BIOTECHNOLOGIA

Wiesław Przybylski

WYKŁAD 1 7.10.10r.

Znaczenie gospodarcze i społeczne biotechnologii we współczesnym świecie

Konwencja o różnorodności biologicznej ONZ: biotechnologia oznacza zastosowanie technologiczne, które używa systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników, żeby wytwarzać lub modyfikować produkty lub procesy o określonym zastosowaniu.

Biała biotechnologia - zastosowanie w przemyśle. Wykorzystuje ona żywe komórki, np. pleśni, bakterii oraz enzymy do wytwarzania nowych produktów lub inicjowania procesów przetwórczych. Mikroorganizmy wykorzystywane w białej biotechnologii są zwykle zmodyfikowane przy zastosowaniu inżynierii genetycznej.

Czerwona biotechnologia jest związana z medycyną i ochroną zdrowia, a wykorzystuje się ją przy tworzeniu nowych leków, w diagnostyce, profilaktyce i leczeniu dotychczas nieuleczalnych chorób. Ulepszone mikroorganizmy wytwarzają antybiotyki, witaminy, szczepionki i białka na użytek medycyny. Preparaty biotechnologiczne stanowią obecnie ok 20% sprzedawanych lekarstw.

Biotechnologia czerwona - „zielona rewolucja” w rolnictwie

Wykorzystanie:

• ulepszanie gatunków roślin uprawnych o dużym znaczeniu gospodarczym

Zmodyfikowane zostało większość roślin mających znaczenie dla człowieka

Cele modyfikacji:

• 
  
  
  
  
  odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin (soja, rzepak)

• 
  
  odporność na szkodniki - modyfikacja Bt (kukurydza, bawełna)

• odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne

• 
  
  
  
  
  
  odporność na niekorzystne warunki środowiska

• poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych

WYKŁAD 2 14.10.2010r.

BIOLOGICZNE PODSTAWY PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH

Mikroorganizmy w biotechnologii

Pozyskiwanie szczepów o znaczeniu technologicznym (skrining), obejmuje zespół zabiegów mających na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby możliwych drobnoustrojów tych, które odpowiadają stawianym wymaganiom technologicznym.

Mikroorganizmy o użytecznych właściwościach technologicznych stanowią nieznaczną część ich ogólnej populacji w badanej próbce. Z tego powodu niezbędna jest wstępna obróbka próbki w celu wzbogacenia udziału drobnoustrojów o poszukiwanych cechach.

Charakterystyka oraz kryteria doboru organizmów

O powodzeniu mikrobiologicznej produkcji różnych metabolitów jest wyselekcjonowanie spośród wielu gatunków i rodzajów mikroorganizmów odpowiednio aktywnego szczepu produkcyjnego.

Szczepy takie, powinny odpowiadać następującym kryteriom:

• muszą być niepatogenne

• nie mogą wytwarzać toksycznych metabolitów

• muszą wykazywać stabilność biologiczną (nie ulegać degeneracji)

Ocena cech użytkowych drobnoustrojów przemysłowych

• wydajność i szybkość tworzenia produktu

• wzmożona produkcja określonych metabolitów oraz nadawanie prawidłowych cech organoleptycznych produktom

• szybkość wzrostu

• stabilność genetyczna i fenotypowa oraz fagooporność

• wymagania pokarmowe oraz tolerancje na zmienne warunki środowiska

• czystość i łatwość wydzielania wytworzonego produktu

Skrining szczepów

• Najstarsza metoda skriningu szczepów produkcyjnych to izolowanie ich ze środowisk naturalnych (gleba oraz produkty naturalne). Występujące w nich bakterie, promieniowce i grzyby mikroskopowe zdolne do biosyntezy (antybiotyków), rozkładu (białek) czy biotransformacji (związków steroidowych).

• Mniej typowe źródła drobnoustrojów: zbiorniki wodne o bardzo dużym zasoleniu, miejsca stale zanieczyszczane ropą naftową, okolice gejzerów, odpady poflotacyjne zakładów przerabiających rudy metali ciężkich.

Metody otrzymywania czystych kultur

• metoda rozcieńczeń Listera,a następnie metoda płytkowa Kocha (→ metoda posiewu redukcyjnego → metoda posiewu powierzchniowego → metoda wgłębna, czyli płytek lanych)

• metoda kropelkowa Lindnera (stosowana głównie w przypadku czystych kultur drożdży i grzybów strzępkowych)

• metoda izolowanie czystych kultur z zastosowaniem mikromanipulatora (zalecana w badaniach naukowych)

• pomocnicze metody wyodrębniania czystych kultur, bazujące na wykorzystaniu różnic fizjologicznych i biochemicznych drobnoustrojów

Stabilność cech drobnoustrojów przemysłowych

Powtarzalność procesów biotechnologicznych

• zabezpieczenie czystości mikrobiologicznej

• zabezpieczenie maksymalnej żywotności szczepów drobnoustrojów przemysłowych

• utrzymanie pożądanych cech technologicznych

• w czasie przechowywania ważne jest, aby pozostałe przy życiu komórki charakteryzowały się cechami biotechnologicznymi na poziomi kultury wyjściowej - należy tak dobrać warunki przechowywania, aby zachować w możliwie najwyższym stopniu wszystkie cechy biologiczne i technologiczne mikroorganizmów

• nie ma metody uniwersalnej, którą można by zastosować we wszystkich sytuacjach

• stosunkowo najłatwiej przechowują się drobnoustroje wytwarzające zarodniki lub przetrwalniki, natomiast znaczenie trudniej wegetatywne formy bakterii i fragmenty grzybni wegetatywnej promieniowców i grzybów strzępkowych

• najprostszy sposób przechowywania drobnoustrojów to umieszczenie namnożonej hodowli w postaci skosów agarowych w temp. +4st. C, gdzie mogą zachowywać żywotność i aktywność biochemiczną od 2 tygodni (bakterie) do kilku miesięcy (grzyby strzępków). Odcięcie dostępu tlenu przedłuża czas przechowywania kultur na skosach.

Stosowana metoda przechowalnicza powinna

• zapewnić maksymalną przeżywalność komórek

• zminimalizować liczbę komórek uszkodzonych

• przeciwdziałać spontanicznym mutacjom i selekcji odmian mniej przydatnych w procesie technologicznym

• ograniczyć przypadkowe zanieczyszczenia

Zamrażanie kultur

• zamrażanie tradycyjne: namnożoną biomasę lub komórki zebrane ze skosów przechowuje się w specjalnych fiolkach w zamrażarce, w temp. - 5 do - 20 st. C, gdzie zachowują swoją żywotność od 1 do 2 lat

• metody nowsze: zamrażanie w specjalnych zamrażarkach mechanicznych w niskiej temp. Od -60 do -80 st. C lub przy wykorzystaniu ciekłego azotu w temp od -156 do -196 st. C

• tempo zamrażania: wolne - ok 1 st. C/ min. lub bardzo szybkie 0 od 100 do 1000st. C/ min. Zazwyczaj 1 - 2 st. C/min, dopóki nie uzyska się temperatury kilka stopni powyżej punktu zmiany faz, tj ok -30 st. C. w dalszym etapie temp zamrażania jest większe, co uzyskuje się przez umieszczenie pojemników z ampułkami w pojemniku z ciekłym azotem.

Przygotowanie do zamrażania kultur

• hodowla pod zwiększonym ciśnieniem osmotycznym w obecności zwiększonej zawartości cukrów (np. 6%) oraz alkoholi polihydroksylowych (mannitol, ksylitol, glicerol)

• powoduje to gromadzenie w komórkach niskocząsteczkowych substancji (prolina, walina i glicyna):

- działają krioochronnie, obniżają temperaturę zamrażania wody

- chronią biopolimery (kwasy nukleinowe i enzymy) przez uszkodzeniami

Etapy zamrażania kultur

• hodowla adaptacyjna w pożywce z podwyższonym ciśnieniem osmotycznym (pożywka mineralna z dodatkiem 6% mannitolu)

• przygotowanie mieszaniny krioochronnej

• zawieszenie komórek w mieszaninie krioochronnej

• głębokie zamrożenie w ciekłym azocie

Rozmrażanie kultur

• decydującą rolę w zachowaniu żywotności komórek odgrywa sposób rozmrażania, które powinno przebiegać możliwie szybko, abynie dochodziło do wtórnego rozrastania się kryształów lodu i zniszczenia komórek

• najczęściej proces rozmrażania przeprowadza się przez zanurzenie ampułek z zamrożonym materiałem do wody o temp. Ok 40 st. C. Po rozmrożeniu należy usunąć lub rozcieńczyć mieszaninę krioochronną w celu zmniejszenia ciśnienia osmotycznego

• hodowla namnożonych komórek powinna być przeprowadzona w pożywce o składzie umożliwiającym dobrą regenerację i wzrost komórek

Suszenie czystych kultur

• najprostszy sposób to suszenie hodowli bezpośrednio na podłożu wzrostowym. Zastosowanie do utrwalania grzybów strzępkowych, które obficie zarodkują. Suche konidia mogą utrzymać dużą żywotność nawet przez kilka lat

• modyfikacja metody: suszenie próżniowe w eksykatorze z substancją higroskopijną (np. P2O5) w temp. Pokojowej

• przechowywanie........

Suszenie rozpyłowe

• metodę stosuje się w utrwalaniu biomas bakterii, drożdży, preparatów enzymatycznych i antybiotyków

• przy dużym stopniu dyspersji roztworów, odparowanie wody następuje praktycznie momentalnie, dzięki czemu czynnik suszący o wysokiej temperaturze nie powoduje dużych strat ich aktywności

Zalety suszenia rozpyłowego

• wysoka jakość gotowego produktu (biopreparatów z niewielką stratą aktywności biologicznej)

• duża intensywność wymiany ciepła między rozpylanych roztworem a ogrzanym czynnikiem suszącym, zależna od temperatury i wilgotności czynnika suszącego oraz dyspersji roztworu (wielkości kropel)

• możliwość automatycznego sterowania procesem

• odwadniania roztworów systemem ciągłym

Wady tej metody

• mała wydajność odparowania wilgoci w jednostce objętości komory suszenia, co wymusza projektowanie dużych rozmiarów komór

• relatywnie duże jednostkowe zapotrzebowanie na energię

• duże koszty inwestycyjne

Suszenie fluidyzacyjne

• polega na oddolnym przepuszczeniu przez warstwę granulowanego produktu ogrzanego powietrza o tak dobranej prędkości, że cała suszona masa zostaje uniesiona, tworząc stan „półzawieszony”, czyli fluidalny, w którym produkt zachowuje stałą swobodę ruchów i podlega intensywnemu mieszaniu, co powoduje, że wszystkie jego elementy są równomiernie owiewane czynnikiem suszącym (powietrzem)

Doskonalenie biotechnologicznych cech organizmów

• wyizolowane ze środowisk naturalnych lub pochodzące z kolekcji mikroorganizmy charakteryzują się aktywnością metaboliczną i innymi cechami technologicznymi często niewystarczającymi do zastosowania w procesie produkcyjnym

• celem doskonalenia cech technologicznych drobnoustrojów przemysłowych jest zwiększenie wydajności i produktywności procesu technologicznego, obniżenie kosztów surowcowych, a także podniesienie jakości otrzymanego produktu

Mutageneza

• jednym z podstawowych sposobów doskonalenia drobnoustrojów przemysłowych jest mutageneza i selekcja mutantów o cechach korzystnych dla danego procesu biotechnologicznego

• mutacja jest trwałą zmianą sekwencji DNA prowadząc do powstania zmian genetycznych natomiast mutageneza polega na indukowaniu mutacji w materiale genetycznym danego organizmu

• efektywnośc procesu mutagenezy zależy od rodzaju użytego czynnika, jego stężenia, fazy wzrostu i warunków hodowli drobnoustroju przed poddaniem komórek działaniu mutagenu, skład środowiska w trakcie trwania procesu, a także sprawności mechanizmów naprawczych

• mutageny są to związki chemiczne lub rodzaj promieniowania, które powodują wzrost częstotliwości mutacji w organizmie, często związany ze wzrostem śmiertelności komórek, dlatego też zarówno dawka mutagenu jak i czas jej działania muszą być dokładnie dobrane.

Rekombinacja genetyczna

• jest to proces, w wyniku którego powstają nowe układy genów. Stanowi ona bardziej racjonalny, w porównaniu z mutagenizacją, sposób doskonalenia szczepów przemysłowych.

• Może być ona realizowana dwojako:

- przez hybrydyzację, czyli krzyżowanie szczepów

- przez konstruowanie sztucznych kombinacji genów in vitro i uzyskiwanie ekspresji zaprogramowanej informacji genetycznej w komórkach wybranego gospodarza

Hybrydyzacja

• polega na wymianie odcinków DNA (rekombinacji) między chromosomami lub genoforami dawcy i biorcy w procesie określanym jako crossing - over, wskutek czego można otrzymać rekombinanty o zmienionym genotypie i nowych właściwościach metabolicznych

• obok wydajności określonego metabolitu hybrydyzacja poprawia wiele ważnych cech technologicznych szczepów przemysłowych (szybkość wzrostu, zdolność do przyswajania różnych substratów, tworzenie produktów ubocznych, plon biomasy, właściwości reologiczne hodowli)

Elektroporacja i elektrofuzja

• błona cytoplazmatyczna zapewnia integralność komórki, a jednocześnie jest przenośnikiem substancji i sygnałów metabolicznych między cytoplazmą i środowiskiem

• konsekwencje naruszenia ciągłości błony komórki poddanej impulsowi elektrycznemu są dwojakie:

- elektroporacja: do komórki mogą przeniknąć substancje nieprzechodzące przez błonę natywną

- elektrofuzja: jeżeli impuls stosowany jest w stosunku do komórek ustawionych wzdłuż linii pola i znajdujących się w bliskim kontakcie, może dojść do wymieszania się błon w regionie kontaktu, utworzenia mostka cytoplazmatycznego między różnymi komórkami i wspólnej błony otaczającej cytoplazmy uprzednio oddzielonych komórek, czyli do fuzji komórek