LABOLATORIUM Z BIOCHEMII

ĆWICZENIE NR 4:

Kwasy nukleinowe

Data wykonania doświadczeń: 31.03.2011r.

Data oddania sprawozdania: 07.04.2011r.

Grupa:

Dominika Kępska 157085

Justyna Dąbrowska

Kierunek: Biotechnologia

Grupa dziekańska: III

Semestr IV

Wstęp teoretyczny

Kwasy nukleinowe- to wielocząsteczkowe polimery nukleotydów. Należą do podstawowych składników komórek zwierzęcych, roślinnych i drobnoustrojów. Wyróżniamy:

• RNA (kwasy rybonukleinowe- zawierające β-D-rybofuranozę ; występujące głównie w rybosomach)

β-D-rybofuranoza

• DNA (kwasy deoksyrybonukleinowe- zawierające 2-deoksy-β-D-rybofuranozę; obecne przede wszystkim w jądrze komórkowym)

2-deoksy-β-D-rybofuranoza

Nukleotyd- to podstawowa jednostka strukturalna kwasów nukleinowych. Składa się z: zasady azotowej (purynowej lub pirymidynowej)- pełniącej funkcję nośnika informacji genetycznej, składnika cukrowego- pentozy (rybozy lub deoksyrybozy) oraz kwasu ortofosforowego- nadającego charakter kwaśny kwasom nukleinowym i pełniącego funkcję strukturalną.

Zasady azotowe występujące w kwasach nukleinowych to:

Zasady purynowe:

adenina guanina

Zasady pirymidynowe:

cytozyna uracyl tymina

Wolne kwasy nukleinowe mają charakter kwaśny, dzięki czemu dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, słabo w wodzie, rozcieńczonych kwasach i alkoholu.

Wykazywanie obecności kwasów nukleinowych opiera się na reakcjach charakterystycznych ich składników, uwolnionych w wyniku hydrolizy pod działaniem mocnych kwasów i podwyższonej temperatury. Do odróżnienia DNA od RNA ( na podstawie składnika cukrowego) służy reakcja Dischego z difenyloaminą.

Część doświadczalna

1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.

Opis doświadczenia: Do 0,5ml 0,1% roztworów RNA i DNA dodajemy kroplami 1N HCl . Następnie dodajemy roztwór NaOH. Do 1ml 0,1% roztworów DNA i RNA dodajemy 2ml 96% etanolu.

Obserwacje: Po dodaniu kwasu do roztworów RNA i DNA - w obu probówkach- wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych. Po dodaniu zasady- w obu probówkach obserwujemy rozpuszczenie się osadu. Po dodaniu etanolu do roztworów RNA i DNA również obserwujemy wytrącenie się białego osadu kwasów nukleinowych w obu probówkach.

Wnioski i zasada: Kwasy nukleinowe mają charakter kwaśny (dzięki obecności kwasu ortofosforowego w nukleotydach) co oznacza, ze są dobrze rozpuszczalne w roztworach zasad, natomiast są słabo rozpuszczalne w wodzie, rozcieńczonych kwasach i alkoholu.

2.2. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych.

Opis doświadczenia: 2,5ml 1% roztworu kwasów nukleinowych (RNA i DNA w osobnych probówkach) ogrzewamy we wrzącej łaźni wodnej z 2,5ml 10% H­₂SO₄ w ciągu jednej godziny.

Zasada: Pod wpływem mocnych kwasów mineralnych (H­₂SO₄) i podwyższonej temperatury(100°C) składniki kwasów nukleinowych zostają uwolnione na drodze hydrolizy. Uzyskujemy wolne zasady purynowe i nukleotydy pirymidynowe. Uzyskane hydrolizaty służą nam do dalszych prób.

2.3. Wykrywanie pentoz w hydrolizatach kwasowych.

2.3.1. Reakcja orcynolowa.

Opis doświadczenia: Do probówek zawierających po 1ml :

1. hydrolizatu RNA

2. hydrolizatu DNA

3. 0,1% roztworu RNA

4. 0,1% roztworu DNA

5. 1% roztworu rybozy

6. 1% roztworu deoksyrybozy

dodajemy po 1ml odczynnika orcynolowego, a następnie umieszczamy we wrzącej łaźni wodnej na 15minut. Po upływie tego czasu wyjmujemy probówki z powyższymi roztworami, chłodzimy je, a następnie do każdej próby dodajemy po 5ml wody destylowanej.

Obserwacje: We wszystkich próbach wystąpiło zabarwienie. W każdym przypadku obserwujemy roztwór o innym odcieniu zieleni (od ciemnomorskiego do jasnooliwkowego).

Wnioski: Wszystkie wyżej wymienione roztwory zawierają cukier- pentozę, która zostaje wykryta w wyniku reakcji Biala z orcyną. Na tej podstawie wykrywamy również kwas nukleinowy, w którym zawarty jest składnik cukrowy- pentoza.

Zasada: Pentozy wolne oraz związane w nukleozydach, ogrzewane ze stężonym HCl przechodzą w furfural (cyklizacja pentoz w środowisku kwasowym), który z orcyną i jonami Fe⁺³ tworzy trwały kompleks o barwie zielonej.

2.3.2. Reakcja Dischego.

Opis doświadczenia: Do probówek zawierających po 1ml:

1) hydrolizatu RNA

2) hydrolizatu DNA

3) 0,1% roztworu RNA

4) 0,1% roztworu DNA

5) 1% roztworu rybozy

6. 1% roztworu deoksyrybozy

dodajemy po 2ml odczynnika difenyloaminowego, a następnie umieszczamy je we wrzącej łaźni wodnej na 10minut.

Obserwacje: W probówkach zawierających: hydrolizat DNA, 0,1% roztwór DNA i 1% roztwór deoksyrybozy pojawia się niebieskie zabarwienie. W pozostałych probówkach znajdują się bezbarwne roztwory.

Wnioski: Niebieskie zabarwienie pojawia się w obecności deoksyrybozy.

Zasada: Powyższa reakcja jest stosowana w celu odróżnienia rybozy od deoksyrybozy. DNA i deoksyryboza wolna oraz związana z zasadą purynową ulegają barwnej reakcji z difenyloaminą.

2.3.3. Wykrywanie kwasu fosforowego.

Opis doświadczenia: 0,5ml hydrolizatu DNA zobojętniamy roztworem amoniaku (dodając 3 krople stężonego roztworu). Następnie dodajemy 0,5ml stężonego roztworu HNO₃ i 2ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówki ogrzewamy do wrzenia.

Obserwacje: W probówce zawierającej powyższą mieszaninę wytrącił się żółty osad fosfomolibdenianu amonowego.

Wnioski: Wytrącenie się żółtego osadu fosfomolibdenianu amonowego potwierdza obecność kwasu fosforowego- zawartego w DNA.

Zasada:

2.4. Wykrywanie zasad purynowych.

Opis doświadczenia: Do 1ml hydrolizatu RNA dodajemy 6 kropli stężonego amoniaku i 3ml amoniakalnego roztworu azotanu srebra.

Obserwacje: Obserwujemy wytrącony, szary osad w objętości całego roztworu.

Wnioski: Wytrąconym osadem jest nierozpuszczalny w amoniaku osad soli srebrowych puryn.

Zasada: Stężony amoniak użyty do tej reakcji-tworzy zasadowe środowisko- sprzyjające dobrej rozpuszczalności kwasów nukleinowych, które mogą przereagować z azotanem srebra i utworzyć osad soli srebrowych puryn.

2.5. Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Opis doświadczenia: Na początku przygotowujemy surowiec do pomiaru spektrofotometrycznego. W tym celu do 5g kostki: „Bulion na włoszczyźnie” dodajemy 75ml wody destylowanej i gotujemy we wrzącej łaźni wodnej przez 10minut. Następnie studzimy i przesączamy do kolby miarowej o pojemności 100ml przez gazę młyńską. Uzupełniamy wodą destylowaną do kreski. Po wymieszaniu sączymy roztwór przez sączek bibułowy. Badany roztwór rozcieńczamy roztworem 0,1N HCl, dodając do 0,5ml tego roztworu 9,5ml kwasu. W tak przygotowanym roztworze oznaczamy zawartość zasad purynowych dokonując pomiaru absorbancji przy następujących długościach fali: 262nm i 290nm dla adeniny oraz 249nm i 290nm dla guaniny. Są to maksymalne wartości pochłaniania i 290nm.

Wyniki absorbancji (dla poszczególnych kostek bulionowych):

Kostka bulionowa	Różnica ekstynkcji w maksimum absorpcji i w długości fali równej 290nm dla adeniny ΔE(262-290)	Różnica ekstynkcji w maksimum absorpcji i w długości fali równej 290nm dla guaniny ΔE(249-290)	Zawartość adeniny w analizowanej kostce bulionowej w mg/g produktu	Zawartość guaniny w analizowanej kostce bulionowej w mg/g produktu
Bulion grzybowy Knorr	0,248	0,175	1,102	1,532
Bulion grzybowy Winiary	0,311	0,258	1,382	2,258
Rosół drobiowy Winiary	0,143	0,144	0,636	1,260
Bulion na włoszczyźnie	0,118	0,115	0,524	1,007
Rosół z kury Kucharek	0,235	0,241	1,044	2,109
Bulion cielęcy Knorr	0,322	0,311	1,431	2,722
Rosół wołowy Knorr	0,081	0,046	0,360	0,403
Rosół z kury Knorr	0,146	0,071	0,649	0,621

Przykładowe obliczenia do powyższej tabeli (na podstawie wyników dla badanej przez nas kostki bulionowej- „Bulion na włoszczyźnie”):

Dla adeniny:

ΔE_(262-290)

0,292A-0,174A=0,118A

Dla guaniny:

ΔE_(249-290)

0,289A-0,174A=0,115A

Zawartość adeniny w analizowanej kostce bulionowej w mg/g produktu obliczamy układając następującą proporcję:

10μg/ml-0,9

x-0,118

x=(0,118*10μg/ml)/0,9

x=1,31μg/ml

Następnie uwzględniamy rozcieńczenie mnożąc uzyskany wynik przez 20.

x₁= 1,31*20=26,22μg/ml

Aby uzyskać wynik w μg powyższy wynik mnożymy przez objętość kolby miarowej do której sączyliśmy roztwór przez gazę młyńską i uzupełnialiśmy go wodą destylowaną do kreski.

x₂= 26,22μg/ml* 100ml=2622μg

Tak oznaczona zawartość zasady znajdowała się w 5g produktu, aby oznaczyć jej zawartość w 1g zapisujemy:

2622μg-5g

x₃-1g

x₃=(2622μg*1g)/5g=524,4μg/g = 0,524mg/g

Zawartość guaniny w analizowanej kostce bulionowej w mg/g produktu obliczamy układając następującą proporcję:

10μg/ml-0,457

x-0,115

x=(0,115*10μg/ml)/0,457

x=2,52μg/ml

Następnie uwzględniamy rozcieńczenie mnożąc uzyskany wynik przez 20.

x₁= 2,52μg/ml *20=50,33μg/ml

Aby uzyskać wynik w μg powyższy wynik mnożymy przez objętość kolby miarowej do której sączyliśmy roztwór przez gazę młyńską i uzupełnialiśmy go wodą destylowaną do kreski.

x₂= 50,33μg/ml* 100ml=5033μg

Tak oznaczona zawartość zasady znajdowała się w 5g produktu, aby oznaczyć jej zawartość w 1g zapisujemy:

5033μg-5g

x₃-1g

x₃=(5033μg*1g)/5g=1006,6μg/g = 1,007mg/g

Analogicznie obliczamy zawartości zasad purynowych dla innych kostek bulionowych.

Wnioski: „Rosół wołowy Knorr” jest najzdrowszą kostką bulionową, gdyż zawartość obu zasad purynowych jest w nim najniższa. Najbardziej szkodliwa jest kostka „Bulion cielęcy Knorr”- obecne są w niej zasady purynowe w największej ilości. Zasady purynowe zawarte w kwasach nukleinowych powyższych produktów w obecności swoistych enzymów są utleniane przez hipoksantynę i ksantynę do kwasu moczowego, wydalanego z organizmu wraz z moczem. Zaburzenia w przemianie puryn odgrywają duża rolę w powstawaniu takich zmian patologicznych jak dna (podagra), altretyzm, kamica moczanowa.

2.6.Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową.

2.6.1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych.

Opis doświadczenia: 5g wątroby oraz 2g mleczu ze śledzia homogenizujemy z 50ml zimnego 10% kwasu trójchlorooctowego. Homogenat odwirowujemy. Kwas trójchlorooctowy ekstrahuje niskocząsteczkowe związki kwasorozpuszczalne (nukleotydy, aminokwasy, estry fosforanowe). W osadzie znajdują się białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Supernatant usuwamy. Do osadu dodajemy 30ml 0,6M roztworu kwasu nadchlorowego. Mieszaninę ogrzewamy przez 15min w łaźni wodnej o temperaturze 90°C stale mieszając. Pod wpływem ogrzewania z roztworem HClO₄ kwasy nukleinowe- uwolnione od białka- hydrolizują do związków kwasorozpuszczalnych, przechodząc do roztworu. Po ostudzeniu odwirowujemy osad zawierający białko, a supernatant- przenosimy ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50ml. Zawartość kolby uzupełniamy kwasem nadchlorowym do kreski i mieszamy. W ten sposób otrzymujemy ekstrakt do oznaczania zawartości DNA.

2.6.2. Oznaczanie zawartości DNA metodą z difenyloaminą.Obserwacje:

Opis doświadczenia: Przygotowujemy 3 próby:

• badaną (1ml ekstraktu kwasów nukleinowych+ 1ml wody destylowanej)

• wzorcową (1ml wzorcowego DNA( o stężeniu 200μg/ml)+ 1ml wody destylowanej)

• odczynnikową (2ml wody destylowanej)

Do każdej próby dodajemy po 4ml odczynnika difenyloaminowego. Wszystkie próby wstawiamy jednocześnie do wrzącej łaźni wodnej. Inkubujemy przez 10minut. Następnie próby chłodzimy, mierzymy absorbancję prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej na spektrokolorymetrze przy długości fali 600nm.

Wyniki doświadczenia:

Wynik absorbancji dla próby wzorcowej (mierzonej wobec próby odczynnikowej) przy długości fali równej 600nm W=0,245

Kolejne pomiary absorbancji prób badanych dla ekstraktu z wątroby (mierzonej wobec próby odczynnikowej) przy długości fali równej 600nm wynoszą:

W₁=0,268

W₂=0,207

W₃=0,242

Średnia arytmetyczna z absorbancji prób badanych dla ekstraktu z wątroby (użyta w poniższych obliczeniach) wynosi:

W_śr=0,239

Wyliczamy stężenie DNA w próbie badanej dla średniej wartości absorbancji.

stężenie wzorcowego DNA zawartego w próbie wzorcowej- absorbancja dla próby wzorcowej

200μg_DNA/ml- 0,245

x -0,239

x=(200μg_DNA/ml *0,239)/0,245

x=195,1μg_DNA/ml

Następnie mnożymy przez 50ml czyli objętość roztworu TCA, w którym nastąpiła homogenizacja. W ten sposób wyliczamy ilość DNA w próbie badanej po uwzględnieniu objętości roztworu TCA użytego do homogenizacji.

x₁=195,1μg_DNA/ml *50ml=9755μg_DNA

Obliczona ilość DNA odpowiada 5g ekstraktu z wątroby. Dla 100g wyjściowego surowca zawartość DNA wynosi:

9755μg_DNA -5g_{wyjściowego surowca-wątroby}

x-100g_{wyjściowego surowca-wątroby}

x=(9755μg_DNA *100g_{wyjściowego surowca-wątroby})/5g_{wyjściowego surowca-wątroby}=195100μg_DNA =195,1mg_DNA

Kolejne pomiary absorbancji prób badanych dla ekstraktu z mleczu śledzia (mierzonej wobec próby odczynnikowej) przy długości fali równej 600nm wynoszą:

Mś₁=0,647

Mś₂=0,548

Mś₃=0,570

Mś₄=0,599

Średnia arytmetyczna z absorbancji prób badanych dla ekstraktu z mleczu śledzia (użyta w poniższych obliczeniach) wynosi:

Mś _śr=0,591

Wyliczamy stężenie DNA w próbie badanej dla średniej wartości absorbancji.

stężenie wzorcowego DNA zawartego w próbie wzorcowej- absorbancja dla próby wzorcowej

200μg_DNA/ml - 0,245

x -0,591

x=(200μg_DNA/ml *0,591)/0,245

x=482,4μg_DNA/ml

Następnie mnożymy przez 50ml czyli objętość roztworu TCA, w którym nastąpiła homogenizacja. W ten sposób wyliczamy ilość DNA w próbie badanej po uwzględnieniu objętości roztworu TCA użytego do homogenizacji.

x₁=482,4μg_DNA/ml *50ml=24120μg_DNA

Obliczona ilość DNA odpowiada 2g ekstraktu z mleczu śledzia. Dla 100g wyjściowego surowca zawartość DNA wynosi:

24120μg_DNA -2g

x-100g

x=(24120μg_DNA *100g)/2g=1206000μg_DNA =1206mg_DNA=1,206g_DNA

Tabela nr 2

Tytuł tabeli: Zawartość DNA w 100g produktu wyrażona w mg wyliczona dla ekstraktu z wątroby i ekstraktu z mleczu śledzia na podstawie ich absorbancji średniej.

Produkt	Absorbancja-wartość średnia	Zawartość DNA w 100g produktu [mg]
Ekstrakt z wątroby	0,239	195,1
Ekstrakt z mleczu śledzia	0,591	1206

Wnioski: W ekstrakcie z mleczu śledzia jest ponad 6razy więcej DNA (w tym 3razy więcej zasad purynowych) niż w ekstrakcie z wątroby. Zasady purynowe zawarte w kwasach nukleinowych powyższych ekstraktów w obecności swoistych enzymów- w organizmie człowieka- są utleniane przez hipoksantynę i ksantynę do kwasu moczowego, wydalanego z organizmu wraz z moczem. Zaburzenia w przemianie puryn odgrywają duża rolę w powstawaniu takich zmian patologicznych jak dna (podagra), altretyzm, kamica moczanowa. Kwas trójchlorooctowy ekstrahuje niskocząsteczkowe związki kwasorozpuszczalne (nukleotydy, aminokwasy, estry fosforanowe). Po usunięciu supernatantu- w osadzie znajdują się białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Pod wpływem ogrzewania z roztworem HClO₄ kwasy nukleinowe- uwolnione od białka- hydrolizują do związków kwasorozpuszczalnych (nukleotydów, aminokwasów i estrów fosforanowych), przechodząc do roztworu. Po ostudzeniu otrzymujemy osad zawierający białko i supernatant-który uzupełniamy kwasem nadchlorowym- otrzymując w ten sposób ekstrakt do oznaczania zawartości DNA.

Zasada oznaczania: Deoksyryboza, budująca DNA w połączeniu z odczynnikiem difenyloaminowym- zawierającym stężony kwas octowy- daje niebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do ilości DNA w próbie.

1

8

---