1. MIKROSKOPIA ŚWIETLNA I POMIARY KOMÓREK.

Zasady prawidłowego oświetlenia wg. Kohlera:

• kolektor lampy odtwarza obraz źródła światła w płaszczyźnie przesłony tęczówkowej kondensora

• przesłona tęczówkowa lampy reguluje szerokość wychodzącej wiązki światła

• przesłona kondensora reguluje jasność obrazu

• średnica świetlnego pola musi być dostosowana do pola widzenia okularu

Granice rozdzielczości:

Oko - 0,2 mm (200nm)

Świetlny- 200 nm

Elektronowy- 0,2 nm

Zdolność rozdzielcza: wzór:.....

>> określana w jednostkach dł. Jako najmniejsza odległość dwóch struktur dających się odróżnić w obrazie mikroskopu jako 2 oddzielne struktury (punkty)

>> zdolność ta jest zależna od apertury numerycznej obiektywu>> im jest wyższa tym większa jest zdolność rozdzielcza i siła światła

>> graniczna wartość zdolności rozdzielczej zależna jest od długości używanej do badania fali świetlnej i wynosi 0,2 nm

>> dla światła niebieskiego (dł. Fali 0,5 nm) granica zdolności rozdzielczej wynosi 0,17 nm, a dla ultrafioletu (dł. Fali 0,275 nm) około 0,08 nm.

Zdolność rozpoznawcza

>> graniczna szerokość przedmiotu dostrzeganego jeszcze w mikroskopie

Budowa mikroskopu świetlnego

Części optyczne: okulary, kondensor, obiektywy, urządzenie oświetlające

Części mechaniczne: tubus, rewolwer, stolik, makro i mikro śruby, statyw

OKULARY:

• odwraca, powiększa, daje obraz urojony

• przekazują w powiększeniu do oka obraz pośredni preparatu

• korygują szczątkowe aberracje

• umożliwia prowadzenie pomiarów

• składają się z przynajmniej dwóch soczewek płaskowklęsłych, które są zwrócone powierzchnią płaską ku górze

• obie soczewki sa umieszczone w odległości równej połowie sumy ich długości ogniskowych

• soczewka oczna (górna) powiększa obraz, zbierająca (dolna) zmniejsza obraz rzeczywisty i czyni go bardziej wyraźnym

OBIEKTYWY:

• składają się z kilku ściśle połączonych ze sobą soczewek

• obraz jest powiększony, odwrócony i rzeczywisty

• cechy wygrawerowane na obudowie>> apertura numeryczna i skala powiększenia

Obiektywy suche>> między dolną soczewką a preparatem znajduje się powietrze

Obiektywy imersyjne>> między dolną soczewką a preparatem znajduje się płyn

HJ - czarny pierścień - olejek imersyjny

Glyc - czerwony pierścień - imersja glicerynowa

WJ - biały pierścień - imersja wodna

Rodzaje korekcji aberracji:

• Achromaty >> w jednym ognisku łączą się promienie światła czerwonego i niebieskiego... zielonego... filtr żółty

• Apochromaty>> promienie światła czerwonego, niebiesko-zielonego, niebiesko-fioletowego

• Plan>> niwelują także tzw. Wypukłość obrazu

KONDENSOR:

• służy do skupiania promieni świetlnych

• jest to ruchomy , specjalny układ soczewek oprawionych w metalowy pierścień i umieszczonych pod stolikiem

• daje on bardzo zbieżną wiązkę światła i eliminuj prawie całkowicie promienie rozbieżne

• w celu ograniczenia dopływu światła stosuje się przesłony- blendy umieszczone nad źródłem światła

• przy mniejszym powiększeniu obniżony przy wyższych podniesiony pod stolik> bardziej skupiona wiązka światła

URZĄDZENIE OŚWIETLAJĄCE:

• oświetlacz halogenowy o mocy 20 W z regulacją natężenia światła

Typy oświetlenia:

• ośw. Jasnego pola

• ośw. Ciemnego pola

• >>> w obrębie tych typów >>> oświetlenie padające i ośw. Przechodzące

Jasne pole przy świetle przechodzącym:

• najczęściej stosowany w badaniach

• wiązka światła biegnąca od źródła światła zostaje odbita przez zwierciadło mikroskopu do kondensora>> przechodzi przez preparat>> obiektyw>> okulary>> do oka

• obraz powstaje dzięki przezroczystości preparatu, który absorbuje część światła

Ciemne pole:

• różnica w kondensorze, który w szczególny sposób oświetla badany obiekt

• do obiektywu wpadają wyłącznie promienie ugięte na strukturach obiektu, a nieugięte są eliminowane

• struktury rozpraszające światło są widoczne jako jasno świecące struktury na ciemnym tle

Mikroskop fluorescencyjny:

• modyfikacja mikroskopu świetlnego

• preparaty sporządzane przy użyciu odczynników dających efekt fluorescencji >> przeciwciała znakowane znacznikami fluorescencyjnymi np. FITC , TRITC

• preparat oświetlany jest światłem pobudzającym fluorescencję

• światło emitowane przez znacznik jest zawsze o większej długości fali

• światło pobudzone jest absorbowane przez odpowiedni filtr

• obraz nieostry bo jest KONWOLUCJA >> nakładanie się promieni pochodzących z ugięcia na strukturach leżących w warstwach niżej lub wyżej niż płaszczyzna ostrego widzenia na obraz leżący w płaszczyźnie ostrego widzenia

Mikroskop konfokalny:

• promień laserowy skanuje badany obiekt uginając się na jego strukturach

• skanowanie sterowane jest przez układ ruchomych luster

• promienie świetlne biegną do fotopowielacza

• przed nim znajduje się przesłona, która filtruje promienie światła wychodzące z innych płaszczyzn badanego obiektu niż płaszczyzna ostrego widzenia

• informacje dotyczące poszczególnych punktów obrazu przekazywane są do komputera

• program komputerowy pozwala na odtworzenie trójwymiarowej struktury obiektu

• obraz ostry dzięki DEKONWOLUCJI

POMIARY

Mikrometr okularowy - okular z podziałką, w którym wyznaczono absolutną wartość (tzw. Wartość mikrometryczną) w jednostkach długości odstępu dwóch kolejnych kresek w podziałce dla danego obiektywu w mikroskopie. >>>odległości między kreskami nie są wykalibrowane /wyskalowane

Mikrometr przedmiotowy - szkiełko przedmiotowe, na którym wyryta jest podziałka. Odległość między dwiema kolejnymi kreskami (najmniejszymi) podziałki wynosi 10 nm.

Wyznaczanie wartości mikrometrycznej = kalibracja

• umieścić mikrometr przedmiotowy na stoliku i nastawić ostrość na podziałkę

• obraz podziałki podobnie jak obraz innych przedmiotów powstaje w płaszczyźnie przesłony okularu

• w okularze pomiarowym w płaszczyźnie przesłony okularu umieszczona jest podziałka

• patrząc w okular widoczne są obie podziałki

• ustalić liczbę kresek mikrometru przedmiotowego i okularowego dokładnie się pokrywajęcych

WM = 10 nm. X liczba podziałek (kresek) mikrometru przedmiotowego

Liczba podziałek (kresek) mikrometru okularowego

[nm]

Rzeczywista wielkość struktury

W. rzeczyw. = ilość podziałek x wartość mikrometryczna [nm]

• Detekcja białek metodą immunocytochemiczną:

• utrwalenie mikrotubul

• przerwać ciągłość błony kom.

• wprowadzić znaczniki za pomocą przeciwciał

• naświetlanie preparatu

• emisja światła o wyższej długośći fali

• obrazy nie do końca ostre >> konwolucja.

2. TECHNIKI I METODY STOSOWANE W BK

Mikroskop świetlny (pow. X 400) - barwienie hematoksyliną i eozyną

HEMATOKSYLINA - niebieski barwnik o charakterze zasadowym służący do wybarwiania kwasowych (bazowfilnych) struktur komórek np. jądra komórkowe >>> produkt bezbarwny pod wpływem utleniania zamienia się w barwną hemateinę

• hematoksylina żelazista - bejcowanie solami żelaza> hematoksylina łączy się z tymi strukturami które mają jony Fe 3+

• hematoksylina Ehrlicha - barwienie w punkcie końcowym (ałun potasu)

EOZYNA - różowy barwnik o charakterze kwasowym służący do wybarwiania zasadowych (acidofilnych ) struktur np. cytoplazmy >>> słaby kwas z 4 cząsteczkami bromu reaguje na aniony

Barwniki fluorescencyjne>> w mikroskopie fluorescencyjnym

• fluoresceina (na zielono) >> mikrotubule

• rodamina (na czerwono) >> centromery

• DAPI (na niebiesko) >> DNA i chromosomy

TEM - mikroskop transmisyjny elektronowy >>> wiązka elektronowa>> ogniskowane przez cewki magnetyczne >> zatopić w żywicy>> pociąć na skrawki

SEM - mikroskop skaningowy elektronowy>>> materiał pokrywamy cienką warstwą metalu ciężkiego>> skanowanie >cewki elektromagnetyczne

AUTORADIOGRAFIA - metoda pozwalająca wykryć w komórce lub tkance związek radioaktywny przy użyciu emulsji światłoczułej

Służy do:

• lokalizacji miejsca syntezy danego związku radioaktywnego>> czasu jego trwania>> drogi transportu

1. wprowadzenie prekursora

2. preparat na szkiełko

3. zanurzenie w roztworze emulsji światłoczułej >wytworzy się cienka błona światłoczuła reagująca na promieniowanie izotopu jak klisza fotograficzna

4. znakowanie nad preparatem >> można zabarwić inne elementy innym barwnikiem

>> synteza DNA - o tym świadczą kropki nad preparatem na błonie światłoczułaj

poziom szkiełka>> preparat z prekursorem>> emulsja światłoczuła>> ziarna srebra (czarne)

* jeśli seria preparatów z tymidyną - to znakowanie nad jądrem... jeśli użyty prekursor aminokwasów - to lokalizacja w cytoplazmie i droga ścieżką wydzielniczą

RNA - 3H - urydyna

DNA- 3H - tymidyna

DNA i RNA - 3H - cytydyna

Preparatyka:

• wprowadzenie izotopu za pomocą iniekcji lub inkubacji do żywego organizmu

• wykonanie preparatu i pozostawienie go na czas ekspozycji w ciemności

• wywołanie preparatu >> znakowanie występuje nad preparatem

Metody immunocytochemiczne = immunodetekcja

• wykorzystują one metody wiązania antygenu do przeciwciała>> produkowane przez limfocyty>> wiążą ściśle określony antygen>> składają się z 2 łańcuchów lekkich i 2 ciężkich >> mają zatem 2 miejsca wiązania antygenu

Odp. POLIKLONALNA - 1 antygen - kilka klonów limfocytów B

Odp. MONOKLONALNA - 1 antygen - klon limfocytów B

* przeciwciało > 1 antygen 1antygen>wiele przeciwciał

Klasy przeciwciał : IgA, IgD, IgE, IgG, (<<najczęściej stosowany) IgM (podział na podstawie różnicy budowie łańcuchów ciężkich)

PRZYGOTOWANIE PREPARATU:

1. Utrwalanie - zachować strukturę komórki; utrwalenie antygenu w niezmienionym miejscu i stanie pozwala na rozpoznanie go przez przeciwciało>> utrwalacze: aldehydy, alkohole, aceton, kwasy, zw. Metali ciężkich > dostosowane do trwałości badanych struktur

2. Zatapianie - przesycanie substancją utwardzającą; pozwala na krojenie materiału

Parafina>> m. Świetlny >> oziębiamy

Żywica>> m. Elektronowy>> podgrzewamy > by utwardzić

3. Krojenie- za pomocą mikrotomu, ultramikrotomu, kriostatu

4. Nakładanie na szkiełko >> podstawowe (MŚ) lub siatkę (ME)

5. Barwienie i kontrastowanie

Metody wykrywania antygenu:

• bezpośrednia >> przeciwciała swoiste dla danego antygenu są wyznakowane

• pośrednia >> stosuje się przeciwciała swoiste I (niewyznakowane) >> tworzy się kompleks: przeciwciało I - antygen; a następnie przeciwciało II (wyznakowane) skierowane przeciwko przeciwciału I

Markery:

Fluorochromy - substancje wykazujące zdolność emitowania światła po pobudzeniu ich źródłem promieniotwórczym >> immunofluorescencja

Metale ciężkie- (złoto, kolorowe) - widoczne w mikroskopie elektronowym w postaci wyraźnych czarnych ziarenek

Enzymy - (peroksydaza, alkaliczna fosfataza) - ich lokalizacja uwidacznia się prowadząc dodatkową reakcję enzymatyczną

Znakowanie pośrednie: biotyna, awidyna, streptawidyna

Kompleks ABC - Avidin Biotynylated peroxidase Complex

HYBRYDYZACJA IN SITU

• umożliwia wykrywanie specyficznych sekwencji kwasów nukleinowych w komórkach lub fragmentach tkanek za pomocą sond molekularnych

Sondy molekularne >> jednoniciowe odcinki kwasów nukleinowych o znanej sekwencji komplementarnej; pozwalające zlokalizować sekwencje zajmujące położenie w komórce lun w części chromosomu

Etapy:

1. denaturacja DNA - musi być w formie jednoniciowej by przyłączyć sondę

2. roztwór z sondą + marker

3. hybrydyzacja - sekwencje łączą się komplementarnie

4. obmycie nadmiaru reagentów

5. detekcja sondy - świecenie sekwencji np. w obrębie chromosomu

• w mikroskopie świetlnym stosujemy enzymy

• w mikroskopie fluorescencyjnym stosujemy - FISH

FISH - (fluorescent in situ hybrytysation) >> polega na zastosowaniu znakowanych fluorescencyjnie sond molekularnych komplementarnych do określonych genów lub specyficznych la określonych regionów chromosomów (centromery, telomery)

BARWIENIE CYTOCHEMICZNE

METACHROMAZJA - polega na selektywnym barwieniu struktur tkankowy na kolor inny niż kolor samego barwnika >>> barwa zależy od stopnia polimeryzacji cząsteczek barwnika (dimery łączą się chętniej z RNA - kolor fioletowy)

Barwniki metachromatyczne: błękit toluidynowy , azur B, tionina, toluidyna

• pochłaniają światło o innej długości w formie monomeru a inne w formie dimeru, inne w postaci polimerów

• zależy to od: rozcieńczenia roztworu, PH i temperatury>>> ważne jest zachowanie warunków reakcji dla jej specyficzności

REAKCJA FLEUGENA- jest to swoista reakcja dla kwasu DNA i polega na poddaniu tkanek łagodnej kwaśnej hydrolizie za pomocą kwasu solnego (HCL)>> hydroliza ta uwalnia grupy aldehydowe deoksyrybozy> po przeprowadzeniu hydrolizy preparat umieszcza się w odczynniku Schiffa (leukofuksyna) który reaguje z uwolnionymi grupami aldehydowymi> tworzy purpurowy barwnik wyłącznie w chromatynie jądrowej

REAKCJA PAS - reakcja wykrywająca w preparatach histochemicznych: monosacharydy, polisacharydy, mukopolisacharydy >>> dzięki zastosowaniu kwasu nadjodowego i odczynnika Schiffa

(mieszanina barwników)

METODA UNNY:

• zieleń metylowa i pyronina

• Zieleń metylowa > barwi wybiórczo jądra i chromosomy na kolor zielony (DNA)

• Pyronina > barwi cytoplazmę i jąderka na kolor różowy (RNA)

Terminy:

Barwienie progresywne - proces trwa aż do wysycenia barwnika w tkance

Barwienie regresywne- przebarwiamy preparat a później pozbywamy się części barwnika

Barwienie w punkcie wyjściowym- barwienie tylko pewnych struktur np. przy odpowienim ph

Impregnacja - impregnujemy np. solami metali

Barwienie bezpośrednie- barwimy prostym barwnikiem

Barwienie pośrednie- wstępna procedura przed barwieniem która uwalnia pewne grupy chemiczne, które będą reagowały z barwnikiem

Bejcowanie > kwasy , zaprawianie>ałuny

* barwienie proste - 1 barwnik złożone - kilka barwników

SAFRANINA I ZIELEŃ TRWAŁA (najczęstsze barwienie złożone)

• dobra do barwienia chromosomów, ścian kom. jąderka

• SAFRANINA - jest barwnikiem zasadowym i łączu się z kwaśnymi elementami (chromatyna) oraz ze zdrewniałymi warstwami komórek >> na czerwono ściany kom. ksylemu (lignina) oraz jądro komórkowe (chromatyna)

• ZIELEŃ TRWAŁA- cytoplazma i struktury błonowe na zielono

• Stosujemy b. Regresywne>stężona safranina i płuczemy>elementy kwaśne będą silniej zabarwione

FLUOROCHROMY- naświetlane promieniami emitują światło o określonej długości - np. DAPI łączy się specyficznie z DNA - świecąc na kolor niebieski wyznacza DNA

FALLOIDYNA - z muchomora ; łączy się z cytoszkieletem >> z mikrofilamentami aktynowymi - łączy się do włókien aktyny >> sama falloidyna nie jest fluorochromem ale w połączeniu z fluorochromem daje fluorescencję

3. REAKCJA FEULGENA I CYKL KOMÓRKOWY

• służy do wykrywania DNA

• pozwala na specyficzne wykazania (w reakcji barwnej) obecności DNA w chromatynie jąder interfazowych i w chromosomach zarówno w komórkach roślinnych i zwierzęcych

• nie trzeba ciąć na skrawki

• jedyna specyficzna metoda !!! (np. metoda Unny niespecyficzna-zieleń ma pownowactwo do DNA)

• jest to metoda ilościowa i jakościowa >> mierzenie ilości DNA w cyklu komórkowym >> RNA się nie barwi, bo jest wypłukiwane w czasie hydrolicy

2 etapy:

1 - hydroliza - w zależności od temp. Odpowiednia molalność kwasu > temp. Pokojowa 5m. Kwas solny > powoduje odszczepienie zasad purynowych i pirymidynowych przy węglu C1 >> hydroliza Feulgenowska - hydroliza wiązania n-glikozydowego przy węglu C1 deoksyrybozy w DNA

>> hydroliza nie może zajść za daleko>> stop zanim zaczną być usuwane histony

>powstaje apurynowe DNA a później odczepiają się zasady pirymidynowe

• hydroliza kwaśna (HCL, kwas cytrynowy lub octowy)>> by uwolnić grupy aldehydowe z deoksyrybozy

• połączenie grup aldehydowych z odczynnikiem Schiffa > kompleks ten ma barwę czerwono-fioletową

• HCl>> rozpuszcza pektyny, które są w blaszce środkowej (w kom. roślinnych) dzięki czemu łatwo uzyskać rozmaz

2 - reakcja grup aldehydowych z odczynnikiem Schiffa

• produkt o barwie czerwonofioletowej>> leukofuksyna łączy się i odtwarza się pierścień chinonowy > po przedłużeniu hydrolizy kwas apurynowy wypełznie do cytoplazmy

• Odczynnik Schiffa - otrzymuje się z fuksyny poprzez redukcje w ciemności >> sulfonowa pochodna barwnika- fuksyny zasadowej lub pararozanieliny>> w stanie podstawowym ma kolor czerwony >> redukujemy fuksynę >> bezbarwna to odczynnik Schiffa>> środowisko uwalnia grupy aldehydowe które łączą się z odczynnikiem >> za barwę odpowiedzialne są wiązania sprzężone >> pierścień chinonowy

Fuksyna>> roztwór wodny, przy dostępie tlenu barwna>> po zredukowaniu jest bezbarwna (leukofuksyna = odczynnik Schiffa) Barwna dzięki pierścieniowi chinonowemu

Leukofuksyna>> przechowujemy w ciemności bez dostępu tlenu

• Produkt reakcji Feulgena>> powstały kompleks pomiędzy DNA a leukofuksyną jest barwny, ponieważ odtwarza się w nim pierścień chinonowy

Preparat z korzenia cebuli.

1. spłukać korzenie HCl

2. przeprowadzić hydrolizę w 5 M HCl -25 min

3. kondycjonowanie- oswoić materiał

4. odpłukać wodą destylowaną

5. przenieść do leukofuksyny - 45 min. W ciemności

6. przenieść korzenie na szkiełka podstawowe z wodą - preparat gnieciony- rozmazowy

Ważne !!!

• eksperymentalne ustalenie optymalnego czasu hydrolizy

• dobre przygotowanie odczynnika Schiffa (musi być bezbarwny);łatwo się utlenia

• eksperymentalne ustalenie optymalnego czasu reakcji z odczynnikiem Schiffa

• >> czas utlenienia>> gdy zbyt długi będą się uwalniały grupy z lipidów i będą się barwić błony

• w roślinnym materiale pracujemy tylko na skrawkach>> kwas nie penetruje organów

• u zwierząt kwas penetruje błonę

• * do diagnostyki chorób układu immunologicznego - choroby szpiku

CYKL KOMÓRKOWY

• ściśle określona sekwencja etapów, przez które przechodzi komórka od chwili powstania do zakończenia podziału

Cykl mitotyczny - zespół procesów molekularnych i zmian strukturalnych w komórce rodzicielskiej, zachodzących w ściśle określonej kolejności i kierunku, których skutkiem jest precyzyjne podwojenie i rozdział materiału genetycznego między 2 komórki potomne >>Składa się z faz : G1, G2, M , S (typowe dla wyższych eukariotów ) u niższych może brakować G1 lub G2 ale nigdy obu na raz

Kategorie losów komórek w organizmach roślin i zwierząt

1. komórki rozmnażają się ; o charakterze embrionalnym, merystematycznym, macierzyste

2. komórki przejściowo spoczynkowe, zdolne do ponownych podziałów (G0/G1) np. zarodki w spoczynkowych nasionach

3. komórki róznicowane, ale zdolne do odóżnicowania i ponownych podziałów (większość typów komórek roślinnych)

4. komórki zróżnicowane ostatecznie, niezdolne do ponownych podziałów (nerwowe, mięśniowe)

5. komórki eliminowane na drodze genetycznie zaprogramowanej śmierci= apoptozy

Cykl mitotyczny:

G1 - faza wzrostu>> intensywny metabolizm komórkowy>> przygotowanie chromatyny do replikacji (ORC, RLF) >> przedreplikacyjna naprawa DNA

S - faza syntezy DNA >> jednorazowa replikacja DNA >> synteza histonów

G2 - faza wzrostu >> intensywny metabolizm>> synteza białek wrzeciona mitotycznego >> naprawa zreplikowanego DNA

M - mitoza

• przejście z jednej fazy cyklu do drugiej odbywa się wyłącznie po ukończeniu fazy poprzedzającej > umożliwia to mechanizm związany z działaniem kontrolującym prawidłowy przebieg każdej fazy cyklu przez odpowiednie białka regulatorowe > szczególną role pełnią tzw. Przełączniki molekularne

• przebieg cyklu mitotycznego jest jednokierunkowy >> umożliwia do mechanizm związany z precyzyjnie kontrolowaną hydrolizą, która sukcesywnie eliminuje białka regulatorowe z poprzednich faz cyklu ( ubikwitynacja białek, a następnie hydroliza w proteasomach)

PUNKTY KONTROLNE CYKLU MITOTYCZNEGO (CHECK POINTS)

• Do punktów kontrolnych należy kontrola i regulacja przejść komórki do kolejnych faz cyklu dopiero po pomyślnym ukończeniu fazy poprzedzającej.

• Punkt kontrolny późnej fazy G1 kontroluje przejście G1/S >> zwany punktem restrykcyjnym, po którym następuje START >> decyduje on o wejściu komórki do cyklu mitotycznego i o rozpoczęciu syntezy DNA

• Punkt kontrolny późnej fazy G2 kontroluje przejście G2/M >> decyduje on o wejściu komórki do fazy mitozy

• MPF - Punkt kontrolny wrzeciona podziałowego - kontroluj przejście metafaza/ anafaza >> decyduje on o precyzyjnym i jednorazowym rozdziale chromatyd siostrzanych (chromosomów potomnych) do dwóch przeciwległych biegunów kom.

• Punkt kontrolny późnej telofazy - kontroluje wyjście z mitozy tj. przejście telofaza/G1

>> przejście przez punkty kontrolne jest aktywowane dzięki aktywacji przełączników molekularnych >>przełącznik molekularny to kompleks złożony z dwóch komponentów białkowych którymi są :

KINAZA ZALEŻNA OD CYKLIN (CDK= CYCLIN DEPENDENT KINASE) I CYKLINA !!!!

KINAZY - są enzymami fosforylującymi inne białka >> kinazy cyklinozależne bez połączenia z cyklinami nie działają

CYKLINY- regulują aktywność enzymatyczną kinaz

!!! przełączniki molekularne w poszczególnych fazach cyklu są kompleksami różnych CDK i różnych cyklin.

• poziom kinaz podczas cyklu jest stały, a cyklin zmienia się cyklicznie. Kinazy nie są aktywne, bez połączenia z cykliną.

• Cykl mitotyczny jest jednokierunkowy >> jest to skutkiem hydrolizy, a tym samym wyeliminowania tych białek regulatorowych (np. cyklin), które są specyficzne dla poprzedniej fazy

• Białka przeznaczone do hydrolizy zostają wyznakowane cząsteczkami ubikwityny „kiss of death”

• Proteoliza ubikwitynowanych białek odbywa się w proteasomach

• APC - anaphase promoting complex >> działa od G2 przez mitozę do G1

• SCF - działa od połowy G1 przez S do G2

FAZA G1

• wzrost komórki

• synteza cyklin D i E

• uzyskiwanie „licencji” chromatyny na replikację ( ładowanie na DNA kompleksów ORC i RLF oraz kohezyny)

• kontrola i naprawa uszkodzeń DNA (białko p53 i p21)

• fosforylacja białka RB przez CDK 4/6 /cyklina D (punkt restrykcyjny)

• uwolnienie czynnika transkrypcyjnego E2F

• „przygotowanie” chromatyny do replikacji

• w fazie G1 chromosom stanowi pojedynczą cząsteczkę DNA, na którą ładowane są następujące białka zanim rozpocznie się replikacja w fazie S

• KOHEZYNA - białko to zapewnia utrzymanie „obok siebie” wyjściowej i potomnej cząsteczki DNA podczas replikacji w fazie S poprzez fazę G2 aż do mitozy>>> w fazie G2 każdy chromosom składa się z 2 chromatyd siostrzanych, które na całej długości są „pozpinane” pierścieniami kohezyny

• M (MCM 2-7) - białka te są usuwane natychmiast po zreplikowaniu danego odcinka DNA, co wyklucza ponowną rundę replikacyjną tego samego odcinka w tym samym cyklu

FAZA S

• jednorazowa replikacja DNA

• synteza białek histonowych

• usuwanie kompleksów RLF po jednej rundzie replikacji

* Blokada inicjacji fazy S przez p 53 >> połączenie białka inhibitorowego p21 z kompleksem cyklina D/CDK4, CDK6 blokuje aktywację tego kompleksu a więc blokuję fosforylację białka Rba w konsekwencji rozpoczęcie replikacji DNA

FAZA G2

• faza wzrostu kom. - aktywacja metabolizmu

• synteza cykliny B

• proteoliza w proteasomach białek regulatorowych fazy G1

• synteza białek aparatu mitotycznego (tubuliny)

• kontrola prawidłowości zreplikowanego DNA (p53 i p21)

• aktywacja kompleksu CDK1/cyklina B (MPF) przez CDC25 fosfatazę

• „przygotowywanie” chromatyny do replkacji>> łądowanie białek ORC i RLF na DNA

• wejście do fazy M

ORC - wyznaczają początek replikonu>> są ładowane podczas G1>> zostaje połączone z DNA do końca cyklu mitotycznego

RLF - umożliwiają rozpoczęcie i trwanie replikacji> są ładowane podczas G1 a usuwane z DNA podczas fazy S po jednorazowej replikacji DNA.

FAZA M

• powstanie dwubiegunowego wrzeciona mitotycznego

• kondensacja i ruchy chromosomów mitotycznych zależnie od MT

• rozproszenie i ponowne odtworzenie otoczki jądrowej

• inaktywacja MPF (Metafaza/Anafaza) i ubikwitynacja i degradacja w proteasomach sekuryny, cykliny A

• ubikwitynacja i degradacja cykliny B i wyjście z mitozy

!!!! rośliny nie mają cykliny E

MPF = MITOSIS PROMOTING FACTOR = CDK1 + CYKLINA B

Synonimy CDK1

• p34

• cdc2 -ponieważ jest kodowana przez gen cdc2- to jeden z najstarszych i szczególnie konserwatywnych genów; prawie nie zmieniony od 500 mln lat

• cyklina B - jest kodowana przez cdc13 -reguluje aktywność kinazy cyklinozaleźnej cdc2

CHARAKTERYSTYKA MPF

• CDK1 - składnik enzymatyczny dimeru (fosforyluje inne białka enzymatyczne, strukturalne, regulatorowe)

• MPF jest aktywny od wczesnej profazy do metafazy

• Aktywny MPF fosforyluje białka strukturalne :

>> histony (H3) - skutkiem jest kondensacja chromosomów od profazy do metafazy

>> laminy blaszki jądrowej - skutkiem jest fragmentacja otoczki jądrowej w profazie

>> białka MAP - skutkiem wzrostu dynamiki MT i powstania dwubiegunowego wrzeciona mit.

>> nukleoliny - skutkiem jest rozproszenie jąderka w profazie

• MPF jest inaktywowany przy przejściu Metafaza/ Anafaze >> w telofazie rozpad MPF po proteolizie cykliny B>> w anafazie degradacja cykliny B

4. STRUKTURA JĄDRA INTERFAZOWEGO

• oddzielenie transkrypcji od translacji

• umozliwia posttranskrypcyjne dojrzewanie RNA

elementy jądra : otoczka jądrowa, blaszka jądrowa z jądrowymi kompleksami porowymi (JKP), matrix jądrowa, chromatyna, jąderko

euchromatyna (słabo upakowana) heterochromatyna (bardzo upakowana)

jąderko - tu znajduje się DNA z którego ma powstać RNA

OTOCZKA JĄDROWA:

• z 2 błon asymetrycznych > między nimi przestrzeń perinuklearna

• błona zewnętrzna >> zapewnia ciągłość z ER; rybosomy

• błona wewnętrzna >> obecność białek wiążących laminy (LAP 1 (A,B,C) , LAP 2)

• białka transbłonowe - gp 210 i POM 121 - łączą obydwie błony

• * za rozpad otoczki jądrowej sa odpowiedzialne ufosforylowane laminy- gdy są zdefosforylowane to otoczka odbudowuje się

• laminA - jego dysfunkcje powoduja dystrofię mięśniową

JKP= NPC - nuclear pore complex

• jądrowe kompleksy porowe (JKP)- zbudowane z nukleoporyn>> w skład JKP wchodzą gp 210 i POM 121>> uczestniczą w inicjacji montażu JKP i zakotwiczają kompleks w błonie

• JKP składa się z 3 pierścieni>>> cytoplazmatyczny - leży w płaszczyźnie zewnętrznej błony>> centralny - połączony z 8 szprychami pomiędzy którymi powstają kanały peryferyczne>> jądrowy - leży w płaszczyźnie wewnętrznej błony

• Kanały peryferyczne transportują jony i małe cząsteczki biernie dyfundują

* transport do jądra: histony, b. Rybosomowe, czynniki transkrypcyjne, czynniki uczestniczące w dojrzewaniu RNA >>>>>>>> transport z jądra do cytoplazmy: podjednostki rybosomowe, mRNA, tRNA, czynniki transkrypcyjne

NLS i NES - sekwencje sygnałowe nieodcinane przez proteazy, co pozwala na wielokrotny transport

MATRIX JĄDROWA:

• nadaje kształt jądru

• organizuje wewnątrzjądrowe domeny chromatyny

• uporządkowanie, ułożenie chromatyny

• podtrzymuje strukturę jąderka

CHROMATYNA

• interfazowa postać chromosomów, złożona z DNA białek histonowych i niehistonowych

• sekwencje kodujące to : tandemowe i rozproszone

• sekwencje niekodujące to: telomerowe, powtarzalne

• histony : H1, H2A, H2B - arginina

• H3, H4- arginina i lizyna

Modyfikacje posttranslacyjne histonów:

1. acetylacja- Lys, odwracalna, następuje podczas replikacji i transkrypcji, ułatwia związanie polimeraz>> aktywność transkrypcyjna

2. fosforylacja - Ser, Thre, odwracalna, zmiany w ufosforylowaniu histonów towarzyszą zjawiskom fazy M

3. metylacja- Lys, Arg- nieodwracalna, neutralizują dodatnie odcinki aminokwasów

stopnie upakowania chromatyny : helisa DNA> nukleosom> włókno nukleosomowe> solenoid> chromatyda> chromosom

Euchromatyna:

• luźno upakowana

• zawiera sekwencje transkrybowane

• sekwencje unikalne

• replikacja podczas całej fazy S

• wzrost acetylacji histonów

• spadek metylacji histonu H3

Heterochromatyna

• sekwencje powtarzalne

• mocno upakowana

• obszary centromerowe, telomerowe, bogata w sekwencje niekodujące

• replikowana w późnej fazie S

• wzrost metylacji histonu H3 - blokada transkrypcji

• >> konstytutywna - nigdy nie jest aktywna transkrypcyjnie

• >> fakultatywna - nieaktywna w niektórych, nie wszystkich cyklach komórkowych lub grupach komórek, jej aktywność genetyczna została fizjologicznie stłumiona- np. kondensacja chromosomu X

JĄDERKO

• struktura labilna; mogą zanikać i powstawać; może być ich kilka

• FC- centrum fibrylarne - nietranskryboany ; przezierne; - montowanie i rozmontowywanie chromatyny zawierającej rDNA

• DFC - gęsty składnik fibrylarny -transkrypcja i dojrzewanie pre rRNA

• GC - składnik granularny - na peryferycznej części- podjednostki prerybosomowe- decyduje o wielkości jąderka

Białka jąderkowe:

• B23 - białko „niańka”- ochrona pre-rRNA w trakcie transportu (u roślin)

• Nukleolina - ufosforylowana bierze udział w cięciu pre rRna - ułatwia przyłączenie białek regulatorowych i endonukleaz

• Fibrylaryna- dojrzewanie pierwotnych transkryptów

• Sno_RNA -małe jąderkowe RNA niezbędne do prawidłowego sfałdowania pre-rRNA.....

Typy morfologiczne jąder:

Retikularny- dużo DNA; chromatyna w postaci siateczki

Okapowy - typ retikularnego; telomery i centromery na przeciwległych biegunach jądra ; rejon centromerowy zawiera więcej DNA

Retikularny z chromocentrami- heterochromatyna w postaci chromocentrów (słabo wybarwiona); średnia zawartość DNA

Chromocentryczny- najmniej DNA; widoczne tylko chromocentry

• otoczka jądrowa połączona jest z laminą za pomocą białek LAP będących częścią zewn. Otoczki błony jądrowej

• dekondensacja heterochromatyny zachodzi w fazie S kiedy następuje replikacjha DNA

• sekwencje SAR/ MAR > specyficzne niekodujące sekwencje w DNA uczestniczące w połączeniu DNA chromatyny z białkami matrix >> więcej ich w heterochromatynie niż w euchromatynie; są mało zmienne; dzielą się na strukturalne-związene ciągle z matrix i funkcjonalne -odłączone od matrix na czas transkrypcji

5. CYTOSZKIELET I JEGO FUNKCJE W KOMÓRCE

Funkcje:

• kształt

• transport i rozmieszczenie organelli i makromolekuł

• wewnętrzna organizacja

• zjawiska adhezji komórka- komórka, komórka- macierz zewnątrzkom.

• Ruch

• Skurcz

• Podział

• Fagocytoza

Skład:

• mikrotubule

• filamenty pośrednie

• mikrofilamenty (aktynowe)

MIKROTUBULE

• 25 nm

• heterodimery alfa i beta tubuliny

• utrzymanie kształtu komórki

• rozmieszczenie organelli

• ukierunkowany ruch (transport) wewnątrzkom.

• Ruch komórek (rzęsek, wici)

• Wrzeciono kariokinetyczne

• Wyznaczania bruzdy podziałowej w cytokinezie kom.zwierzęcych i płaszczyzny podziału kom. roślinnych (PPB)

• Wrzeciono cytokinetyczne u roślin (fragmoplast)

• Synteza ściany kom. i przestworów międzykom. W tkankach roślinnych

Polimeryzacja mikrotubul związana jest z GTP !!!

Mikrotubula ma:

• koniec „+” - polimeryzacja- forma GTP

• koniec „-„ - depolimeryzacje - forma GDP

>> na końcu „+” szybciej zachodzi polimeryzacja niż depolimeryzacja, a na końcu „- „ na odwrót

>> mikrotubule zakotwiczone są w MTOC- centrach organizacji mikrotubul ( u zwierząt centrosomy) > gamma tubulina buduje centrosomy

• koniec „-„ związany z centrosomami >> centrosom zazwyczaj znajduje się w okolicy jądra kom.

• mikrotubule nie zawsze powstają jako związane z centrosomem (np. aksony, dendryty, miotuby)>> tu MT nie są związane z centrosomem

W kom. roślinnych mikrotubule tworzą:

• sieć kortykalną- interfaza

• pierścień PPC - profaza

• podział wrzeciona kariokinetycznego

• podział późna profaza- fragmoplast

!!!! z mikrotubulami związane są białka MAP >> białka te mogą wiązać się z końcem „+” mikrotubul uniemożliwiając depolimeryzację>> mogą wiązać się z wolnumi dimerami alfa i beta tubuliny>>mogą wiązać się wzdłuż mikrotubul; tworzyć połączenia z mikrotublami;odcinać fragmenty mikrotubul

Białka motoryczne- związane z transportem wzdłuż mikrotubul

Dyneina >> ruch przebiega w kierunku „-„

Kinezyna >> ruch przebiega w kierunku „+”

ZWIĄZKI ZABURZAJĄCE ORGANIZACJĘ MIKROTUBUL.

KOLCHICYNA - wiążą się z wolnymi heterodimerami tubuliny uniemożliwiając polimeryzację MT>>trwająca depolimeryzacja mikrotubul prowadzi do ich znaiku>> blokuje mitozę

WINKRYSTYNA I WINBLASTYNA - hamują polimeryzację MT>> strącają MT jako bezwładny agregat>> stosowane jako cytostatyki w leczeniu nowotworów

TAKSOL- stabilizuje MT, wiąże MT uniemożliwiając ich rozpad, ale nie przeszkadza dalszej polimeryzacji; hamuje mitozę

D2O - stabilisuje MT

MIKROFILAMENTY - FILAMENTY AKTYNOWE

• ruch komorki

• kurczenie się

• przemieszczanie niektórych organelli

• nadają kształt komórce

• umocowują komórki do innych komorek i błon

• mikrokosmki

• pierścień skurczowy

• posiadają koniec + i -

• polimeryzacja mikrofilamentów jest związana z błoną kom.

Filamenty aktynowe tworzą:

• mikrokosmki

• włókna naprężeniowe

• lamelopodia

• filopodia

• pierścień kurczliwy w czasie podziału kom. zwierząt

Białka związane z aktyną: > białka ABP np. filamina

Białka motoryczne związane z aktyną:

Miozyna I - transport pęcherzyków wzdłuż filamentów aktynowych; możę przesuwać filamenty aktynowe względem siebie

Miozyna II - przesuwanie filamentów w mięśniach, skurcz mięśnia, polarność, cytokineza

>filamenty aktynowe są związane z procesami ruchu komórek

Płytka przylegania- miejsce kontaktu komórki z macierzą zewnątrzkomórkową

Ruch komórki przyczepionej do podłożą np. ameba:

• w przednim biegunie tworzą się lammelopodia i filopodia- dochodzi tu do polimeryzacji tych struktur >>> u ameby brak MT !!!!!

Zwiącki zaburzające organizację filamentów aktynowych:

CYTOCHALAZYNY - wydzielana przez śluzowce hamuje polimeryzację aktyny, wiąże się z końcem + co uniemożliwia przyłączenie kolejnych monomerów aktyny i prowadzi do przewagi procesów depolimeryzachi

FALLOIDYNA- silnie trujący alkaloid wytwarzany przez muchomora sromotnikowego; stabilizuje filamenty aktynowe hamując ich depolimeryzację; wiąże się wzdłuż filamentów zaburzając równomierną depolimeryzację

Białka wasp umożliwiają tworzenie fagosomu

FILAMENTY POŚREDNIE

• trwała włóknista struktura

• pełnią funkcje podporowe

• oddziałują z organellami błoniastymi i białkami

• odporne na działąnie sił mechanicznych

• biorą udział w tworzeniu połączeń międzykom. Oraz połączeń komórka- macierz zewnątrzkomórkowa (desmosomy i hemidesmosomy)

filamenty pośrednie dzielą się na :

• cytoplazmatyczne> keratynowe w nabłonkach; wimentynowe, neurofilamenty

• jądrowe> w jądrze

• wszystkie elementy cytoszkieletu są powiązane ze sobą za pomocą białek

6. MITOZA

• podział pośredni jądra kom. - odbywa się za pośrednictwem chromosomów. W wyniku mitozy podwojony w fazie S materiał genetyczny (chromosomy dwuchromatydowe) zostaje precyzyjnie rozdzielony między 2 kom. potomne ( chromosomy jednochromatydowe)

• kom. wyjściowa przystępuje do mitozy z zawartością 4c DNA, a każda z komórek potomnych zawiera 2c DNA

• rozpoczęcie mitozy, tzn. przejście między fazami 4c>2c / G2/M jest kontrolowane przez MPF (cdk1/ cyklina B)

Przebieg aktywacji MPF

• kinaza 1 (cdk1) jest aktywna dopiero po połączeniu z cykliną B i przy udziale CAK oraz Wee

• MPF jest aktywny od G2/M do Metafaza/ Anafaza

• Aktywna forma MPF fosforyluje m. In. Następujące białka strukturalne:

• histony H3 (ale także H1) co powoduje kondensacje chromosomów

• laminy blaszki jądrowej, co powoduje fragmentację otoczki jądrowej

• białka MAP co powoduję przewagę polimeryzacji mikrotubul nad depolimeryzacją i utworzenie wrzeciona mitotycznego

• nukleolin, co powoduje rozproszenie jąderek

• MPF jest inaktywowany w przejściu Metafaza/Anafaza

>> skutkiem inaktywacji jest defosforylacja następujących białek strukturalnych

• histonów - efekt- dekondensacja chromatyny

• lamin - efekt- odtwarzanie otoczki jądrowej

• białek MAP - rozpad wrzeciona mitotycznego

• nukleolin - efekt odtworzenie jąderek

Rozpad kompleksu MPF ma miejsce w późnej anafazie. Jest skutkiem proteolizy cykliny B (ubikwitynacja; ligaza APC/ cdc20 , proteasom)

!!!! Degradacja cykliny B jest koniecznym warunkiem wyjścia komórki z mitozy do fazy G1

Centrum organizacji mikrotubul MTOC w kom. zwierzęcej jest centrosom.

W komórkach roślinnych centrum organizacji MT wrzeciona mitotycznego jest otoczka jądrowa

Kom. zwierzęca- wrzeciono typu astralnego

Kom. roślinna - wrzeciono typu anastralnego

Interstrefa identyczna w kom. zwierzęcej i roślinnnej>> składa się z dwóch połówek> każdy biegun tworzy własny zespół MT

>>> strefa zachodzenia mikrotubul aż do metafazy stabilizują białka sieciowe - kinezyny> aktywowane w przejściu met/ana

3 rodzaje mikrotubul wrzeciona mitotycznego:

• astralne

• kinetochorowe (chromosomowe)

• biegunowe (polarne) - tworzą strefę zachodzenia

FAZY MITOZY I RUCHY MITOTYCZNE ZALEŹNE OD MT:

PROFAZA

• powstanie 2 biegunów

• segregacja centrosomów >> u roślin wyższych brak cenrosomów - powstanie biegunów niewyjaśnione

• MPF aktywny>> przewaga polimeryzacji MT nad depolimeryzacją

PROMETAFAZA

• po rozpadzie otoczki jądrowej przyłączanie mikrotubul do kinetochorów; kongresja chromosomów do płytki równikowej

• MPF nadal aktywny- ustabilizowanie 2 biegunów; przewaga polimeryzacji nad depolimeryzacją

METAFAZA

• chromosomy ustawione w płytce metafazalnej

• stabilizacja wrzeciona>> równowaga między polimeryzacją a depolimeryzacją>> punkt kontrolny wrzeciona podziałowego

ANAFAZA A

• połączenia między siostrzanymi chromatydami przerwane; chromosomy potomne wędrują do biegunów

• MPF nieaktywny - depolimeryzacja mikrotubul kinetochorowych

ANAFAZA B

• włókna polarne wrzeciona wydłużają się; odległość między biegunami wzrasta (kom. zwierzęce)

PRZEBIEG MITOZY W KOMÓRCE ZWIERZĘCEJ

1. INTERFAZA - (G2) podział centrosomu odbywa się przed mitozą w fazie S/G2

2. WCZESNA PROFAZA- wzrost mikrotubul wrzeciona - powstanie biegunowości; kondensacja chromosomów

3. PROFAZA- najdłuższa>> chromatyna przygotowana do podziału> kondensacja>> wyodrębnienie chromosomów>> kinetochory>> wrzeciono>> rozproszenie jąderka >> dezintegracja otoczki jądrowej

4. PROMETAFAZA - po rozpadzie otoczki jądrowej mikrotubule rosną na terytorium zajmowanym przez chromosomy; ruch chromosomów w kierunku przyszłej płytki metafazalnej = kongresja

5. METAFAZA - wszystkie chromosomy są ustawione w płytce metafazowej (równikowej); każda z chromatyd tego samego chromosomu jest połączona z przeciwnym biegunem za pośrednictwem mikrotubul kinetochorowych; w strefie płytki mikrotubule zachodzą na siebie.

6. ANAFAZA - uruchomienie mechanizmu ruchów typu „A” i „B”; precyzyjne i jednoczesne rozdzielenie chromatyd do przeciwległych biegunów wrzeciona

Anafaza A- ruchy generowane przy końcu „+” MT kinetochorowych - skutek -skracanie się MT

Anafaza B- ruch ślizgowy generowany między przeciwległymi MT biegunowymi w stronę zachodzenia; skutek- ślizg wzdłuż MT biegunowych; rozjeżdżanie się biegunów

7. TELOFAZA - proteoliza cykliny B; rozpad MPF; dekondensacja chromosomów; odtwarzanie otoczki jądrowej ; jąderka, cytokineza

Centromer = przewężenie pierwotne w chromosomie metafazowym; średnica chromatydy w centromerze =250 nm ; średnica w ramionach = 750 nm.

Skład centromeru w chromosomie metasfazowym:

• DNA centromerowe, 2 kinetochory, kohezyna centromerowa

• Centromer jest częścią integralną - kinetochor przejściową

DNA centromerowe

• heterochromatyn a konstytucyjna o wysoce repetytywnych sekwencjach DNA bogatych w pary AT

• KINETOCHOR- jest strukturą białkową występującą po stronie zewnętrznej heterochromatyny centromerowej obu chromatyd; jest miejscem kotwiczenia mikrotubul na centromerze

• Białka kinetochorowe konstytutywne (stałe) obecne podczas całego cyklu mitotycznego biorą udział w montowaniu kinetochoru

• Białka kinetochorowe fakultatywne (przejściowe)- są rekrutowane na DNA centromerowym dopiero przed mitozą (późne g2 do prometafazy) - uczestnicą w funkcjonowaniu wrzeciona

Funkcje białek kinetochorowych

• strukturalna

• punktu kontrolnego wrzeciona

• motoryczna

kohezyna mitotyczna- łączy chromatydy- dołączona w fazie S podjednostki SMC i Scc

SMC- białka podtrzymujące strukturę chromosomu

Scc- regulatorowe; kohezja chromatyd >>> podjednostki tworzą dimer; mogą się składać lub rozwierać

2 typy chromosomów

• holocentryczne (orzęski, nicienie)- ma chromatynę centromerową w postaci wysepek wzdłuż chromosomu

• monocentryczne - centromerowe; chromatyna tylko w jednym miejscu (przewężenie pierwotne)

• >>> w centromerowych H3 zastąpiony przez CENP- A - zmodyfikowany histon> białka kinetochorowe mają powinowactwo do tego histonu

• degradacja części kohezyny przez kinazę POLO >> w centromerze SEKURYNA chroni przed kinazą polo

• kinezyny „+” - zakotwiczenie MT do kinetochorów

• kinezyny „-„ - stabilizują wiązkowy układ MT

• dyneina „-„- stabilizuje bieguny wrzeciona astralnego; generuje ruch chromosomów

• kinezyna bipolarna „+”- generuję ruch podczas anafazy B

• kinezyna katastroficzna - generuje ruch podczas anafazy A

zabezpieczenia między złymi połączeniami

1. punkt kontrolny wrzeciona

2. złe połączenia są destabilizowane przez AURORA B >>> fosforyluje kinazę katastroficzną- niszczy złe połączenia

IM= indeks mitotyczny= % komórek dzielących się w populacji wszystkich komórek - minimum 200 kom

IF= indeks fazowy= % udział każdej z faz w populacji komórek dzielących się

7. INHIBITORY MITOZY

TRUCIZNY PREPROFAZOWE ->> efekt mitodeprezyjny lub mitoklastyczny >> inhibicja syntezy DNA, RNA, białek, inhibicja mechanizmu oddechowego>>> zmniejszenie wartości indeksu mitotycznego>> brak widocznych zakłóceń mitozy

ZWIĄZKI MUTAGENNE (GENOTOKSYCZNE) >> efekt chromatoklastyczny- zmiany w strukturze chromosomów i nieprawidłowości w mitozie>> aberracja chromosomowa, zakłócenia w przebiegu mitozy; mitodepresja>>>>> interkalacja- wniknięcie związku mutagennego międzi 2-nici DNA>> zwiększenie odległości między nimi>> despiralizacja

INHIBITORY WRZECIONA>> efekt mitoklastyczny>> depolimeryzacja lub stabilizacja mikrotubul wrzecziona>> C-mitozy, poliploidyzacja komórek

• mitoza jet procesem wymagającym dużej ilości ATP w komórce.

ZWIĄZKI ALKILUJĄCE >> iperyt azotowy>> mogą reagować z resztami fosforanowymi w DNA, alkilują zasady azotowe>> 2 efekty>> reakcja z resztami kwasowymi - wytworzenie wiązań, co osłabia oddziaływanie między zasadami a deoksyrybozą, zerwanie nici >>> reakcja z zasadami - zmetylowanie zasady- źródło błędów w cyklu replikacyjnym>>>>>>>>> czynnikami alkilującymi są związki elektrofilowe, podstawiające grupę etylową lub metylową w różnych pozycjach DNA

ANALOGI ZASAD AZOTOWYCH >>> mutagenne działanie analogów zasad polega na:

1. hamowaniu aktywności syntaz deoksyrybonukleotydów 2- inkorporacji do DNA i podstawianiu podczas replikacji niekomplementarnych zasad 3- tworzeniu międzyniciowych wiązań w DNA

Czynniki określające podatność DNA na uszkodzenia

1. związki mutagenne reagują częściej z DNA łącznikowym >>> środkowy odcinek nukleosomowego DNA jest silniej chroniony przed dostępem związków mutagennych (silniejszy skręt spirali i zwiększenie bruzdy mniejszej DNA)

2. mutageny wiążą się z preferencyjnymi sekwencjami regulatorowymi leżącymi w rejonach promotorów wzmacniaczy i miejsc startu replikacji sekwencjami S/MAR

3. replikacja jest stanem zwiększającym podatność DNA na działanie mutagenów.spowodowane to jest: >> dekondensacją chromatyny>> brakiem struktury nukleosomowej lub zmienioną formą nukleosomów

Aberracje chromosomowe

Delecja- oderwanie acentrycznego fragmentu chromosomu, który nie zostaje przyłączony (delecja terminalna i interkalarna)

Duplikacja- powtórzenie fragmentu sekwencji

Inwersja - oderwany fragment chromosomu zostaje powtórnie przyłączony ale odwrócony o 180 stopni

Translokacja- przemieszczenie fragmentu chromosomu wewnątrz lub na inny chromosom

Skutki aberracji chromosomowej widocznej w mitozie:

• chromosom acentryczny

• krótkie acentryczne fragmenty chromosomów - minucje

• chromosom dicentryczny

• mosty chromosomowe

Inhibitory wrzeciona:

• związki powodujące degradację mikrotubul wrzeciona przez blokowanie ich polimeryzacji : KOLCHICYNA, ALKALOIDY VINCA, ORYZALINA

• związki hamujące dynamikę mikrotubul i stabilizujące ich strukturę TAKSOL i jego pochodne

TAKSOL

• z rośliny: Taxus brevifolia

• nie reaguje z wolnymi heterodimerami tubuliny

• łączy się specyficznie z mikrotubulami

• miejsce wiązania znajduje się na B-tubulinie w rejonie interfilamentowym

• przyłączenie taksolu zmienia interakcje pomiędzy podjednostkami tubuliny

• powoduje ich trwałe połączenie

• taksol stabilizuję strukturę mikrotubul

• hamuje działanie wrzeciona kariokinetycznego

ALKALOIDY VINCA:

• roślina: Vinca rosea >>> winblastyna i winkrystyna

• windlastyna reaguje z heterodimerami tubuliny i mikrotubulami

• miejsce wiązania znajduje się w podjednostce B blisko miejsca wiązania GTP; przyłączenie winblastyny hamuje hydrolizę GTP związaną z montażem MT

• heterodimery tubuliny związane z winblastyną łączą się w agregaty, co obniża pulę wolnej tubuliny

• w mikrotubulach są 2 miejsca wiązania winblastyny

• miejsce o wysokim powinowactwie leży na końcach mikrotubul, przyłączanie winblastyny prowadzi do depolimeryzacji mikrotubul (część MT pozostaje bo winblastyna reaguje w ilościach substechiometrycznych)

• miejsca słabszego powinowactwa leżą wzdłuż ścian MT

• przyłączenie winblastyny powoduje degradacje wszystkich MT

KOLCHICYNA

• roślina: Colchicum antummale

• reaguje z wolnymi heterodimerami tubuliny

• za trwałe połączenie jej z dimerami odpowiada reakcja pierścieni A i C kolchicyny z podjednostką B-tubuliny

• połączenie z tubuliną chroni dimer przed rozpadem dzięki interakcji pierścienia B kolchicyny z podjednostką alfa tubuliny

• przyłączenie kolchicyny stymuluje hydrolizę GTP w podjednostce B

• wiązanie kolchicyny jest 2-stopniowe: 1- niestabliny kompleks indukujący zmiany konformacyjne w tubulinie i wzrost aktywności GTP-azy 2- utworzenie stabilnego kompleksu

• dimery ze shydrolizowanym GTP i przyłączoną kolchicyną nie mogą polimeryzować

8. KARTOTYP

• zestaw ułożonych w pary chromosomów homologicznych charakterystyczny dla danego osobnika lub gatunku

• proces mitozy jest dokładny. Każda z potomnych kom. dostaje pełny zestaw chromosomów w idealnym stanie. Liczba chromosomów jest taka sama we wszystkich kom. Każdy gatunek ma charakterystyczną dla siebie liczbę chromosomów

Włókno nukleosomowe:

• dwuniciowy heliks DNA

• 2 pełne zwoje tworzy wokół oktameru histonów H2A, H2B, H3 i H4

• oba końce superheliksu w miejscu ich przejścia w łącznik DNA spina histony H1

• DNA wchodzi i schodzi z oktameru histonów po jednej jego stronie -ułożenie nukleosomu jest zygzakowate

• Skrócenie 6 x

Włókno solenoidowe:

• każde włókno nukleosomowe zwinięte jest w formie helisy

• na każdy skręt helisy przypada 6 nukleosomów ułożonych promieniście

• kluczową rolę pełni H1

• skręcenie 40 x

CHROMOSOM

• każdy chromosom zbudowany jest z dwóch chromatyd - skondensowanych, zduplokowanych nici DNA

• siostrzane chromatydy są połączone centromerem

• telomery>>> krańce chromosomów zachowujące indywidualną integralność każdego z nich>> krótkei powtarzające się sekwencje nukleotydów>> skracanie telomerów w czasie repilikacji; określona liczba rund replikacyjnych

• centromer>>> odcinek DNA o specyficznej sekwencji zasad- nieaktywny transkrypcyjnie>> inicjacja kondensacji chromatyny w chromosomie>> utrzymanie chromatyd siostrzancych aż do rozpoczęcia anafazy>> zapewnienie prawidłowego rozdziału materiału genetycznego

• przewężenie wtórne z organizatorem jąderkowym (efekt satelity)

Typy chromosomów: metacentryczny, submetacentryczny, akrocentryczny, telocentryczny

Podstawowe cechy chromosomów

• wielkość (zawartość DNA i całkowita długość chromosomów)

• kształt (położenie przewężenia pierwotnego i wtórnego)

• prążkowanie - podłużne zróżnicowanie>> prążki dostarczają istotnych danych dotyczących morfologicznych cech chromosomów, które są podstawą tworzenia analizy kariotypów

Do analizy kariotypu:

• komórki merystematyczne

• kom. macierzyste ziaren pyłku

• kom. krwi obwodowej (limfocyty, fibroblasty)

• płyn owodniowy lub kosmówki

Badania kariotypu prowadzi się w celu:

• ustalenia budowy chromosomu

• określenia zmian ewolucyjnych genotypu i powstania nowych gatunków

• cytodiagnostycznym

Techniki w kariotypowaniu:

• technika GTG- prążki G- chromosomy metafazowe trawione są trypsyną i barwione barwnikiem Giemzy

• metoda prążków Q - polega na barwieniu kwinakryną> podobnie jak w przypadku prążków G barwnik daje zabarwienie a raczej fluorescencję w miejscach heterochromatynowych bogatych w pary AT.

• Metody prążków R i T - są odwrotnością metody G i Q

• Metoda prążków NOR - uwidacznia organizator jąderkowy

• Metoda prążków C (traktowanie chromosomów NaOH lub BaOH w podwyższonej temp. A następnie bawnikiem Giemzy)>zabarwiane są głównie fragmenty przycentromerowe

• Metoda HRBT - lub HRB- większa rozdzielczość prążkowa obrazu chromosomów >> analizie poddawane są wówczas chromosomy prometafazowe lub nawet późnoprofazowe, tzn. takie, w których kondensacja nie została jeszcze ukończona>> pozwala to na wykrycie nawet małych aberracji strukturalnych chromosomów

• FISH- fluorescencyjna hybrydyzacja in situ - sonda molekularna wyznakowana markerem pozwala na wykrycie małych aberracji

LICZBA CHROMOSOMÓW NIE ZALEŻY OD ZAWARTOŚĆI JĄDROWEGO DNA

Wskazania do postnatalnego badania kariotypu człowieka:

• kliniczne podejrzenie określonej aberracji

• fenotyp dziecka sugerujący bliżej nieokreśloną alberrację chromosomową

• niepowodzenia rozrodu: brak ciąży, poronienia, zgony dzieci

• zaburzenia determinacji i róźnicowania płci

• znaczny niedobór wzrostu u kobiet (zespół Turnera)

• upośledzenie umysłowe

• zespoły z łamliwością chromosomów

Mutacje chromosomowe:

ANEUPLOIDIA - gdy występuje utrata chromoromu lub jest o jeden za dużo

Monosomia 2n-1 (zespół Turnera X+0)

Nullisomia 2n-2

Trisomia 2n+1 (zespół Klinefeltera XXY) Zespół Downa

Tetrasomia 2n+2

>>> przyczyną takich zaburzeń jest :1- nondysjunkcja - polega ona na tym, że chromosomy, które połączyły się w zygotenie nie rozchodzą się w diplotenie i do jednej z gamet wędruje cała tetrada, zaś do drugiej nie wędruje żaden chromosom

2. brak rozejścia się chromosomów siostrzanych w drugim podziale mejotycznym

3. brak rozejścia się chromosomów w mitozie

EUPLOIDIA - pomniejszenie lub zwielokrotnienie całego garnituru chromosomalnego; 1n- monoploidalna kukurydza; 3n triploidalne buraki cukrowe

ALLOPLOIDIA - występuje, gdy garnitur chromosomalny danego osobnika pochodzi od dwóch różnych gatunków np. muł = koń+ osioł żubroń= żubr+bydło domowe

9. CYTOKINEZA

CYTOKINEZA W KOMÓRKACH ZWIERZĘCYCH

Cytokineza- ostatni etap cyklu komórkowego, podczas którego z komórki rodzicielskiej powstają dwie komórki potomne>> proces podziału cytoplazmy towarzyszy rozdziałowi chromosomów podczas mitozy (cytokineza nachodzi czasowo na mitozę)>> cytokineza przebiega odmiennie w kom. roślinnych i zwierzęcych

Przebieg

• istotą cytokinezy jest zapewnienie prawidłowego rozdziału materiału genetycznego do komórek potomnych, a więc cytokineza musi być ściśle skorelowana z mitozą - rola CDK1- cyklina B >>cytokineza rozpoczyna się w anafazie, kończy się uformowaniem jąder w komórkach potomnych

Etapy:

1. wyznaczenie płaszczyzny podziału cytoplazmy - anafaza- aktywacja RhoA

2. powstanie pierścienia kurczliwego i bruzdy podziałowej - telofaza - aktynomiozyna

3. pogłębianie bruzdy podziałowej i rozdział komórek potomnych- późna telofaza - kurczenie się pierścienia aktynomiozyny

Gdzie i kiedy wyznacza się płąszczyzna podziału? Co determinuje jej lokalizację?

ETAP 1 - wyznaczenie płaszczyzny podziału w kom. zwierzęcej

WNIOSEK1 - położenie wrzeciona mitotycznego determinuje położenie płaszczyzny podziału komórek zwierzęcych>> płaszczyzna podziału zostaje wyznaczona przez mikrotubule wrzeciona mitotycznego>>> w centralnej części wrzeciona podziałowego powstaje struktura zbudowana z równoległych, lecz biegnących w przeciwnych kierunkach mikrotubul ( spindle midzone)>>> białka związane z chromosomami ulegają translokacji i są zlokalizowane w centralnej części wrzeciona- białka kompleksu Aurora (kinaza serynowo treoninowa) INCENP i inne

WNIOSEK2 - przebieg cytokinezy wymaga obecności białek centralnej części wrzeciona podziałowego >> białka kompleksu Aurora ( kinaza serynowo/treoninowa)- INCENP, Aurora B surwiwina, w anafazie przemieszczają się z chromosomów do centralnej części wrzeciona podziałowego i regulują segregację chromosomów i cytokinezę, wpływając na lokomocję białek motorycznych>>> białka motoryczne - kinezyny>>>> podczas anafazy zachodzi inaktywacja kompleksu cyklina B- cdk1

WNIOSEK 4 : w wyznaczaniu płaszczyzny podziału oprócz mikrotubul biegunowych zaangażowane są mikrotubule astralne

Budowa pierścienia kurczliwego

• jest zbudowany z zachodzących na siebie filamentów aktynowych i miozynowych i jest przyczepiony do białek związanych z cytoplazmatyczną stroną błony kom.

• aktywacja białek środkowej części wrzeciona podziałowego prowadzi do unieruchomienia ścieżki z udziałem Rho - odpowiedzialnej za formowanie pierścienia kurczliwego

Wnioski:

1 - bruzda podziałowa w błonie kom. powstaje w wyniku skurczu pierścienia kurczliwego

4. siła generowana przez pierścień kurczliwy jest wynikiem ślizgania się filamentów aktynowych po miozynowych

5. ponadto pęcherzyki transportowane są do bruzdy podziałowej- uzupełninie błony kom. miedzy dzielącymi się kom.

6. pomiędzy komórkami powstaje ciałko środkowe

7. w ostatnim etapie zanika pierścień kurczliwy - depolimeryzacja filamentów aktynowych

8. rozdział komórki

CYTOKINEZA W KOM. ROŚLINNYCH

1. PASMO PREPROFAZOWE - wyznaczanie płaszczyzny podziału

2. Mikrotubule, mikrofilamenty aktyny i białka kinezynopodobne to fragmoplast>> organizacja wrzeciona cytokinetycznego

3. Mkrotubule- transport pęcherzyków sekrecyjnych

4. Przegroda pierwotna- podział komórki

PASMO PREPROFAZOWE

• inicjacja- po zakończeniu replikacji DNA - faza S

• zwężenie faza G2

• dojrzewanie

• degradacja- aktywny MPF- profaza

• w anafazie i telofazie powstaje fragmoplast a potem przegroda pierwotna.

• Pasmo jest strukturą charakterystyczną dla fazy G2.

Kofeina - inhibitorem cytokinezy>> działanie kofeiny jest widoczne w tubularno-pęcherzykowym stadium przegrody pierwotnej>> stabilizacja struktury rosnącej przegrody zależy od obecności kalozy w przedziale międzybłonowym przegrody>>. Przegroda tworzy się tylko meiedzy siostrzanymi komórkami

Zmiana morfologii fragmoplastu podczas cytokinezy:

1. koalescencja MT anafazowych

2. polimeryzacja MT de novo

3. ustalenie antyrównoległego układu MT (ślizg)

4. uformowanie fragmoplastu złożonego z 2 spolaryzowanych warstw MT ze strefą zachodzenia

5. lateralna ekspansja fragmoplastu (depolimeryzaca MT w centrum fragmoplastu i polimeryzacja na obwodzie rosnącej przegrody pierwotnej)

10. MEJOZA

• prezygotyczna

• postzygotyczna

• przemiana pokoleń

• u roślin przemiana pokoleń>> w wyniku mejozy powstają zarodniki (spory)

Inicjacja cyklu mejotycznego (drożdże)

-kompleks cyklin fazy G1 z cdc2B zapobiega jednoczesnej inicjacji cyklu mejotycznego i mitotycznego

aktywny Ime1 promuje transkrypcję genów wczesnej mejozy i kinazy Ime2

• Ime 2 fosforyluje inhibitorowo białka Smc1 (inhibitor CDK)

• Powstaje aktywny kompleks cykliny fazy S i CDK inicjujący premejotyczną replikację DNA

PREMEJOTYCZNA FAZA S

1. Do chromosomów dołączana jest specjalna mejotyczna kohzyna z podjednostką Rec 8

2. Przygotowywanie DNA do rekombinacji rozpoczyna się w leptotenie

• inicjacja dwuniciowych przerw w DNA (DSB- double strand breaks) wymaga kompletnej replikacji

• aktywowany jest DSB chceckpoint zabezpieczający przed przedwczesną inicjacją DSB

• po zainicjowaniu replikacji DSB checkpoint generuje sygnał blokujący powstawanie dwuniciowych przerw w DNA

PROFAZA I - LEPTOTEN

- w leptotenie przebiegają niezależnie od siebie: 1- parowanie chromosomów homologicznych 2- inicjacja DSB (dwuniciowe przerwy w DNA)

• parowanie chromosomów>> zbliżanie się do siebie chromosomów homologicznych- ich odcinki telomerowe się zbliżają

• >>> zmienia się ułożenie chromosomów - BUKIET

• czynniki regulujące parowanie: - białka inicjujące DSB i Spo11 - specyficzne rejonu chromosomów HRR

• białko Spo11 inicjuje powstawaie DSB niezbednych do crossing-over

• sekwencje S/MAR są jednym z rejonów tworzenia DSB

• z osią chromosomu asocjują białka kompleksu synaptonemalnego Scp2 i Scp3

ZYGOTEN

• koniugacja chromosomów homologicznych - formowanie kompleksu synaptonemalnego łączącego chromosomy homologiczne w biwalenty

• formowanie kompleksu synaptonemalnego zaczyna się od miejsc DSB

WĘZŁY REKOMBINACYJNE

• wczesne węzły rekombinacyjne złączone z osiami nieskoniugowanych chromosomów lub z elementami centralnymi S.C. widoczne są w zygotenie

• późne węzły rekombinacyjne widoczne są w pachytenie, ich liczba i położenie w biwalentach odpowiadają położeniu crossing-over

ENZYMY

Endonukleaza DNA>> otwieranie 1 lub 2 nici w cząsteczce DNA

Helikazy>> rozwijanie łańcuchów nukleotydowych

Białka SSBP>> stabilizacja rozwiniętego 1-niciowego DNA

Topoizomeraza I DNA>> rozwijanie lub zwijanie DNA

Topoizomeraza II DNA>> porządkowanie struktury DNA z zapętleń powstałych po rekombinacji

Egzonukleaza - nadtrawianie wystających wolnych końców łańcuchów DNA

Polimeraza Dna>> wypełnianie przerw powstałych w łańcuchach polinukleotydowych

Enzymy rekombinacyjne rec>>

Enzym Ruvc>> rozwiązanie struktury Hollidaya

PACHYTEN

• aktywowany jest checkpoint rekombinacyjny sprawdzający poprawność i zakończenie rekombinacji

DIPLOTEN

• fosforylacja białek Scp2 i Scp3 jest sygnałęm do degradacji kompleksu synaptonemalnego

• biwalenty stają się widoczne jako odrębne struktury

• w biwalentach widoczne chiazmy- miejsca crossing-over

• chromosomy homologiczne pozostają połączone w biwalentach dzięki chiazmom i połączeniu siostrzanych chromatyd na całej długości

• CHROMOSOMY SZCZOTECZKOWE - są widoczne w oocytach >> pojawiają się podczas diplotenowej transkrypcji genów kodujących białka niezbędne dla przyszłej komórki jajowej

DIAKINEZA

• fragmentacja otoczki jądrowej

• połączenie kinetochorów chromosomów z mikrotubulami wrzeciona

• kongresja biwalentów do płaszczyzny równikowej komórki

METAFAZA I

• biwalenty ustawiają się w płaszczyźnie równikowej odcinkami w których są chiazmy

• do końca metafazy kochezyna łączy siostrzane chromatydy na całej długości

ANAFAZA I

• APC/cdc 20 ubikwitynuje sekurynę

• Sekuryna degraduje w proteasomach- aktywowana jest separaza

• Separaza degraduje podjednostkę Rcc 8 kohezyny wzdłuż ramion chromosomów>> kochezyna w centromerach jest chroniona przed degradacją

• Segregacja chromosomów homologicznych

Warunki niezbędne do zredukowania liczby chromosomów podczas mejozy:

1. do końca pierwszej metafazy chromosomy homologiczne muszą być połączone w biwalent >>> jest to możliwe dzięki chiazmom i połączeniu siostrzanych chromatyd w obydwu chromosomach (kohezyna) do końca interfazy>>> połączenie jest wystarczająco trwałe aby wytrzymać siły generowane przez oddziaływanie MT wrzeciona z kinetochorami

2. kinetochory chromatyd siostrzanych muszą być połączone mikrotubulami wrzeciona z jednym jego biegunem (monopolarnie)

3. kinetochory każdego z chromosomów w biwalencie muszą być połączone z różnymi biegunami wrzeciona>>>> do prawidłowego połączenia kinetochorów z MT wrzeciona konieczna jest współorientacja siostrzanych kinetochorów>> współpracę kinetochorów zapewnia kohezyna zasocjowana z centromerowym DNA

• w kom. drożdży za monopolarne połączenie kinetochorów odpowiada monopolina>> lokalizacją monopoliny reguluje spo13 i plk

4.- siostrzane chromatydy połączone są kochezyną w centromerach aż do anafazy II

SHOGUSHIN (SGO1) - asocjuje z kohezyną zlokalizowaną w przycentromerowej heterochromatynie i chroni kohezynę przed degradacją

11. CYKLE ENDOREPLIKACYJNE

Endoreplikacja- zwielokrotnienie ilości DNA poza cyklem komórkowym

Powielenie całości DNA:

ENDOMITOZA - wzrost liczby chromosomów, powstają komórki 4c/8c/16c w obrębie 1 jądra - dochodzi do rozdzielenia siostrzanych chromatyd

ENDOREDUPLIKACJA - liczba chromosomów nie ulega zmianie; zwielokrotnieniu ulega liczba chromatyd (chromosom politeniczny- wielochromatydowych)

Powielenie części DNA:

WYBIÓRCZA REPLIKACJA (AMPLIFIKACJA)- geny kodujące rybosomowe rRNA- poza chromatyną

NIEPEŁNA REPLIKACJA - zachodzi w kom. których różnicowanie kończy się programowaną śmiercią np. kom. wieszadełka, liścieni zarodka, bielma

Endomitoza, endoreplikacja i amplifikacja towarzyszą wczesnym stadiom rozwoju rośliny lub jej organów. Np. kom.epidermy, miękisz u sukulentów, włośniki

Endorepilacja w kom. owadów i ssaków >> kom. przetchlinek, cewek Malphigiego, ścian jelita, kom. troficzne, follikularne, megakariocyty - produkują płytki krwi . trofoblasty- budują lewą warstwę kosmówki

Zmienione mechanizmy w przejściu:

• metafaza/ anafaza - endomitoza

• G2/ mitoza - endomitoza lub endoreduplikacja

• S/G2- endoreduplikacja

• S- niepełna replikacja lub amplifikacja

Endomitoza- megakariocyty >>cykl endoreplikacyjny jest inicjowany przez trombopoetynę

Megakariocyty= struktury znajdujące się na powierzchni naczyń krwionośnych, mają wypustki które wnikają do tych naczyń >>> w endomitozie nie ma anafazy B - reszta jest normalnie.>>> wyjście z mitozy z powodu przedwczesnej lub zintensyfikowanej degradacji cykliny B

Endomitoza- komórki miękiszowe >> zahamowanie degradacji otoczki jądrowej, nie powstaje wrzeciono kariokinetyczne>> chromosomy dzielą się na chromatydy

Endoreduplikacja >> po replikacji DNA chromatydy nie oddzielają się> powstają chromosomy politeniczne- złożone z wielu cząsteczek DNA >> Puffy- Pierścienie Balbianiego- chromatyna aktywna transkrypcyjnie

W cyklach endoreduplikacyjnych muszą być spełnione 2 warunki:

1. blokada wejścia w mitozę

2. cykliczna replikacja DNA

Replikacja jest możliwa po osiągnięciu przez chromatynę stanu kompetencji.

W typowym cyklu komórkowym chromatyna jest kompetentna do replikacji w fazie G1, aby ją ponownie uzyskać musi przejść mitozę.

Ochrona przed przedwczesną inicjacją replikacji:

• kompleks prereplikacyjny PRC składa się z białek ORC, MCM i cdc6

• po zapoczątkowaniu replikacji wszystkie składniki PRC z wyjątkiem ORC są fosforylowane przez kompleksy cyklin fazy S/CDK i odłączają się od chromatyny

• ponowna asocjacja składników PRC jest możliwa w stadium minimalnej aktywności kinaz cyklinozależnych tzn. po degradacji cyklin A, E, B

• w cyklach endoreruplikacyjnych faza G jest konieczna do reasocjacji PRC z chromatyną i uruchomienia replikacji

• cykliczność zależy od oscylacji aktywności kompleksu CDK/E (kom. zwierzęce) i kompleksu CDK/A i syntezy białka cdc6 (roślinne)

!!! niski poziom białka Dacapo (CIP/KIP) inhibitora kinazy cdk2 pozwala na utrzymanie aktywności kompleksu cdk2/ E, niezbędnego do inicjacji replikacji

Endoreduplikacja - trofoblasty (ssaki)

• nie zmienia się poziom cykliny E

• cykliczna zmiana aktywności kompleksu cdk2/E zależy od koncentracji białka p57

• p57 (inhibitor kinaz z rodzaju CIP/KIP akumulowany jest pod koniec fazy S

• hamowana jest aktywność cdk2 i kompleksu Cdk2/E co umożliwia montaż PRC i replikację

• p57 jest następnie degradowany, jego poziom ponownie rośnie podczas następnej fazy S

Niepełna replikacja i amplifikacja

• amplifikacji podlegają najczęściej geny, których ostatecznym produktem jest RNA

• odwrotna transkryptaza syntetyzuje rDNA na matrycy rRNA

• kopia rDNA ulega cyrkularyzacji

• replikacja

>> endonukleaza rozcina jedną z nici DNA

>> wolny koniec 3' jest miejscem inicjacji replikacji

>> polimeraza cyrkuluje po kolistej matrycy - wydłuża się przecięta nić DNA

Korzyści endoreplikacji:

• zwiększenie kopii rozmaitych genów

• intensyfikacja metabolizmu

• osiąganie większych rozmiarów komórek

12. HODOWLE KOMÓREK I TKANEK - IN VITRO

hodowla komórek- utrzymywanie komórek poza organizmem w medium hodowlanym w ściśle określonych warunkach (temp. Wilgotnosć ph)

• początkowo hodowano przy wykorzystaniu rdzenia kręgowego żaby do kropli ciekłej limfy

• wprowadzenie sterylnych warunków

Sprzęt:

• komora z przepływem laminarnym

• inkubator

• mikroskopy i inne

• w komorach przepływ powietrze przez filtry wyłapuje zanieczyszczenia

Sterylizacja:

• sterylizator - szkło, narzędzia

• autoklaw - podłoża, płyny, plastik > w podwyższonym ciśnieniu

• filtracja- MEM DMEM, trypsyna

• traktowanie sprzętu ultrafioletem (powstający ozon toksyczny dla kom. zwierzęcych)

W zależności od ilości komórek: szalki, butelki, leptek

Inkubator> stałe warunki jakei panowało w organizmie

Pożywki>> kom. zwierzęce musza mieć wszystkie niezbędne składniki do życia> dawniej pożywki naturalne, osocze krwi, wyciąg tkankowy, surowica krwi >>> pożywki sztuczne MEM DMEM, sól fizjologiczna ,,, MEM- podstawowa pożywka, inne zmodyfikowane

Surowice- hormony, czynniki wzrostu, białka transportuyjące

Hodowla pierwotna- prowadzona z materiału pobranego bezpośrednio z organizmu

Linia komórkowa - powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu - ustalona linia komórkowa

Kom. macierzyste- mogą przekształcać się w różne tkanki

Kom. progenitorowe- wyznaczone do bycia komórkami określonej tkanki

Hodowla z ekspantantu- hodowla drobnych fragmentów tkanki>> z fragmentów tych przyczepionch do dna naczynia i umieszczonych w pożywce wywędrowują komórki>> nie zawsze można uzyskać komórki które wymigrowują- niektóre trzeba wyseparować

Enzymy:

1. kolagenaza- tam gdzie kolagen

2. dispaza- zdolne do degradacji różnych białek

Wyizolowane komórki muszą mieć podłoże twarde do wzrostu- nie rosną na szklanym ani w zawiesinie>> hoduje się na sterylnych plastikowych szalkach>> niektóre kom. muszą mieć białka z tkanek>> zelatyna, kolagen

Hodowla na mikronośnikach- wykorzystująca kuleczki żelatynowe, polistyrenowe, poliakrylamidowe, sefandeksowe nagie lub pokryte białkami macierzy>> w celu zwiększenia powierzchni

• siatki kolagenowe - do przeszczepów skóry

• najbliższe do in vivo > hodowla na sztucznych naczyniach włosowatych

• w organizmie komórki bez podłoża>> hodowla w zawiesinie lub w postaci sferoidów> kom. agregują się w kule

Krzywa wzrostu:

1. komówki w fazie adaptacyjnej- nieznaczny spadek liczby

2. namnażanie

3. logarytmiczny wzrost

• inhibicja kontaktowa - zahamowanie podziału

3. faza platau - równowaga

4. procesy obumierania

• komórki linii nowotworowej- początkowe procesy tak samo i zaczynają się dzielić i nic podziałów nie ogranicza

zamrażanie i odmrażanie komórk>> do ciekłego azotu>> odmrażanie przez zewnętrzne ogrzanie propówki lub dodanie ciepłego medium i umieszczenie w środowisku hodowlanym