Szczepionki

Szczepionka - produkt pochodzenia biologicznego zawierający substancje zdolne do indukcji określonych procesów immunologicznych, warunkujących powstanie trwałej odporności bez wywołania działań toksycznych.

Idealna szczepionka powinna:

• zapobiegać pierwotnemu zakażeniu,

• przeciwdziałać namnażaniu drobnoustrojów w miejscu ich wniknięcia do organizmu i w innych tkankach,

• ułatwiać eliminację czynnika zakaźnego z organizmu oraz przyspieszać proces zdrowienia,

• zapobiegać rozwojowi i ograniczać nasilenie objawów chorobowych po zakażeniu,

• chronić przed siewstwem zarazka do środowiska,

• nie powodować krążenia atenuowanego drobnoustroju szczepionkowego między zwierzętami immunizowanymi i nieimmunizowanymi

• chronić płody przed infekcją,

• umożliwiać, w następstwie immunizacji ciężarnych samic, bierne uodpornienie osesków przez okres pierwszych 4-8 tygodni życia,

• uodparniać zwierzęta na cały czas tuczu lub co najmniej na pół roku,

• w przypadku szczepionek inaktywowanych zawierać adiuwant wzmacniający właściwości immunogenne antygenu i „ przyjazny” dla organizmu szczepionego zwierzęcia,

• umożliwiać odróżnienie zwierząt szczepionych od zakażonych.

Według kryteriów przyjętych w UE, szczepionka zostaje uznana za spełniającą kryteria immunogenności, jeżeli:

• co najmniej 80% zwierząt szczepionych nie wykazuje objawów klinicznych choroby po zakażeniu ich swoistym czynnikiem chorobotwórczym

• i jednocześnie 80% osobników kontrolnych (nieszczepionych) wykazuje objawy chorobowe po podaniu im analogicznej dawki czynnika patogennego.

Szczepionki:

1. - konwencjonalne

2. - nowej generacji.

Szczepionki konwencjonalne:

1. - żywe atenuowane

2. - zabite inaktywowane

3. - heterologiczne

4. - podjednostkowe.

Szczepionki nowej generacji:

1. - rekombinowane

2. - delecyjne (markerowe)

3. - wektorowe

4. - DNA

5. - antyidiotypowe

6. - syntetyczne

7. - jadalne.

Szcepionki żywe atenuowane:

• monowalentne - uodparniające przeciw jednemu patogenowi lub jego serotypowi

• poliwalentne - złożone.

Odporność powstaje szybko i na długi okres czasu.

Możliwe podawanie drogą naturalną.

Szczepionki zabite (inaktywowane):

• zarazek nie namnaża się w organizmie

• indukcja słabszej odporności

• wzmacniane adiuwantami

• aplikacja parenteralna powtarzana kilkakrotnie

• wyróżniamy szczepionki antytoksyczne zawierające inaktywowane formaliną toksyny zarazków (anatoksyny, toksoidy).

Szczepionki podjednostkowe:

Uzyskane przez dezintegracje patogenu, wyosobnienie i oczyszczenie oraz nadanie właściwej postaci białkom lub lipopolisacharydom, z adiuwantami, np. preparat przeciw kolibakteriozie.

Szczepionki heterologiczne:

Niektóre grupy zarazków, np. nosówki, odry i świnki wykazują krzyżowe pokrewieństwo antygenowe przy jednoczesnym silnym przystosowaniu tylko do jednego gospodarza,

np. podanie psu patogennego dla człowieka wirusa odry indukuje odporność na nosówkę.

• uodparnianie ptaków przeciw chorobie Mareka przy użyciu herpeswirusa indyków,

• immunizowanie kur na ospę wirusem ospy gołębi,

• immunizowanie świń na pomór klasyczny wirusem biegunki bydła.

Szczepionka z drobnoustrojem Żywym Inaktywowanym
Droga podania	parenteralnie i naśluzówkowo	s.c., i. m.
Rozwój odporności	szybko	wolniej
Liczba iniekcji	jedna	wiele
Trwanie odporności	długo	krócej
Trwałość preparatu	krótka	długa
Adiuwanty	nie	wymagane
Chorobotwórczość	możliwa	brak
Groźba uzjadliwienia	jest	brak

Szczepionki rekombinowane

Uzyskiwane na skutek rekombinacji genu heterologicznego w układach bakteryjnych np. w hodowli pałeczek okrężnicy

a. Gen X - wyizolowany z patogennego zarazka lub gdy znana jest sekwencja nukleotydów można syntetyzować go chemicznie

b. Wektor (plazmid), którego zadaniem jest wprowadzenie obcego genu do komórki, zabezpieczenie go przed zniszczeniem przez DNA-zy bakterii oraz umożliwienie mu replikacji i ekspresji. Wektor zawiera dodatkowo markery (np. Gen wrażliwości na tetracyklinę lub kodujący określony enzym barwiący) pozwalające na odróżnienie pałeczek okrężnicy, które przyjęły plazmid od pozostałych.

c. Układ ekspresyjny czyli hodowla pałeczek okrężnicy.

Ograniczenia tej metody:

• rekombinować tą metodą można tylko antygeny z epitopami liniowymi, czyli odtwarzać prostą sekwencję aminokwasów

• w bakteriach nie zachodzi zjawisko glikozylacji i w handlu jest jedynie niewiele preparatów tego typu.

Przykłady:

• szczepionki z fimbriami pałeczek okrężnicy

• szczepionka przeciwko białaczce kotów zawierająca glikoproteinę gp70

Szczepionki wektorowe

• w pierwszym etapie z zarazka wyosabnia się gen X, który koduje pożądany immunogen, a z wirusa wakcynii (wektor) gen kodujący kinazę tymidynową = TK+

• następnie do plazmidu wkleja się gen TK+, a do niego inny gen warunkujący replikację wirusa wakcynii i z tej racji zwany promotorem. Teraz przy pomocy promotora i w jego sąsiedztwo wkleja się gen X.

• przez to wbudowanie promotora i genu X, gen TK+ traci swoją aktywność i staje się dodatkowym markerem (TK-).

Przebieg rekombinacji:

• do układu ekspresyjnego - hodowli komórek (np. nerki świni) zakożonej wirusem wprowadzamy opisany wektor, wskutek czego w komórkach replikują zarówno wirus wakcynii, jak i wektor z heterologicznym genem X.

• ze względu na fakt, że u wirusów najpierw replikuje się kwas nukleinowy i białka otoczki, a potem dopiero dochodzi do składania całego wirusa zdarza się, że oprócz normalnych wirionów powstają rekombinanty (wiriony z nieaktywną kinazą tymidynową i zawierające gen X). Takie wiriony (odpowiednie markery zawarte w plazmidzie pozwalają je odróżnić od pozostałych) izoluje się, klonuje i używa jako szczepionki.

• zadaniem szczepionkowego wirusa-rekombinanta jest wprowadzenie genu X do wnętrza komórek szczepionego organizmu, w którym ulega on aktywacji i ekspresji.

Porównanie szczepionek rekombinowanych i wektorowych:

Szczepionkki rekombinowane - do organizmu wprowadzane jest immunogenne białko, które wyzwala odpowiedź immunologiczną.

Szczepionki wektorowe - do organizmu wprowadzany jest wektor i dopiero po ekspresji genu X pojawia się immunogenne białko, które inicjuje reakcje immunologiczną.

Szczepionki DNA:

• Szczepionka DNA to sekwencja DNA kodująca białko antygenowe drobnoustroju patogennego

• Po podaniu pacjentowi, po dotarciu do komórek DNA ulega ekspresji do białka

• Układ immunologiczny rozpoznaje białko antygenowe jako „obce” i wyzwala odp immunologiczną przeciwko niemu

• W ten sposób szczepionka DNA wyzwala odpowiedź immunologiczną na patogen.

Porównanie szczpionek DNA z tradycyjnymi:

Szczepionki DNA

• Zawierają tylko DNA kodujący białka drobnoustrojów

• Brak ryzyka rozwoju infekcji

• Stymulują rozwój odp humoralnej i komórkowej

• Długotrwała odporność

• Lodówka nie jest wymagana.

Tradycyjne szczepionki

• Osłabione lub zabite drobnoustroje

• Ryzyko przemiany osłabionego drobnoustroju w chorobotwórczy,

• Wywołują powstanie głównie odpowiedzi humoralnej

• Przechowywanie w lodówce.

Do konstrukcji szczepionek DNA wykorzystywane są plazmidy eukariotyczne (wektory) dostępne w ofercie firm biotechnologicznych. Często używany pcDNA3 (INVITROGEN)

Mechanizmy prowadzące do powstania odpowiedzi immunologicznej (szczepionki DNA):

Ekspresja antygenu zachodzi w

1. komórkach mięśni szkieletowych lub w keratynocytach skóry (prezentacja przez MHC I Ⴎ aktywacja Tc)

2. komórkach dendrytycznych (prezentacja przez MHC I i MHC II Ⴎ aktywacja Tc i Th).

Próby kliniczne:

• Szczepionka DNA przeciwko chorobie Aujeszkiego u świń (gen dla immunogennych glikoprotein gC i gD alfaherpeswirusa)

• Szczepionka DNA przeciwko pryszczycy została skonstruowana w oparciu o cDNA kompletnego genomu dzikiego wirusa typu A12

• Szczepionka przeciwko zakażeniom wirusem FIV u kotów (geny gp120 i p10 kodujące białka strukturalne wirusa)

• Szczepionka DNA przeciwko brucelozie (gen kodujący rybosomalne białka L7/L12 B. abortus.

Wady szczepionek DNA:

• Ograniczone do antygenów białkowych

• Nadekspresja może prowadzić do nadmiernej immunostymulacji i chronicznego zapalenia

• Przypadkowa insercja Ⴎ uszkodzenia ważnych genów, mutacje

• Insercja w onkogeny lub geny „supresory” nowotworów Ⴎ rozwój nowotworu

• Przeciwciała anty-DNA Ⴎ rozwój zjawisk autoimmunologicznych (zapalenie mięśni)

• Rozwój oporności na antybiotyki (plazmidowe geny selekcyjne).

Przyszłe projekty:

• Plazmidy szczepionkowe z wieloma genami - odporność na wiele drobnoustrojów uzyskiwana w wyniku jednego szczepienia.

• Trwają prace nad szczepionkami DNA przeciwko AIDS, wściekliźnie, malari.i

Szczepionki markerowe (delecyjne):

Zwierają mutanty, którym usunięto gen /y nieistotne dla ich replikacji w hodowli tkankowej. Stworzono je, aby możliwym było odróżnienie zwierząt szczepionych od zakażonych w sposób naturalny:
zakażenie naturalne - wykrycie p-ciał dla białka kodowanego przez usunięty gen
szczepienie delecyjne- brak tych p-ciał.
np. szczepionki delecyjne przeciwko chorobie Aujeszkyego i BHV-1

Szczepionki syntetyczne:

Osobna grupa (nie są otrzymywane metodami biotechnologicznymi.).

Wytwarzane są w procesach syntetyzy chemicznej in vitro, syntezie podlegają jedynie epitopy o liniowej strukturze (t. błonicza, tężcowa) - ograniczone zastosowanie.

Szczepionki antyidiotypowe:

A P-Ab1 ( idiotyp-Fab, czyli lustrzane odbicie A)

Gdy P aplikujemy osobnikowi innego gat. wytworzą się

kolejne P-Ab2 (odpowiadające idiotypowi-Fab)= P

Antyidiotypowe = sz. antyidiotypowa

*mogą to być tylko p-ciała monoklonalne- o ściśle

zdefiniowanej swoistości mogące indukować odpowiedź immunologiczną.

Sposoby optymalizacji efektywności szczepień:

• wzmocnienie imunogenności preparatu - do plazmidu wprowadza się geny kodujące cytokiny lub ich kombinacje np. IL-2,czynniki wzrostu lub chemokiny

• dostosowanie struktury szczepionki do patogenezy danego zarazka - klasyczny pomór świń, ospa (główną rolę odgrywają p-ciała - szczepionka ma stymulować limfocyty Th2) zaś rinowirus, influenza, choroba Aujeszkyego (ochronną role pełni cytotoksyczność -Th1)

• prace nad uzyskaniem szczepionek śluzówkowych - indukują one odporność w miejscu wnikania zarazków, wymagają jednak silnych adiuwantów (ciepłochwiejna toksyna pałeczki okrężnicy LT i toksyna Vibrio cholerae).

Co to znaczy brak skuteczności szczepionki?

• Kiedy pojedyncze zwierzę po szczepieniu nie nabędzie zadowalającej odporności.

• Kiedy liczne zwierzęta nie nabędą zadowalającej odporności.

Od czego zależy skuteczność szczepień?

1. Od cech szczepionki

2. Od natury drobnoustroju

3. Od drogi podania

4. Od reakcji szczepionego zwierzęcia

5. Od okoliczności szczepienia.

Cechy szczepionki a jej skuteczność:

• immunogenność szczepu (antygenu)

• warunki przechowywania - temperatura: szczepionka przeciwko nosówce traci 90% wirusa:

- w 6 st. C po roku

- w 22 st C po miesiącu

- w 37 st C po 4-5 dniach

• poliwalentne czy monowalentne.

Natura drobnoustrojów a skuteczność szczepień:

• istnieją drobnoustroje mało zmienne antygenowo ( wścieklizna, nosówka)

• duża zmienność utrudnia szczepienie przeciwko pryszczycy, grypie, kaliciwirozie kotów, a uniemożliwia czynną imunizację przeciwko przeciw retrowirusom (NZK)

• cząść drobnoustrojów jest bardziej immunogenna (parwowirusy) część mniej (herpes).

Drogi podania szczepionek a ich skuteczność:

• większość podajemy - s.c. lub i.m.

• niektóre podajemy na błony śluzowe - doustnie, donosowo, aby pobudzić miejscową odporność błon śluzowych w bramie wejścia drobnoustroju

• podanie areogenne.

Reaktywność zwierzęcia a skuteczność szczepień:

A. Immunosupresja

• Wrodzone defekty immunologiczne

• Stres: transport, zmiana żywienia, choroby i zaburzenia subkliniczne (pasożyty), złe warunki zoohigieniczne

B. Błędy człowieka

• Technika podawania szczepionki

• Błędne oszacowanie wieku

• Niezauważenie choroby lub innych stresorów

• Nieprzestrzeganie programu szczepień - różyca, grypa koni.

Strategia DIVA

(Odróżnianie zwierząt zakażonych od szczepionych):

Szczepionki delecyjne oparte na drobnoustrojach pozbawionych zazwyczaj jednego lub kilku białek antygenowych, które posiada zarazek zjadliwy (marker ujemny). Wprowadzenie do zarazka szczepionkowego dodatkowego białka (marker dodatni) jest nieprzydatne- wykrywamy zwierzęta zarażone wśród szczepionych a nie odwrotnie!!!

Pomocne są specjalne testy serologiczne do wykrywania p-ciał przeciwko antygenom usuniętym z zarazków szczepionkowych, które występują u zwierząt szczepionych jak np.test ELISA.

Testy te umożliwiają także ocenę krążenia zjadliwych szczepów danego zarazka w populacji zwierząt szczepionych oraz ocenę skuteczności szczepionek w warunkach terenowych.

Przykład: szczepionka przeciw chA. Zawiera ona mutanta delecyjnego, dokonywano delecji genu dla Ig-E. Świnie immunizowane takimi szczepionkami nie wytwarzają p-ciał anty-IgE, co pozwala na odróżnienie tych zakażonych od szczepionych.

Sczepionki jadalne:

Organizmy genetycznie modyfikowane:

Obce DNA można wprowadzać do genomu zarodków = mutanty o trwale zmienionym genetycznie genomie.

Zastosowanie znajdują mutanty roślinne:

• transgeniczne ziemniaki i pomidory - epitopy enterotoksyny E. Coli

• transgeniczna fasola - gen kodujący białko kapsomeru parwowirusa psów.

Większość czynników zakaźnych wnika do organizmu przez błony śluzowe. Najbardziej efektywnym sposobem zapoczątkowania miejscowej, humoralnej odpowiedzi immunologicznej związanej z błonami śluzowymi (MALT) jest bezpośrednie wprowadzenie szczepionki na błonę śluzową przewodu pokarmowego. Dochodzi wtedy do pobudzenia miejscowego wytwarzania IgA, które wydzielane do śluzu chronią przewód pokarmowy przed czynnikami zakaźnymi wnikającymi tą drogą.

Parenteralne podanie szczepionki zwykle indukuje ogólną odpowiedź immunologiczną, nie pobudzając w wystarczającym stopniu odpowiedzi miejscowej.

Udowodniono, że szczepionki podawane doustnie indukują zarówno miejscową jak i ogólną odpowiedź organizmu. Problemem w uodparnianiu doustnym jest możliwość degradacji antygenu szczepionkowego w przewodzie pokarmowym. Jadalne szczepionki pozwalają na ominięcie tego problemu - roślinna ściana komórkowa chroni antygen i pozwala na jego powolne uwalnianie. Obce DNA można wprowadzać do genomu zarodków = powstają mutanty o trwale zmienionym genomie.

Metody wprowadzenia obcego genu do komórki roślinnej:

1. Do plazmidu pTi, występującego naturalnie u bakterii Agrobacterium tumefaciens zakażającej rośliny dwuliścienne wprowadza się gen kodujący białko antygenu szczepionkowego. Plazmid ten przenoszony jest do kom. Roślinnych, gdzie integruje się z

DNA jądrowym.

2. Włączenie odpowiednich genów czynników zakaźnych do DNA chloroplastów

3. Wykorzystanie wirusów roślinnych - wirus zawierający w swym genomie obcy gen zakaża komórkę roślinną.

Losy szczepionkowego białka w komórce roślinnej:

• oczyszczone może być wykorzystane do produkcji tabletek lub kapsułek do podania p.o. - najdroższa metoda

• doustne podanie antygenu w przetworzonej tkance roślinnej - owoce i warzywa poddaje się odwodnieniu, aby uzyskać wyższe stężenie antygenu i chronić go przed degradacją - zliofilizowany proszek w kapsułkach

• stosowanie nieprzetworzonego materiału roślinnego, zawierającego antygen szczepionkowy - podawanie ziaren kukurydzy świniom, u których kukurydza stanowi część diety.

Cechy białka wykorzystywanego jako antygen szczepionkowy:

• dostarczane w surowym materiale roślinnym

• jego koncentracja musi być znana i jednolita

• stabilne w warunkach w jakich pasza jest przygotowywana.

Zastosowanie szczepionek jadalnych:

• pryszczyca

• wirusowa biegunka bydła - BVD

• grypa ptaków i pomór rzekomy drobiu (ch. Newcastle)

• transgeniczne ziemniaki i pomidory - zawierające epitopy enterotoksyny E. Coli

• transgeniczna fasola - zawierająca gen kodujący białko kapsomeru parwowirusa psów.

Zalety:

• w wielu przypadkach nie ma niebezpieczeństwa rozprzestrzeniania się choroby lub zanieczyszczenia środowiska wektorem szczepionkowym

• nie są potrzebne zwierzęta do produkcji szczepionki, a szczepionki roślinne są wolne od patogenów zwierzęcych

• bezpieczne: brak interakcji między roślinnym a zwierzęcym DNA, a zrekombinowane wirusy roślinne nie mają zdolności wnikania do kom. zwierzęcych

• odwodniony antygen szczepionkowy może być przechowywany przez długi czas w temp. pokojowej.

Wady:

• czas potrzebny do uzyskania linii roślin transgenicznych, wykazujących stałą ekspresję pożądanego genu

• ograniczona liczba kandydatów na antygeny podjednostkowe

• obawa opinii publicznej przed GMO - niekontrolowane przekazywanie obcego genu

• pojawienie się tolerancji immunologicznej w stosunku do białka szczepionkowego

• odpowiednie przechowywanie, aby uniknąć psucia lub zakażenia transgenicznych warzyw, owoców czy zboża.

---