoacylo-tRNA mRNA przesuwa się względem rybosomów o trzy nukleotydy. Energia konieczna do translacji pochodzi z hydrolizy wiązań makroergicznych w GTP (GTP-trifosforan guanozyny). Poszczególne reakcje translacji katalizowane są przez białka zarówno wchodzące w skład rybosomów, jak i nie związane z rybosomami. Zakończenie translacji następuje po napotkaniu kodonu STOP. Powstały w wyniku translacji łańcuch polipeptydowy podlega zazwyczaj modyfikacjom postsyntetycznym. Translacja u prokariontów zachodzi równocześnie lub bezpośrednio po zakończeniu transkrypcji, u eukariontów zachodzi w cytozolu lub na tzw. szorstkim retikulum endoplazmatycznym, a także w mitochondriach i plastydach.

**

Translacja to proces w którym informacja zawarta w mRNA zostaje przetłumaczona jako sekwencja specyficznych aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.

54. Kod genetyczny; kodony „start” i „stop”

KOD GENETYCZNY to reguła przypisująca poszczególnym trójkom nukleotydów (kodonom) a mRNA aminokwasy, które zostają włączone w procesie translacji do powstającego łańcucha polipeptydowego. Spośród 64 możliwych kodonów trzy nie odpowiadają żadnemu aminokwasowi i oznaczają miejsce zakończenia translacji (tzw. kodony STOP lub nonsens). Pozostałych 61 kodonów koduje 20 aminokwasów białkowych. Kod genetyczny jest określany jako uniwersalny, tzn. obowiązujący dokładnie w tej samej postaci we wszystkich organizmach

KODON to trzy kolejne nukleotydy (triplet) w cząsteczce mRNA określające rodzaj aminokwasu wbudowywanego w łańcuch polipeptydowy w czasie translacji. Reguły przypisujące kodonom odpowiadające im aminokwasy to kod genetyczny.

**

Informacja o budowie białka zawarta w mRNA zapisana jest za pomocą kodonów

Syntezę łańcucha polipeptydowego kończą „czynniki uwalniające”, które rozpoznają kodony terminacyjne (kodony „stop”) znajdujące się na końcu sekwencji kodującej. Kodony UAA, UGA, UAG, które nie kodują żadnego aminokwasu są specjalnymi sygnałami „stop”

55. Przebieg biosyntezy białka

55. Biosynteza białek

We wszystkich znanych organizmach kwasy nukleinowe są niezbędnymi czynnikami biosyntezy białka.

Miejscem biosyntezy są rybosomy.

W biosyntezie łańcucha białkowego można wyróżnić trzy etapy:

1. zapoczątkowanie (inicjacja) łańcucha

2. przedłużanie (elongacja)

3. zakończenie (terminacja)

W każdym z tych etapów biorą udział swoiste czynniki(faktory). Są to substancje białkowe o enzymatycznych właściwościach. W biosyntezie białka są też niezbędne dwuwartościowe i jednowartościowe jony (Mg²+, K+) i GTP jako źródło energii.

Ad 1

Proces inicjacji składa się z kilku stadiów i wymaga udziału szeregu białek zwanych czynnikami inicjacyjnymi. Rozpoczyna się od dołaczenia do mniejszej podjednostki rybosomu specjalnej cząsteczki inicjatorowego metionylo-tRNA. We wszystkich organizmach kodonem inicjacyjnym w syntezie białka jest AUG, kodujący aminokwas metioninę. U E.coli występują dwa typy tRNA dla metioniny rozpoznające kodon AUG. Są to inicjatorowy i normalny tRNA dla metioniny. Po połączeniu z inicjatorowym tRNA czasteczka metioniny jest modyfikowana w wyniku dołączenia do jej grupy aminowej cząsteczki kwasu mrówkowego. Na koncu aminowym każdej cząsteczki białka syntetyzowanej w komórce E.coli znajduje się zmodyfikowany aminokwas N-formylometionina , która jest włączana tylko jako pierwszy aminokwas łańcucha polipeptydowego

Ad 2

Dodawanie kolejnych aminokwasów do rosnącego łańcucha polipeptydowego nazywane jest elongacją (wydłużaniem). W tym etapie biosyntezy do rybosomu dostaje się następny , odpowiedni AA-tRNA i swym antykodonem wiąże się z kolejnym kodonem w łańcuchu mRNA. W procesie tym uczestniczy czynnik T (enzym wiążący) oraz cząsteczka GTP. Mechanizm wydłuzania łańcucha polipeptydowego przebiega następująco:

1. peptydylo-tRNA zajmuje miejsce P

2. do miejsca A przyłącza się cząsteczka tRNA

3. pomiędzy grupą aminową aminokwasu połączonego z cząsteczką tRNA znajdującą się w miejscu A i grupą karboksylową aminokwasu połączonego z cząsteczką tRNA znajdującą się w miejscu P utworzone zostaje wiązanie peptydowe

4. po usunięciu tRNA z miejsca P przesuwane są do niego peptydylo-tRNA i komplementarny kodon w mRNA

5. miejsce A jest teraz gotowe do przyjęcia następnej aminoacylo-tRNA, określonej przez znajdujący się w tym miejscu kodon mRNA.

Ad. 3

Syntezę łańcucha polipeptydowego kończą „czynniki uwalniające” które rozpoznają kodony terminacyjne (kodony „stop”) znajdujące się na końcu sekwencji kodującej.

56. Funkcje poszczególnych kwasów rybonukleinowych w biosyntezie białka

mRNA przenosi z chromosomów do rybosomów informację o sekwencji aminokwasów dla białka, które ma być syntezowane.

Zadaniem tRNa jest wiązanie i przenoszenie aminokwasów do miejsca syntezy białka.rRNA bierze czynny udział w procesie translacji, m.in. katalizując przyłączanie aminokwasów do syntetyzowanego łańcucha polipeptydowego.

57. Powstawanie i rola aminoacylo-tRNA

tRNA - tRNA (transportowy RNA) to mała cząsteczka kwasu rybonukleinowego, która przyłącza aminokwas i przenosi go na teren rybosomu, gdzie aminokwas jest wbudowywany do powstającej cząsteczki białka.

tRNA bierze udział w translacji: cząsteczki tRNA przenoszą aminokwasy na teren rybosomu i umożliwiają ich wbudowanie do powstającego białka zgodnie z informacją genetyczną zakodowaną w mRNA; stanowi 10—12% ogólnej ilości kwasów rybonukleinowych w komórce. Jest on zbudowany z 70-90 nukleotydów. Charakteryzuje się wśród innych rodzajów RNA najmniejszą masą cząsteczkową, zawartą w granicach od 25 do 30 kDa. tRNA cechuje wysoka specyficzność w stosunku do aminokwasów. Każdy z aminokwasów syntetyzowanego białka może być transportowany przez jeden, a niektóre przez kilka różnych tRNA. Cząsteczki tRNA występują w komór­kach w stanie wolnym bądź też związane ze specyficznym aminokwasem. Cząsteczka tRNA ma budowę palczastą. Jest ona zwinięta spiralnie, a w pewnych miejscach tworzą się pętle. Ramiona tych pętli są dwuniciowe, skręcone spiralnie. Na tych odcinkach pary zasad mogą łączyć się wiązaniami wodorowymi. Niektóre fragmenty pętli mają jednakowe sekwencje nukleotydowe we wszystkich tRNA. Istnieją odcinki wykazujące znaczne różnice, które decydują o specyficzności tych kwasów. W składzie nukleotydowym tRNA, oprócz zasad typowych, występuje około 10% zasad „rzadkich", do których należą metylowe pochodne zasad typowych, a także pseudourydyna i dihydrourydyna. Zasady rzadkie znajdują się przede wszystkim we fragmentach jednoniciowych. W cząsteczce tRNA wyróżniono 5 ramion: aminokwasowe, dihydrourydynowe, antykodonowe, dodatkowe oraz ramię 'PFC (pseudourydynowe). Każde z tych ramion pełni inną funkcję

tRNA - zwany transferowym RNA, związany z enzymem - syntetazą aminoacylo-tRNA, służy do odczytywania kodu genetycznego i transportu odpowiednich aminokwasów do - rybosomu, w trakcie procesu translacji. Cząsteczki tRNA zbudowane są z ok. 75 nukleotydów, podobnie jak mRNA wytwarzane są one w wyniku obróbki cząsteczki pierwotnego transkryptu. W skład cząsteczki wchodzą również zmodyfikowane zasady azotowe (np.: dihydrourydyna, pseudourydyna). W każdej komórce znajduje się przynajmniej 20 rodzajów cząsteczek tRNA i przynajmniej jedna odpowiada swoistemu aminokwasowi. Cząsteczki tRNA posiadają cztery dwuniciowe obszary pozwalające wytworzyć drugorzędową strukturę podobną do liścia koniczyny. W cząsteczce tRNA można wyróżnić 4 główne ramiona. Ramię akceptorowe składa się z szypuły utworzonej ze sparowanych zasad, które kończy się sekwencją CCA (5'-3'). Grupa 3'-hydroksylowa reszty adenylowej wiąże się z grupą karboksylową odpowiednich dla danej cząsteczki tRNA aminokwasów wiązaniem estrowym. Pozostałe ramiona posiadają szypuły ze sparowanych zasad i na końcu pętle zawierające zasady niesparowane. Pętla ramienia antykodonowego posiada sekwencję antykodonową, decydującą o specyficzności cząsteczki tRNA w procesie translacji. Sekwencja antykodonowa rozpoznaje komplementarny tryplet nukleotydów tworzących kodon, na cząsteczce mRNA - w taki sposób następuje odczyt informacji genetycznej. Ramiona DHU i T C zostały nazwane od sekwencji, w których występują nietypowe nukleotydy wchodzących w skład ich końcowych pętli.

Miejsce aminoacylowe - Miejsce na rybosomie, do którego podczas translacji wchodzi cząsteczka tRNA wiążąca aminokwas przeznaczony do przyłączenia do cząsteczki białka.

58. mRNA -

mRNA (messenger RNA, RNA przekaźnikowy) to jednoniciowa cząsteczka RNA, która przenosi informację genetyczną zakodowaną w genie z jądra komórkowego do cytoplazmy. W cytoplazmie cząsteczka mRNA jest wykorzystywana jako matryca w procesie produkcji białka. W odróżnieniu od cząsteczki pre-mRNA cząsteczka mRNA nie zawiera intronów, które zostały usunięte podczas składania genu

mRNA - (ang. messenger RNA) - jest pojedynczą cząsteczką RNA (ssRNA), która jest nośnikiem informacji genetycznej, zawartej w postaci sekwencji zasad azotowych w cząsteczce. Na jej podstawie polimeryzowane są aminokwasy wg określonej kolejności - dzięki temu procesowi powstaje produkt końcowy ekspresji informacji genetycznej - białko. Bezpośredni produkt transkrypcji - prekursorowy RNA ("pierwotny transkrypt") podlega późniejszym obróbkom potranskrypcyjnym. Szczególnie w przypadku organizmów Eukariotycznych (jądrowych) w procesie splicingu, (wycinania intronów) są wycinane niekodujące części RNA oraz dołączane elementy stabilizujące - od końca 5' "czapeczkę" (ang. cap - będącą zmodyfikowanym nukleotydem guanylowym) oraz na 3' końcu - "ogon poli-(A)" zawierający 200-250 nukleotydów adenylowych. Taka operacja zapobiega degradacji mRNA przez enzymy tnące łańcuch kwasu rybonukleinowego - RNA-zy

59. Powstawanie mRNA

powstaje w jądrze komórkowym w procesie transkrypcji z DNA. Jest syntetyzowany z trifosforanów nukleozydów. Jego zasady są komplementarne w stosunku do jednej z nici chromosomowego DNA, na której jest wytwarzany. Matrycowy RNA przenosi informację genetyczną z DNA do cytoplazmy. Masa cząsteczkowa mRNA oraz sekwencja nukleotydów zależą do rodzaju białka, które jest w nim zakodowane. Trójki nukleotydów, czyli kodony, rozmieszczone w jego łańcuchu wyznaczają kolejność aminokwasów syntetyzowa­nego białka

60. Obróbka potranslacyjna mRNA

I tak oto osiągnęliśmy etap pierwotnego transkryptu, który aby stać się matrycą w syntezie białka , musi ulec zasadniczym modyfikacjom. Polegają one na wycięciu intronów oraz ( co jest charakterystyczne dla większości pre-mRNA ) dodaniu na 3' końcu długiego fragmentu tzw. poli A.

Poliadenylacja Znakomita większość produktów reakcji katalizowanej przez polimerazę II RNA zawiera na swoim 3' końcu tzw. ogon poli A, tj. ciąg liczący od 100 do 250 połączonych ze sobą nukleotydów adeninowych. Nie znaczy to jednak, że w większości genów znajduje się obszar bogaty w pary AT. Fragment poli A nie jest efektem transkrypcji a posttranskrypcyjnej modyfikacji, w której udział bierze enzym zwany polimerazą poli A. Polimeraza poli A dodaje na 3' końcu pierwotnego transkryptu kolejne nukleotydy adeninowe dopiero po zadziałaniu specyficznej nukleazy tj. enzymu tnącego kwas nukleinowy w obrębie jego cząsteczki. Okazuje się bowiem, że ogon poli A nie jest dołączan y do ostatniego nukleotydu wbudowanego na drodze transkrypcji, a do tego, który stał się ostatnim po rozcięciu nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA). Miejsce atakowane przez nukleazę nie jest dowolne, wyznacza je sekwencja: AAUAAA położona w różnej odległości od przeznaczonego m iejsca działania enzymu. Istnieją geny zawierające więcej niż jeden sygnał poliadenylacji ( tj.wspomnianą sekwencję ). Oznacza to, że na ich matrycy powstanie kilka pierwotnych transkryptów różniących się długością , a co za tym idzie kilka różnych mRNA. Przykładem alterna tywnej poliadenylacji może być modyfikacja pierwotnego transkryptu szczurzego genu kodującego kalcytoninę. Gen ten zawiera dwa miejsca poliadenylacji, z których pierwsze preferowane jest w komórkach tarczycy a drugie w mózgu. Ogon poli A podobnie jak struktura czapeczki chroni cząsteczkę pierwotnego transkryptu przed działaniem nukleaz. Może on mieć również znaczenie w translacji, okazuje się bowiem, że transkrypt pozbawiony ogona poli A jest mniej wydajną matrycą przy sy ntezie białka.

Wycinanie intronów Zanim powstanie ostateczny, dojrzały mRNA mogący ulec translacji, pre-mRNA musi zostać pozbawiony intronów. Proces wycinania tych niekodujących "wtrętów" zwany jest splicingiem i wykorzystuje jeden wspólny dla eliminacji wszystkich intronów aparat enzymatyczny. Oznacza to, że introny muszą mieć jakieś wspólne elementy rozpoznawane przez wspomniany aparat splicingowy. Z porównywania sekwencji różnych intronów wynika, że łączą je następujące podobieństwa:

• na 5' końcu zawierają zawsze kolejno: resztę guaninową i uracylową (5'- GU)

• na ich 3' końcu występuje reszta guaninowa poprzedzona resztą adeninową (AG - 3')

• wewnątrz zawierają tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym kluczową dla splicingu rolę odgrywa nukleotyd adeninowy.

Mechanizm splicingu Wycinanie intronów, jak każdy proces przeprowadzany przez organizm żywy, jest skomplikowane. Wyróżnić w nim można kilka etapów:1. Rozcięcie cząsteczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' (tj. na 5' końcu intronu).W wyniku tej reakcji następuje uwolnienie 5' końca fosforanowego egzonu 1. 2. Atak grupy 2'-OH nukleotydu adeninowego ( z miejsca rozgałęzienia ) na 5' grupę fosforanową nukleotydu guaninowego intronu. Jak wiadomo wiązania między kolejnymi nukleotydami to wiązania fosfodiestrowe tworzone między tzw. 5' grupą fosforanową a gru pą hydroksylową ( -OH ) rybozy. Zwykle do wiązania tego angażowana jest grupa 3'-OH, niemniej jednak inne reszty hydroksylowe m.in. 2' posiadają zdolność do interakcji z resztą fosforanową. I tak nukleotyd adeninowy ( z miejsca rozgałęzienia ) mając grup ę 3'-OH wykorzystaną w "normalnym" wiązaniu fosfodiestrowym do interakcji z resztą fosforanową 5' intronu angażuje grupę 2'-OH. Tworzy się tu wiązanie 2'-5' fosfodiestrowe.3. Atak uwolnionej grupy 3'-OH egzonu 1 na 5' grupę fosforanową egzonu 2 z uwolnieniem intronu mającego postać lassa.

Spliceosom Opisane powyżej reakcje nie zachodzą samoistnie. Są one katalizowane przez kompleks przyłączających się kolejno cząstek tworzących spliceosom. W skład aparatu splicingowego wchodzi pięć rodzajów snRNP ( snRNA + białka ): U1, U2, U4, U5 i U6, z który ch każdy pełni odrębną, istotną funkcję: U1- łączy się z miejscem splicingowym 5'i 3' na zasadzie komplementarności, zawiera on bowiem w swej rybonukleinowej komponencie sekwencję komplementarną do styków egzon-intron; U2- wiąże miejsce rozgałęzienia; U6- katalizuje splicing, występuje w kompleksie z U4 i U5. Sposób działania spliceosomu: Produktem splicingu jest dojrzały mRNA niosący same istotne informacje dotyczące budowy białka ( poza fragmentami skrajnymi, których głównym zadaniem jest stabilizacja transkryptu ). Okazuje się jednak, że na matrycy jednego genu może powstać kil ka różnych mRNA, co poza alternatywną poliadenylacją powodowane jest tzw. alternatywnym splicingiem. Polega on na łączeniu ze sobą różnych egzonów tzn. niekoniecznie wszystkich występujących w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA).5'NT i 3'NT - obszary nie ulegające translacji Nie wiadomo jeszcze dokładnie, dlaczego w różnych tkankach wybierane są odmienne wzory łączenia egzonów. Być może maszyneria obsługująca proces wycinania intronów nie jest identyczna we wszystkich rodzajach komórek tzn. występują pewne subtelne, ale znaczące różnice między spliceosomami poszczególnych tkanek. Możliwe jest także, że podstawowy aparat splicingowy jest uniwersalny, a różne tkanki zawierają dla siebie charakterystyczne czynniki ( białkowe lub RN-owe ) łączące się z pre-mRNA, czego konse kwencją może być ułatwienie bądź utrudnienie działania spliceosomów w różnych miejscach w obrębie pierwotnego transkryptu.

Podsumowując:

1. Pre-mRNA zanim stanie się pełnowartościową matrycą do syntezy białka musi przejść przez proces dojrzewania.

2. Dojrzewanie obejmuje 3 zasadnicze modyfikacje:

• capping ( dodawanie czapeczki )

• poliadenylację podnoszącą stabilność transkryptu;

• splicing, w którym eliminowane są wewnętrzne niekodujące rejony informacyjnego RNA.

3. Alternatywny splicing i poliadenylacja mogą generować różne produkty ( mRNA ) wykrywane w różnych tkankach, co znaczy, że jeden gen może kodować więcej niż jedno białko.

4. Dojrzewanie pre-mRNA jest warunkiem eksportu transkryptu z jądra.

5. Dojrzały mRNA wiąże się z białkami mającymi wpływ na jego stabilność, transport i translację.

61. Różnice w translacji u organizmów pro- i eukariota.,

W procesie transkrypcji u eukariontów powstaje najpierw pre--mRNA, jako składnik frakcji heterogennego jądrowego hnRNA. Dalszym etapem jest proces modyfikacji, w którym następuje dobieranie i łączenie z sobą fragmentów łańcucha RNA, aby powstał ostatecznie łańcuch zawierający informację o ściśle określonym białku

U Prokariota inicjacja syntezy białek zaczyna się od uformowania kompleksu zawierającego podjednostkę 30S, mRNA, tRNA dla formylometioniny i czynniki inicjatorowe. Do tego kompleksu przyłącza się podjednostka 50S. Związanie mRNA z rybosomem zależy od tzw. sekwencji Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotydów zlokalizowanych przed kodonem inicjacyjnym na mRNA). Ta sekwencja jest komplementarna do 3' końca 16S RNA rybosomu i pozwala komórkom prokaryotycznym na translację policystronicznego mRNA.

Proces inicjacji rozpoczyna się przyłączeniem aminoacylo-tRNA do kodonu start. U bakterii inicjatorowym aminoacylo-tRNA jest formylometionina. Terminacja syntezy białek zachodzi gdy osiągnięty zostanie kodon nonsensowny inaczej zwany kodonem stop. Białka uwalniają się, a rybosom dysocjuje na dwie podjednostki.

W komórkach prokariotycznych procesy transkrypcji i translacji zachodzą jednocześnie do tego stopnia, że możliwe jest rozpoczęcie translacji na jednym końcu mRNA zanim zostanie zakończona transkrypcja na drugim końcu.

63. Alternatywne skladanie (splicing) mRNA

Zanim powstanie ostateczny, dojrzały mRNA mogący ulec translacji, pre-mRNA musi zostać pozbawiony intronów. Proces wycinania tych niekodujących "wtrętów" zwany jest splicingiem i wykorzystuje jeden wspólny dla eliminacji wszystkich intronów aparat enzymatyczny. Oznacza to, że introny muszą mieć jakieś wspólne elementy rozpoznawane przez wspomniany aparat splicingowy. Z porównywania sekwencji różnych intronów wynika, że łączą je następujące podobieństwa:

• na 5' końcu zawierają zawsze kolejno: resztę guaninową i uracylową (5'- GU)

• na ich 3' końcu występuje reszta guaninowa poprzedzona resztą adeninową (AG - 3')

• wewnątrz zawierają tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym kluczową dla splicingu rolę odgrywa nukleotyd adeninowy.

Mechanizm splicingu Wycinanie intronów, jak każdy proces przeprowadzany przez organizm żywy, jest skomplikowane. Wyróżnić w nim można kilka etapów:1)Rozcięcie cząsteczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' (tj. na 5' końcu intronu).W wyniku tej reakcji następuje uwolnienie 5' końca fosforanowego egzonu 1.2)Atak grupy 2'-OH nukleotydu adeninowego ( z miejsca rozgałęzienia ) na 5' grupę fosforanową nukleotydu guaninowego intronu. Jak wiadomo wiązania między kolejnymi nukleotydami to wiązania fosfodiestrowe tworzone między tzw. 5' grupą fosforanową a gru pą hydroksylową ( -OH ) rybozy. Zwykle do wiązania tego angażowana jest grupa 3'-OH, niemniej jednak inne reszty hydroksylowe m.in. 2' posiadają zdolność do interakcji z resztą fosforanową. I tak nukleotyd adeninowy ( z miejsca rozgałęzienia ) mając grup ę 3'-OH wykorzystaną w "normalnym" wiązaniu fosfodiestrowym do interakcji z resztą fosforanową 5' intronu angażuje grupę 2'-OH. Tworzy się tu wiązanie 2'-5' fosfodiestrowe.3)Atak uwolnionej grupy 3'-OH egzonu 1 na 5' grupę fosforanową egzonu 2 z uwolnieniem intronu mającego postać lassa.

Produktem splicingu jest dojrzały mRNA niosący same istotne informacje dotyczące budowy białka ( poza fragmentami skrajnymi, których głównym zadaniem jest stabilizacja transkryptu ). Okazuje się jednak, że na matrycy jednego genu może powstać kil ka różnych mRNA, co poza alternatywną poliadenylacją powodowane jest tzw. alternatywnym splicingiem. Polega on na łączeniu ze sobą różnych egzonów tzn. niekoniecznie wszystkich występujących w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA).

64. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Technika hybrydyzacji kwasów nukleinowych może być wykorzystywana do wykrywania obecności genu w komórce biorcy w przypadku braku jego ekspresji. Wszystkie metody hybrydyzacji polegają na tworzeniu struktur dwuniciowych z cząsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydowych. Dokładne sparowanie daje stabilną strukturę dwuniciową, oporną na wysokie temperatury. Gdy parowanie przebiega z mniejszą dokładnością, wtedy powstające hybrydy nie tolerują tzw. ostrych warunków (podwyższonych temperatur i małych stężeń soli. Ważną cechą hybrydyzacji kwasów nukleinowych jest to, że stopień jej rygorystyczności to znaczy wymaganej dokładności parowania zasad, może być kontrolowany za pomocą odpowiedniej temperatury i mocy jonowej rozpuszczalnika.

Ogrzewając dwuniciowy DNA można osiągnąć temperaturę, w której obie nici DNA rozdzielają się. Proces zrywania wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi zasadami i oddzielanie się pojedynczych nici nazywa się denaturacją DNA. Z kolei podczas obniżania temperatury będą się odtwarzały komplementarne pary zasad między jednoniciowymi cząsteczkami DNA, powodując ponowne utworzenie się dwuniciowej heliakalnej cząsteczki DNA. Proces ten jest nazywany renaturacją. Dwie dowolne jednoniciowe cząsteczki kwasów nukleinowych mogą tworzyć struktury dwuniciowe (mogą hybrydyzować) tylko wtedy, gdy zawierają sekwencje komplementarne dostatecznie długie, by utworzony hybryd był stabilny w warunkach reakcji.

HYBRYD- jest to dwuniciowy kwas nukleinowy stanowiący produkt hybrydyzacji.

Szybkość tworzenia się dwuniciowych hybrydów zależy od stężenia cząsteczek jednoniciowych. Stężenie specyficznych sekwencji kwasu nukleinowego w jakiejś próbce można zmierzyć przez hybrydyzację z odpowiednio znakowaną sondą DNA (SONDA- jest to fragment DNA komplementarny do badanego kwasu nukleinowego. Może nią być jedna nić fragmentu restrykcyjnego DNA, klonowany DNA lub syntetyczny oligonukleotyd). Po hybrydyzacji nadmiar sondy rozkłada się za pomocą nukleazy. Ilość sondy, która nie uległa rozkładowi przez tę nukleazę, stanowi miarę stężenia sekwencji badanej. Warunki hybrydyzacji można zmienić tak, by z sondą hybrydyzowały wyłącznie sekwencje komplementarne (hybrydyzacja rygorystyczna) lub komplementarne i podobne (hybrydyzacja nierygorystyczna). Hybrydyzacja z odpowiednią sondą służy do wykrywania sekwencji komplementarnych do niej.

Metoda Southerna polega na elektroforetycznym rozdziale fragmentów DNA, przeniesieniu ich na filtr nitrocelulozowy i następnej inkubacji filtra ze znakowaną sondą DNA w celu wykrycia tych fragmentów DNA, które zawierają sekwencje komplementarne do sondy.

Metoda „northern” jest analogiczna do metody Southerna, z tą różnicą, że w elektroforezie i przeniesieniu na nitrocelulozę poddaje się RNA, a nie DNA.

W celu przeprowadzenia hybrydyzacji in situ próbkę tkanki inkubuje się z sondą w postaci znakowanego kwasu nukleinowego, odmywa nadmiar sondy i określa lokalizację tej jej części, która uległa hybrydyzacji. Metoda ta umożliwia określenie miejsca ekspresji genu w komórce oraz zlokalizowanie indywidualnych genów na chromosomach.

65. Enzymy (nukleazy) restrykcyjne.

Enzymy restrykcyjne (restryktazy) występują w komórkach bakteryjnych. Ich obecność w danej bakterii ogranicza wzrost pewnych wirusów bakteryjnych, zwanych bakteriofagami. Należą one do grupy endonukleaz, które przecinają DNA w swoistych sekwencjach w obrębie cząsteczki. Enzymy restrykcyjne stanowią część systemu obronnego bakterii, który chroni je przed atakiem wirusów.

Enzymy restrykcyjne umożliwiają rozcinanie DNA w specyficznych miejscach. Restryktazy rozpoznają specyficzne sekwencje i rozcinają DNA pozostawiając w miejscu rozcięcia tępe jego końce. Końce fragmentów restrykcyjnych DNA można połączyć za pomocą ligazy, uzyskując w ten sposób nowe zrekombinowane cząsteczki DNA.

Enzymy restrykcyjne izoluje się z bakterii, gdzie ich rola polega na ochronie komórki gospodarza przed infekcją wirusową. Dotychczas wyizolowano ponad 100 enzymów restrykcyjnych. Ich trójliterowe nazwy pochodzą od nazw gatunków bakterii, z których zostały wyizolowane. Pierwsza litera nazwy enzymu pochodzi od pierwszej litery nazwy rodzaju bakterii, a następne dwie od nazwy gatunku. Każdy z nich jest oznaczony dodatkowo cyfrą rzymską. (np. EcoRI był pierwszym enzymem izolowanym z Escherichia coli).

Fragmenty DNA (nazywane fragmentami restrykcyjnymi) powstające po rozcięciu cząsteczki DNA enzymem restrykcyjnym można rozdzielić metodą elektroforezy żelowej. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym umożliwia rozdział małych fragmentów; do rozdziału większych fragmentów jest potrzebny żel agarozowy. Po elektroforezie, DNA można w żelu uwidocznić przez wybarwienie go bromkiem etydyny, który wiąże się z DNA i silnie fluoryzuje, emitując jasnopomarańczowe światło.

Schemat przedstawiający rozmieszczenie miejsc rozcięcia DNA przez różne enzymy restrykcyjne nazywa się mapą restrykcyjną danej cząsteczki DNA. Mapy takie umożliwiają porównanie cząsteczek DNA bez konieczności określania ich sekwencji nukleotydowych.

66. Sekwencjonowanie DNA.

Sekwencja nukleotydowa dostarcza dużo informacji na temat budowy genu, zasad jego funkcjonowania oraz sposobu regulacji ekspresji.

Stosowane są dwie metody, a jedna z nich opracowana przez Maxama i Gilberta polega na analizowaniu produktów chemicznej degradacji (łańcuch DNA jest przecinany w miejscu swoistych nukleotydów) cząsteczek DNA. Druga metoda oparta jest na terminacji syntezy łańcuchów, znana jest jako metoda „dideoksy” Sanegera (stosownie od nazwiska jego twórcy). Obecnie najczęściej jest stosowana metoda „dideoksy” ze względu na jej szybkość i prostotę. W metodzie tej DNA przeznaczony do sekwencjonowania przygotowuje się w postaci cząsteczki jednoniciowe tak, by mogła ona służyć jako matryca do syntezy DNA podczas reakcji sekwencjonowania. Do kopiowania tej matrycy jest wykorzystywana polimeraza DNA I E.coli. Do rozpoczęcia syntezy DNA enzym ten potrzebuje jednak startera. Jako starter może być użyty albo fragment restrykcyjny DNA komplementarny do jednoniciowe matrycy, albo krótki oligonukleotyd, komplementarny do matrycy, otrzymany na drodze syntezy chemicznej.

Przygotowuje się cztery mieszaniny inkubacyjne, z których każda zawiera matrycę DNA, specyficzny starter DNA, polimerazę DNA I E.coli i wszystkie cztery trifosforany deoksyrybonukleozydów (dATP, dGTP, dCTP i dTTP). Każda z mieszanin zawiera ponadto jeden z czterech trifosforanów dideoksyrybonukleozydów (ddATP, ddCTP, ddGTP lub ddTTP), stanowiących analogi normalnych substratów syntezy DNA. Wprowadzenie analogu dideoksy do rosnącego łańcucha DNA uniemożliwia dalsze jego wydłużenie, a tym samym powoduje terminacji jego syntezy. Uzyskane produkty poddaje się elektroforezie w żelu poliakryloamidowym, a sekwencję DNA odczytuje z uzyskanego obrazu rozdzielonych pasm.

Obecnie DNA jest sekwencjonowany w sposób automatyczny opierając się na metodzie dideoksy, ale z zastosowaniem startera znakowanego fluoryzującym barwnikiem, a nie radioaktywnie. Starter wykorzystywany do każdej z czterech mieszanin jest znakowany barwnikiem o innej fluorescencji. Po inkubacji łączy się mieszaniny i poddaje elektroforezie. Laserowy detektor rozróżnia następnie i identyfikuje każdy z produktów w miarę ich wypływania z żelu. Kolejność, w jakiej są wymywane z żelu produkty fluorescencji, stanowi sekwencję DNA.

67. cDNA

cDNA- jest to DNA skopiowany z RNA (ang. complementary DNA). Jest to odwrotna transkryptaza.

Bibliotekę DNA stanowi kolekcja fragmentów DNA klonowanych w jakimś wektorze, którą można przeszukać w celu znalezienia fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Bibliotekę cDNA przygotowuje się wykorzystując odwrotną transkryptazę retrowirusa do zsyntetyzowania DNA komplementarnego (cDNA) do całkowitego mRNA komórki (lub jakiejś frakcji tego mRNA). Jednoniciowy cDNA jest następnie przekształcany w dwuniciowy DNA i wprowadzany do wektora. Każdy klon w tak przygotowanej bibliotece jest nazywany klonem cDNA. Inaczej niż w przypadku biblioteki genomowej zawierającej wszystkie sekwencje jądrowego DNA danego organizmu, biblioteka cDNA zawiera tylko te sekwencje, które ulegają ekspresji jako mRNA. Z różnych tkanek zwierzęcych w których dochodzi do ekspresji odmiennych zestawów genów, uzyskuje się różne biblioteki cDNA.

Analiza klonów cDNA pozwala na wykazanie cech białka kodowanego przez dany gen wraz z określeniem sekwencji aminokwasów. Szczególnie użyteczne są sekwencje cDNA gdy zakłada się wytwarzanie białka eukariotycznego w komórkach bakteryjnych, ponieważ cDNA genu zawiera nieprzerwaną sekwencję kodującą.

68. Klonowanie fragmentów DNA.

Większość fragmentów obcego DNA nie może w komórce ulegać samodzielnie replikacji i dlatego muszą one zostać połączone z wektorem (DNA wirusowym lub plazmidowym) zdolnym do autonomicznej replikacji. W typowym przypadku wektor łączy się z pojedynczym fragmentem obcego DNA. Jeśli punktem wyjścia jest złożona mieszanina fragmentów, to powstaje populacja wektorów zrekombinowanych z tymi fragmentami. Zrekombinowane cząsteczki DNA są następnie wprowadzane do komórek gospodarza które w typowym przypadku przyjmują tylko jedną cząsteczkę zrekombinowanego DNA.

Istnieje dużo rozmaitych procedur klonowania DNA w wektorach plazmidowych lub wirusowych, ale zasadniczy schemat postępowania jest podobny. Aby klonować w wektorze plazmidowym, najpierw rozcina się kolisty plazmid za pomocą enzymu restrykcyjnego dla którego w cząsteczce wektora istnieje tylko pojedyncze miejsce restrykcyjne. Uzyskuje się w ten sposób liniową cząsteczkę plazmidu z kohezyjnymi końcami. Najprostsza strategia polega teraz na rozcięciu obcego DNA tym samym enzymem restrykcyjnym. Inna możliwość to użycie różnych enzymów, jednak pod warunkiem, że tworzą one jednakowe końce kohezyjne. Obcy DNA i liniowy plazmid można teraz zmieszać. Kohezyjne końce obcego DNA i liniowego plazmidu odnajdują się, ulegają sparowaniu i następnie zostają kowalencyjnie połączone z użyciem ligazy DNA. Tak uzyskany zrekombinowane DNA plazmidowy zostaje wprowadzony do komórek bakterii będących gospodarzem; w bakteriach tych przez odpowiednie traktowanie solami zwiększa się przepuszczalność błon względem DNA. Pobieranie DNA przez komórki bakteryjne nazywa się transfekcją lub transformacją. Teraz rozmnaża się bakterie, podczas czego zrekombinowane cząsteczki plazmidów wewnątrz komórek bakterii wielokrotnie ulegają replikacji. Do klonowania wygodne jest stosowanie takiego plazmidu który zawiera jeden lub kilka genów oporności na antybiotyki, oraz takiego gospodarza który jest na te antybiotyki wrażliwy. Po transformacji komórki hoduje się w obecności antybiotyków. W tych warunkach oporne na antybiotyk są tylko te komórki, które zawierają plazmid (jedynie takie mogą rosnąć). Jeśli komórki posieje się na płytce agarowej każda z nich rozmnoży się i utworzy kolonię w której wszystkie komórki zawierają ten sam plazmid, z tym samym fragmentem obcego DNA. Pozostaje teraz zadanie zidentyfikowania tej szczególnej koloni bakteryjnej.

69. Polimerazowa reakca łańcuchowa (PCR).

PCR (łańcuchowa reakcja polimeryzacji) jest metodą niezwykle prostą i bardzo skuteczną. Umożliwia ona wielokrotne powielenie dowolnej sekwencji DNA pod warunkiem, że znane są sekwencje krótkich odcinków DNA po każdej stronie sekwencji przeznaczonej do powielenia. Mieszanina reakcyjna do PCR zawiera docelowy (przeznaczony do powielenia) dwuniciowy DNA, dwa startery, które hybrydyzują z sekwencjami oskrzydlającymi znajdującymi się na przeciwnych końcach docelowego DNA, wszystkie cztery trifosforany deoksyrybonukleozydów oraz polimerazę DNA. Ponieważ mieszanina reakcyjna jest cyklicznie ogrzewana do wysokiej temperatury, PCR wymaga użycia polimerazy DNA odpornej na ciepło.

PCR obejmuje trzy etapy:

• Denaturacja. Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do temperatury 95⁰C i utrzymuje się w tej temperaturze przez 15-30 s w celu denaturowania DNA do pojedynczych nici, służących następnie jako matryce do syntezy DNA.

• Wiązanie (hybrydyzacja) starterów. Mieszaninę szybko chłodzi się do określonej temperatury, w której startery mogą utworzyć dwuniciowe struktury hybrydowe na końcu każdej nici DNA. Temperaturę wiązania (hybrydyzacji) starterów należy starannie obliczyć, tak aby zapewnić ich związanie tylko z sekwencjami oskrzydlającymi odcinek powielany. Każdy ze starterów wiąże się tylko z jedna nicią wyjściowego DNA.

• Elongacja. Temperaturę mieszaniny podwyższa się do 72⁰C (zwykle) i utrzymuje przez zadany okres, by umożliwić polimerazie DNA kopiowanie każdej jednoniciowe matrycy przez wydłużanie każdego ze starterów. Pod koniec inkubacji obydwie jednoniciowe matryce stają się częściowo dwuniciowymi cząsteczkami DNA. Każda z nowo zsyntetyzowanych nici może mieć inną długość.

Wymienione trzy etapy cyklu PCR są powtarzane.

Reakcje te przeprowadza się z wykorzystaniem automatycznych urządzeń- termocyklerów.

PCR ma ogromne znaczenie dla biologii molekularnej i znajduje liczne zastosowania w takich dziedzinach jak klonowanie DNA, sekwencjonowanie, wprowadzanie specyficznych mutacji, diagnostyka medyczna oraz medycyna sądowa.

1

Strona 211

Strona 210

1  245

16  245

1 15

149  245

16  146

1 13

Uszkodzenie naczynia krwionośnego

Uszkodzone ściany naczynia i płytki krwi

uwalniają substancje, które aktywują czynniki

biorące udział w procesie krzepnięcia krwi

Płytki przywierają do włókien kolagenowych w uszkodzonej ścianie naczynia krwionośnego

Skurcz ścian naczynia

Zmniejszony upływ krwi z uszkodzonego naczynia

Czop płytkowy

Seria reakcji z udziałem czynników odpowiedzialnych za proces krzepnięcia krwi

Aktywator protrombiny

Aktywator protrombiny, Ca²⁺

Trombina

Protrombina

Trombina, Ca²⁺

Włókna fibrynowe

(fibryna)

Fibrynogen

Skrzep

Czerwone krwinki wplątane w sieć

włókien fibrynowych wzmacniają konstrukcję skrzepu

---