0108; 20.04.2009, cwiczenia nr 8., - Apoptoza.; Paul Esz

Apoptoza

• z greckiego „apoptosis” - opadani płatków lub liści z drzew

• naturalna śmierć komórki opisana po raz pierwszy przez Kerra, Wyllie'go i Currie (1972r.)

• zjawisko fizjologiczne niezbędne do prawidłowego funkcjonowania każdego organizmu

• proces aktywny wymagający olbrzymich nakładów energii związanych z aktywacją określonych genów i inicjacją zdarzeń biochemicznych i strukturalnych

• apoptoza nie wywołuje odczynu zapalnego

• dochodzi do kondensacji chromatyny w obrębie jądra

• fragmentacja DNA

• jądro ulega rozpadowi

• fałdowanie błony komórkowej i tworzenie pączków apoptotycznych

• nic nie przedostaje się na zewnątrz tych pączków dlatego nie ma odczynu zapalnego

• potem te pęczki są fagocytowane

Nekroza

• pęcznienie mitochondriów i lizosomów

• pękanie lizosomów

• chaotyczne cięcie składników cytoplazmy

• zawartość komórki przedostaje się na zewnątrz i powoduje to stan zapalny

• zachodzi pod wpływem dużej dawki silnego czynnika, komórka pęcznieje i tworzy się stan zapalny

Fizjologiczna rola apoptozy

• rola w etapie kształtowania układu nerwowego

• formowanie palców u wyżej uorganizowanych kręgowców

• w trakcie rozwoju układu odpornościowego

• fizjologiczny zanik (inwolucja) grasicy

• naturalna inwolucja narządów i struktur pozostających pod kontrolą układu hormonalnego

• odnowa i regeneracja tkanek

• zakończenie życia komórek zróżnicowanych

Czynniki hamujące i indukujące apoptozę

• biologiczne

• hamujące

• czynniki wzrostu

• estrogeny, androgeny

• niektóre białka rodziny Bel-2 (np. Bel-2, Bel-XL)

• niektóre białka wirusowe (białko adenowirusa E1B)

• białka szoku cieplnego

• onkogeny

• indukujące

• brak czynników wzrostu

• rodzina białek TNF (FasL, TNF)

• niektóre białka rodziny Bel-2 (np. Bax, Bel-Xs)

• produkty limfocytów cytotoksycznych (np. perforyna)

• niektóre hormony (np. glikokortykoidy)

• zakażenia wirusowe (np. HIV)

• geny supresorowe nowotworów (np. p53)

• przerwanie kontaktu z otoczeniem

• jony wapnia

• chemiczne

• hamujące

• inhibitory proteaz cysteinowych

• inhibitory białek promujących apoptozę należących do rodziny bel-2

• inhibitory kalpainy

• indukujące

• leki - (cisplatyna, doksorubicyna, taksol, aspiryna)

• związki toksyczne - (alkohol, cyjanki)

• wolne rodniki tlenowe

• fizyczne

• indukujące

• promieniowanie jonizujące

• wysoka i niska temperatura

Przebieg apoptozy

• faza I

• indukcja lub wzbudzenie (decyzja o śmierci komórki

• działają wtedy czynniki spustowe

• następuje przekazywanie i modyfikacja sygnału z układu receptorowego

• faza II - wykonawcza (śmierć komórki)

• faza III - zniszczenia albo degradacji (kończąca się pochłonięciem komórki przez komórki sąsiadujące lub makrofagi)

Szlaki sygnalizacyjne apoptozy

Trzy główne szlaki sygnałowe prowadzące do apoptozy

• zewnętrzny (receptorowy)

• wewnętrzny (mitochondrialny)

• indukowany stresem (zamiany w siateczce śródplazmatycznej) - zaburzenia homeostazy jonów wapnia oraz nagromadzenie nieprawidłowo zmodyfikowanych białek; zmianie ulega kaspaza 12 i aktywuje zmiany w kaspazach 7 i 8

Poza tym

• szlak pseudoreceptorowy - białko (perforyna) powoduje nieciągłość błony komórkowej - przerywa błonę komórkową - co umożliwia wniknięcie innego białka (granzym B) do wnętrza komórki co aktywuje kaspazę 3 → apoptoza

Kaspazy

Enzymy proteolityczne (rozcinają wiązania peptydowe między aminokwasami)

Mechanizm aktywacji kaspaz

• homoaktywacja (autoproteoliza)

• heteroaktywacja

Trzy grupy

• aktywatory cytokin związane ze stanami zapalnymi (kaspazy: 1, 4, 5, 11, 12, 13, 14)

• inicjatory apoptozy (kaspazy: 8, 9 , 10)

• efektory fazy wykonawczej apoptozy (kaspazy: 3, 6, 7)

Białka trawione przez kaspazy

• białko PARP [polimeraza poli (ADP-rybozy)]

• bierze udział w rozpoznawaniu uszkodzeń i naprawie DNA

• białko ICAD

• proteoliza tego białka uruchamia białko CAD (Caspase-Activated DNAse), którego zadaniem jest cięcie DNA umierającej komórki

• białko RB (białko retinoblastoma)

• kontroluje przechodzenie komórki przez kolejne fazy cyklu komórkowego

• białko MDM2

• wiąże się z białkiem p53 i reguluje jego stabilność

• Acinus (apoptotic Chromatin Condensation Inducer in the Nucleus)

• odpowiedzialne za kondensację chromatyny jądrowej

• niektóre białka szkieletu komórki np. aktyna i fodryna

• białka wyścielające wewnętrzną powierzchnię otoczki jądrowej - laminy

Rola białka p53 w apoptozie

• uszkodzenie DNA lub innych rzeczy

• dochodzi do wzrostu ekspresji p53 i białko to ma zdolności aktywacji naprawy DNA i wszelkich uszkodzeń w komórce (aktywuje transkrypcję genów białek naprawy)

• jeśli uszkodzenia są nie duże to zostają naprawione (komóka zostaje zatrzymana w cyklu i się naprawia)

• ponownie wchodzi w cykl komórkowy

• p53 działa jako czynnik naprawy

• gdy zmiany są zbyt duże → p53 kieruje komórkę na drogę śmierci

(RYSUNEK I)

Oporność komórek nowotworowych/apoptoza

Elementy obrony komórek nowotworowych przed apoptozą

• zwiększony poziom antyapoptotycznych białek z rodziny Bel-2 (Bel-2 i Bel-XL); nadekspresja Bel-2 hamuje apoptozę związaną z pobudzeniem receptora TRAIL i komórkach nerwiaków i glejaków

• inaktywacja białek proapoptotycznych z rodziny Bel-2 (Bax, Bak); często jest to związane z mutacjami w genie białka BAX; ekspresją białka BAX reguluje produkt genu p53

• wzrost ekspresji inhibitorów apoptozy między innymi IAP (inhibitor of apoptosis protein) i FLIP; do białek IAP należy między innymi surwiwina ( w komórkach nowotworowych obserwuje się wysoki poziom tego białka)

• uszkodzenie punktów kontrolnych cyklu (między innymi mutacja w obrębie genu p53)

Metoda TUNEL

TUNEL - TdT - mediated deoxyuridinentriphosphate-biotin/digoxygenin nick end-labeling)

TdT - terminalna transferaza

x-dUTP - znakowane nukleotydy

x - znacznik (np. fluorochrom)

Metoda kometkowa (RYSUNEK II)

1. Apoptoza - widoczny po prawej stronie ogon oddalony od głowy

2. Komórka z nieszukodzonym DNA brak ogon

3. Nekroza - ogon połączony z głową

Barwienie aneksyną V i jodkiem propidyny

Aneksyna V wykazuje wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny, dzięki czemu możliwa jest detekcja komórek wykazujących cechy apoptozy. Jodek propidyny (PI) barwi jądra komórkowe. Przenika do wnętrza komórek, których ciągłość błony została naruszona. Jest zatem barwnikiem komórek znajdujących się w późnej apoptozie lub nekrozie.