BIOTECHNOLOGIA

Wiesław Przybylski

WYKŁAD 1 7.10.10r.

Znaczenie gospodarcze i społeczne biotechnologii we współczesnym świecie

Konwencja o różnorodności biologicznej ONZ: biotechnologia oznacza zastosowanie technologiczne, które używa systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników, żeby wytwarzać lub modyfikować produkty lub procesy o określonym zastosowaniu.

Biała biotechnologia - zastosowanie w przemyśle. Wykorzystuje ona żywe komórki, np. pleśni, bakterii oraz enzymy do wytwarzania nowych produktów lub inicjowania procesów przetwórczych. Mikroorganizmy wykorzystywane w białej biotechnologii są zwykle zmodyfikowane przy zastosowaniu inżynierii genetycznej.

Czerwona biotechnologia jest związana z medycyną i ochroną zdrowia, a wykorzystuje się ją przy tworzeniu nowych leków, w diagnostyce, profilaktyce i leczeniu dotychczas nieuleczalnych chorób. Ulepszone mikroorganizmy wytwarzają antybiotyki, witaminy, szczepionki i białka na użytek medycyny. Preparaty biotechnologiczne stanowią obecnie ok 20% sprzedawanych lekarstw.

Biotechnologia czerwona - „zielona rewolucja” w rolnictwie

Wykorzystanie:

• ulepszanie gatunków roślin uprawnych o dużym znaczeniu gospodarczym

Zmodyfikowane zostało większość roślin mających znaczenie dla człowieka

Cele modyfikacji:

• 
  
  
  
  
  odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin (soja, rzepak)

• 
  
  odporność na szkodniki - modyfikacja Bt (kukurydza, bawełna)

• odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne

• 
  
  
  
  
  
  odporność na niekorzystne warunki środowiska

• poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych

WYKŁAD 2 14.10.2010r.

BIOLOGICZNE PODSTAWY PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH

Mikroorganizmy w biotechnologii

Pozyskiwanie szczepów o znaczeniu technologicznym (skrining), obejmuje zespół zabiegów mających na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby możliwych drobnoustrojów tych, które odpowiadają stawianym wymaganiom technologicznym.

Mikroorganizmy o użytecznych właściwościach technologicznych stanowią nieznaczną część ich ogólnej populacji w badanej próbce. Z tego powodu niezbędna jest wstępna obróbka próbki w celu wzbogacenia udziału drobnoustrojów o poszukiwanych cechach.

Charakterystyka oraz kryteria doboru organizmów

O powodzeniu mikrobiologicznej produkcji różnych metabolitów jest wyselekcjonowanie spośród wielu gatunków i rodzajów mikroorganizmów odpowiednio aktywnego szczepu produkcyjnego.

Szczepy takie, powinny odpowiadać następującym kryteriom:

• muszą być niepatogenne

• nie mogą wytwarzać toksycznych metabolitów

• muszą wykazywać stabilność biologiczną (nie ulegać degeneracji)

Ocena cech użytkowych drobnoustrojów przemysłowych

• wydajność i szybkość tworzenia produktu

• wzmożona produkcja określonych metabolitów oraz nadawanie prawidłowych cech organoleptycznych produktom

• szybkość wzrostu

• stabilność genetyczna i fenotypowa oraz fagooporność

• wymagania pokarmowe oraz tolerancje na zmienne warunki środowiska

• czystość i łatwość wydzielania wytworzonego produktu

Skrining szczepów

• Najstarsza metoda skriningu szczepów produkcyjnych to izolowanie ich ze środowisk naturalnych (gleba oraz produkty naturalne). Występujące w nich bakterie, promieniowce i grzyby mikroskopowe zdolne do biosyntezy (antybiotyków), rozkładu (białek) czy biotransformacji (związków steroidowych).

• Mniej typowe źródła drobnoustrojów: zbiorniki wodne o bardzo dużym zasoleniu, miejsca stale zanieczyszczane ropą naftową, okolice gejzerów, odpady poflotacyjne zakładów przerabiających rudy metali ciężkich.

Metody otrzymywania czystych kultur

• metoda rozcieńczeń Listera,a następnie metoda płytkowa Kocha (→ metoda posiewu redukcyjnego → metoda posiewu powierzchniowego → metoda wgłębna, czyli płytek lanych)

• metoda kropelkowa Lindnera (stosowana głównie w przypadku czystych kultur drożdży i grzybów strzępkowych)

• metoda izolowanie czystych kultur z zastosowaniem mikromanipulatora (zalecana w badaniach naukowych)

• pomocnicze metody wyodrębniania czystych kultur, bazujące na wykorzystaniu różnic fizjologicznych i biochemicznych drobnoustrojów

Stabilność cech drobnoustrojów przemysłowych

Powtarzalność procesów biotechnologicznych

• zabezpieczenie czystości mikrobiologicznej

• zabezpieczenie maksymalnej żywotności szczepów drobnoustrojów przemysłowych

• utrzymanie pożądanych cech technologicznych

• w czasie przechowywania ważne jest, aby pozostałe przy życiu komórki charakteryzowały się cechami biotechnologicznymi na poziomi kultury wyjściowej - należy tak dobrać warunki przechowywania, aby zachować w możliwie najwyższym stopniu wszystkie cechy biologiczne i technologiczne mikroorganizmów

• nie ma metody uniwersalnej, którą można by zastosować we wszystkich sytuacjach

• stosunkowo najłatwiej przechowują się drobnoustroje wytwarzające zarodniki lub przetrwalniki, natomiast znaczenie trudniej wegetatywne formy bakterii i fragmenty grzybni wegetatywnej promieniowców i grzybów strzępkowych

• najprostszy sposób przechowywania drobnoustrojów to umieszczenie namnożonej hodowli w postaci skosów agarowych w temp. +4st. C, gdzie mogą zachowywać żywotność i aktywność biochemiczną od 2 tygodni (bakterie) do kilku miesięcy (grzyby strzępków). Odcięcie dostępu tlenu przedłuża czas przechowywania kultur na skosach.

Stosowana metoda przechowalnicza powinna

• zapewnić maksymalną przeżywalność komórek

• zminimalizować liczbę komórek uszkodzonych

• przeciwdziałać spontanicznym mutacjom i selekcji odmian mniej przydatnych w procesie technologicznym

• ograniczyć przypadkowe zanieczyszczenia

Zamrażanie kultur

• zamrażanie tradycyjne: namnożoną biomasę lub komórki zebrane ze skosów przechowuje się w specjalnych fiolkach w zamrażarce, w temp. - 5 do - 20 st. C, gdzie zachowują swoją żywotność od 1 do 2 lat

• metody nowsze: zamrażanie w specjalnych zamrażarkach mechanicznych w niskiej temp. Od -60 do -80 st. C lub przy wykorzystaniu ciekłego azotu w temp od -156 do -196 st. C

• tempo zamrażania: wolne - ok 1 st. C/ min. lub bardzo szybkie 0 od 100 do 1000st. C/ min. Zazwyczaj 1 - 2 st. C/min, dopóki nie uzyska się temperatury kilka stopni powyżej punktu zmiany faz, tj ok -30 st. C. w dalszym etapie temp zamrażania jest większe, co uzyskuje się przez umieszczenie pojemników z ampułkami w pojemniku z ciekłym azotem.

Przygotowanie do zamrażania kultur

• hodowla pod zwiększonym ciśnieniem osmotycznym w obecności zwiększonej zawartości cukrów (np. 6%) oraz alkoholi polihydroksylowych (mannitol, ksylitol, glicerol)

• powoduje to gromadzenie w komórkach niskocząsteczkowych substancji (prolina, walina i glicyna):

- działają krioochronnie, obniżają temperaturę zamrażania wody

- chronią biopolimery (kwasy nukleinowe i enzymy) przez uszkodzeniami

Etapy zamrażania kultur

• hodowla adaptacyjna w pożywce z podwyższonym ciśnieniem osmotycznym (pożywka mineralna z dodatkiem 6% mannitolu)

• przygotowanie mieszaniny krioochronnej

• zawieszenie komórek w mieszaninie krioochronnej

• głębokie zamrożenie w ciekłym azocie

Rozmrażanie kultur

• decydującą rolę w zachowaniu żywotności komórek odgrywa sposób rozmrażania, które powinno przebiegać możliwie szybko, aby nie dochodziło do wtórnego rozrastania się kryształów lodu i zniszczenia komórek

• najczęściej proces rozmrażania przeprowadza się przez zanurzenie ampułek z zamrożonym materiałem do wody o temp. Ok 40 st. C. Po rozmrożeniu należy usunąć lub rozcieńczyć mieszaninę krioochronną w celu zmniejszenia ciśnienia osmotycznego

• hodowla namnożonych komórek powinna być przeprowadzona w pożywce o składzie umożliwiającym dobrą regenerację i wzrost komórek

Suszenie czystych kultur

• najprostszy sposób to suszenie hodowli bezpośrednio na podłożu wzrostowym. Zastosowanie do utrwalania grzybów strzępkowych, które obficie zarodkują. Suche konidia mogą utrzymać dużą żywotność nawet przez kilka lat

• modyfikacja metody: suszenie próżniowe w eksykatorze z substancją higroskopijną (np. P2O5) w temp. Pokojowej

• przechowywanie........

Suszenie rozpyłowe

• metodę stosuje się w utrwalaniu biomas bakterii, drożdży, preparatów enzymatycznych i antybiotyków

• przy dużym stopniu dyspersji roztworów, odparowanie wody następuje praktycznie momentalnie, dzięki czemu czynnik suszący o wysokiej temperaturze nie powoduje dużych strat ich aktywności

Zalety suszenia rozpyłowego

• wysoka jakość gotowego produktu (biopreparatów z niewielką stratą aktywności biologicznej)

• duża intensywność wymiany ciepła między rozpylanych roztworem a ogrzanym czynnikiem suszącym, zależna od temperatury i wilgotności czynnika suszącego oraz dyspersji roztworu (wielkości kropel)

• możliwość automatycznego sterowania procesem

• odwadniania roztworów systemem ciągłym

Wady tej metody

• mała wydajność odparowania wilgoci w jednostce objętości komory suszenia, co wymusza projektowanie dużych rozmiarów komór

• relatywnie duże jednostkowe zapotrzebowanie na energię

• duże koszty inwestycyjne

Suszenie fluidyzacyjne

• polega na oddolnym przepuszczeniu przez warstwę granulowanego produktu ogrzanego powietrza o tak dobranej prędkości, że cała suszona masa zostaje uniesiona, tworząc stan „półzawieszony”, czyli fluidalny, w którym produkt zachowuje stałą swobodę ruchów i podlega intensywnemu mieszaniu, co powoduje, że wszystkie jego elementy są równomiernie owiewane czynnikiem suszącym (powietrzem)

Doskonalenie biotechnologicznych cech organizmów

• wyizolowane ze środowisk naturalnych lub pochodzące z kolekcji mikroorganizmy charakteryzują się aktywnością metaboliczną i innymi cechami technologicznymi często niewystarczającymi do zastosowania w procesie produkcyjnym

• celem doskonalenia cech technologicznych drobnoustrojów przemysłowych jest zwiększenie wydajności i produktywności procesu technologicznego, obniżenie kosztów surowcowych, a także podniesienie jakości otrzymanego produktu

Mutageneza

• jednym z podstawowych sposobów doskonalenia drobnoustrojów przemysłowych jest mutageneza i selekcja mutantów o cechach korzystnych dla danego procesu biotechnologicznego

• mutacja jest trwałą zmianą sekwencji DNA prowadząc do powstania zmian genetycznych natomiast mutageneza polega na indukowaniu mutacji w materiale genetycznym danego organizmu

• efektywność procesu mutagenezy zależy od rodzaju użytego czynnika, jego stężenia, fazy wzrostu i warunków hodowli drobnoustroju przed poddaniem komórek działaniu mutagenu, skład środowiska w trakcie trwania procesu, a także sprawności mechanizmów naprawczych

• mutageny są to związki chemiczne lub rodzaj promieniowania, które powodują wzrost częstotliwości mutacji w organizmie, często związany ze wzrostem śmiertelności komórek, dlatego też zarówno dawka mutagenu jak i czas jej działania muszą być dokładnie dobrane.

Rekombinacja genetyczna

• jest to proces, w wyniku którego powstają nowe układy genów. Stanowi ona bardziej racjonalny, w porównaniu z mutagenizacją, sposób doskonalenia szczepów przemysłowych.

• Może być ona realizowana dwojako:

- przez hybrydyzację, czyli krzyżowanie szczepów

- przez konstruowanie sztucznych kombinacji genów in vitro i uzyskiwanie ekspresji zaprogramowanej informacji genetycznej w komórkach wybranego gospodarza

Hybrydyzacja

• polega na wymianie odcinków DNA (rekombinacji) między chromosomami lub genoforami dawcy i biorcy w procesie określanym jako crossing - over, wskutek czego można otrzymać rekombinanty o zmienionym genotypie i nowych właściwościach metabolicznych

• obok wydajności określonego metabolitu hybrydyzacja poprawia wiele ważnych cech technologicznych szczepów przemysłowych (szybkość wzrostu, zdolność do przyswajania różnych substratów, tworzenie produktów ubocznych, plon biomasy, właściwości reologiczne hodowli)

Elektroporacja i elektrofuzja

• błona cytoplazmatyczna zapewnia integralność komórki, a jednocześnie jest przenośnikiem substancji i sygnałów metabolicznych między cytoplazmą i środowiskiem

• konsekwencje naruszenia ciągłości błony komórki poddanej impulsowi elektrycznemu są dwojakie:

- elektroporacja: do komórki mogą przeniknąć substancje nieprzechodzące przez błonę natywną

- elektrofuzja: jeżeli impuls stosowany jest w stosunku do komórek ustawionych wzdłuż linii pola i znajdujących się w bliskim kontakcie, może dojść do wymieszania się błon w regionie kontaktu, utworzenia mostka cytoplazmatycznego między różnymi komórkami i wspólnej błony otaczającej cytoplazmy uprzednio oddzielonych komórek, czyli do fuzji komórek

WYKŁAD 3 21.10.2010R.

Techniczne podstawy hodowli drobnoustrojów w bioreaktorach

Bioreaktory - fermentory

Procesy zachodzące w bioreaktorach:

• Wzrost drobnoustrojów

• Wytwarzanie pożądanych produktów metabolizmu

• Enzymatyczne przetwarzanie surowców

• Wzrost komórek roślinnych i zwierzęcych

Istotną rolę odgrywają procesy fizyczne z mieszaniem, wymianą masy i ciepła. Szybkość i wydajność procesów bioreaktorowych zależy od uwarunkowań biochemicznych, fizjologicznych i kinetycznych związanych z zachodzącymi procesami biochemicznymi i z fizycznymi procesami transportu.

Kinetyka wzrostu drobnoustrojów

- z punktu widzenia praktyki procesowej podstawowe znaczenia ma obliczanie szybkości:

• przyrostu biomasy organizmów

• asymilacji składników odżywczych

• wydzielania produktów metabolizmu

- do takich obliczeń korzysta się z bilansów procesów biochemicznych i równań kinetycznych opisujących przyrost biomasy

- we wszystkich ujęciach kinetycznych złożone procesy życiowe mikroorganizmów ujmowane są w uproszczeniu, najczęściej sprowadzane są do przyrostu ich masy

Klasyfikacja technik hodowli drobnoustrojów ze względu na stan fizyczny pożywki

- hodowle w podłożach ciekłych - HPC

• Zawiesina mikroorganizmów w ciekłej pożywce - hodowle wgłębne

• Hodowle z unieruchomionym materiałem biologicznym na powierzchni nośnika lub zamknięcie w jego wnętrzu

• Wzrost grzybów strzępkowych w postaci kożucha na powierzchni ciekłej pożywki - hodowle powierzchniowe

- hodowle w podłożach stałych - HPS

• Stosowane do hodowli grzybów strzępkowych w ziarnie zbóż, otrębach pszennych, odpadach celulozowych

Klasyfikacja technik hodowli drobnoustrojów ze względu na sposób prowadzenia procesu

- hodowle okresowe

- hodowle ciągłe

- hodowle okresowe z ciągłym dozowaniem pożywki

Hodowla okresowa

- stanowi system zamknięty - mikroorganizmy wzrastają w określonej, ograniczonej ilości pożywki

- polega na zładowaniu pożywki do fermentora, wysterylizowaniu jej wraz z aparatem, zaszczepieniu materiału posiewowego i prowadzeniu namnażania mikroorganizmów

- hodowlę kończy się w zależności od wymagań technologicznych albo po zakończeniu wzrostu wykładniczego, albo w fazie stacjonarnej

- powszechnie stosowane do namnażania biomasy mikroorganizmów oraz produkcji pierwotnych produktów metabolizmu (wytwarzanych w fazie wzrostu wykładniczego) oraz wtórnych produktów metabolizmu.

Zalety hodowli okresowej:

• Prostota prowadzenia operacji

• Łatwość utrzymania warunków jałowych

• Odnawialność inokulum zapobiegająca degradacji szczepów

Wady

• Niska produkcyjność procesu

• Brak możliwości regulacji stężenia substratu

Hodowle wielokrotne

- istotą jest wykorzystanie drobnoustrojów z poprzedniego cyklu hodowli jako inokulum w kolejnym cyklu. Stosuje się je w browarnictwie oraz w produkcji octu.

- nie występuje niebezpieczeństwo degeneracji szczepu produkcyjnego

- zastosowanie w przypadku drobnoustrojów bardzo wolno rosnących, jak np. autotroficzne bakterie utleniające amoniak w warunkach anaerobowych

Wydajność hodowli okresowych

- produkcyjność procesów okresowych zależy od ilości produktu uzyskiwanego w jednym cyklu produkcyjnym (szarży) i liczby cykli produkcyjnych w roku. W przypadku instalacji produkcyjnych długość cyklu zależy od czasu trwania operacji na tzw. ścieżce krytycznej

- zwiększenie produkcyjności instalacji okresowych:

• Zwiększenie pojemności roboczej aparatów

• Zwiększenie liczby aparatów pracujących równolegle

• Skrócenie czasu cyklu produkcyjnego

• Zwiększenie liczby cykli produkcyjnych w roku

Hodowla okresowa z ciągłym dozowaniem

- to specyficzna odmiana hodowli okresowej. Jest to proces ze zmienną objętością fermentora.

- możliwe są swa sposoby prowadzenia procesu:

• Ze stałym natężeniem dopływu pożywki

• Ze zmiennym natężeniem dopływu pożywki, szczególnie w przypadku hodowli ze stałym stężeniem w bioreaktorze substratu limitującego wzrost

Hodowla ciągła

- hodowla ciągła prowadzona jest w bioreaktorze przepływowym zasilanym pożywką. Z aparatu w sposób ciągły odprowadzany jest płyn pofermentacyjny z biomasą.

- stężenie biomasy i substratu w strumieniu odpływającym z bioreaktora są takie same jak w całej jego objętości. Natężenie odbioru płynu ze zbiornia jest równe natężeniu dopływu pożywki.

- hodowle ciągłe są stosowane w procesach, w których konieczna jest kontrola stężenia substratu. W hodowli ciągłej preferowane są komórki szybko rosnące. Proces ten jest odpowiedni do otrzymywania biomasy oraz metabolitów pierwotnych.

- trudności w hodowli ciągłej:

• Niehomogeniczność zawiesiny w bioreaktorze

• Utrzymanie jałowości

• Utrzymanie stabilności hodowli

WYKŁAD 4 28.10.2010r.

WYDZIELANIE I OCZYSZCZANIE BIOPRODUKTÓW

Procesy rozdzielania

- stosowane są do wydzielania i oczyszczania produktów biosyntezy w zależności od ich zasadniczej funkcji

Wyróżniamy:

• Separację produktów nierozpuszczalnych i cząstek stałych

• Wydzielanie i koncentrację produktu

• Oczyszczanie produktu

• Końcową obróbkę produktu

Separacja produktów nierozpuszczonych

• Separacja części nierozpuszczonych z roztworu pofermentacyjnych sprowadza się do zastosowania procesów rozdzielania zawiesin

• Są nimi przede wszystkich procesy:

- filtracji

- separacji w polu siły odśrodkowej tj. wirowanie

Wydzielanie i koncentracja produktu

• Wydzielanie i koncentracja produktu wiąże się usuwaniem wody

• Bioprodukty są wydzielane i zatężane w procesach rozdzielania roztworów:

- ekstrakcja rozpuszczalnikowa

- adsorpcja w układzie ciało stałe - ciecz

- procesy membranowe (ultrafiltracja, dializa i elektrodializa)

Oczyszczanie produktu

Oczyszczanie zatężonego produktu od innych związków chemicznych o zbliżonych właściwościach wymaga zastosowania procesów rozdzielania o wysokiej selektywności:

• Techniki chromatograficzne

• Elektroforezę

• Precypitację

Końcowa obróbka produktu najczęściej sprowadza się do:

- krystalizacji

- suszenia

Filtracja konwencjonalna:

• Filtracja jest procesem rozdzielania układu rozproszonego ciało stałe - płyn, zachodzącym podczas przepływu płynu przez przegrodę porowatą zatrzymującą cząstki fazy rozproszonej

• Zasadniczym elementem filtrów w których zachodzi filtracja jest przegroda filtracyjna

• Przepływ zawiesiny przez przegrodę filtracyjną zachodzi pod wpływem różnicy ciśnień po obu jej stronach

Mikrofiltracja

• Stosuje się duże prędkości liniowe przepływu zawiesiny wzdłuż przegrody filtracyjnej, którą jest mikroporowata membrana. Proces realizowany jest w filtrze, zwanym modułem membranowym.

• W Mikrofiltracja zachodzi odseparowanie z roztworu cząstek zawiesiny, natomiast rozpuszczalnik i składników nim rozpuszczone przenikają przez membranę i są odbierane z modułu jako strumień permeatu

• Poru mają średnicę 0,05 - 10 mikrometrów.

Wirowanie

• Wirowanie jest procesem rozdzielania zawiesin, w którym separacja cząstek stałych od cieczy polega na wykorzystaniu różnicy gęstości cząstek stałych i cieczy w polu siły odśrodkowej. Siła odśrodkowa jest tu wywołana ruchem obrotowym bębna wirówki.

Typy wirówek sedymentacyjnych

Ze względu na rodzaj bębna i sposób usuwania osadu:

• Rurowe (zawiesina 1%)

• Koszowe (3-7%)

• Wielokomorowe (4-5%)

• Dyskowe (15%)

• Ślimakowe (2-50%)

Separacja bioproduktów:

• po usunięciu z roztworu cząstek stałych pozostaje w nim interesujący nas produkt w stanie rozpuszczonym i najczęściej w niedużym stężeniu. W kolejnych etapach technologicznych produkt powinien być wydzielony z rozcieńczonego roztworu

• W procesach separacji bioproduktów najczęściej są stosowane ekstrakcja w układach ciecz - ciecz (ekstrakcja rozpuszczalnikowa) i adsorpcja w układzie ciecz - ciało stałe

• Względnie nowym procesem wydzielania składnika z roztworu i z cząstek ciała stałego jest ekstrakcja z płynem w stanie nadkrytycznym (ekstrakcja nadkrytyczna)

Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi

• Ekstrakcja jest procesem przenikania masy zachodzącym po skontaktowaniu roztworu ciekłego z inną fazą ciekłą, w której interesujący nas składnik jest rozpuszczalny. Najprostszym sposobem uzyskania układu dwufazowego ciecz - ciecz jest zastosowanie rozpuszczalnika organicznego.

• Ekstrakcja ciecz - ciecz jest również realizowana przy ciągłym przepływie obu faz w kolumnach ekstrakcyjnych.

Ekstrakcja nadkrytyczna

• Czynnikiem ekstrahującym jest płyn, którego ciśnienie i temperatura obejmują wartości ponad parametrami punktu krytycznego, gdy zachowuje się on inaczej niż gaz i inaczej niż ciecz

• Płyn sprężony do ciśnienia powyżej ciśnienia krytycznego i mający temperaturę wyższą od krytycznej nazywa się płynem (gazem) nadkrytycznym.

Adsorpcja

• Proces opiera się na zjawisku sorpcji składników roztworu na powierzchni ciała stałego. Sorpcja ta wynika przede wszystkim hydrofobowej natury substancji rozpuszczonych (związków organicznych) i powinowactwa substancji rozpuszczonych do powierzchni sorbenta.

• Warunkiem przebiegu skutecznej adsorpcji i wykorzystania jej jako procesu rozdzielania w skali technicznej jest rozwinięcie powierzchni sorbenta (kilkaset m2/g)

• Adsorbentem najczęściej stosowanym w biotechnologii są: węgle aktywne, zeolity i żele krzemionkowe)

Podział procesów membranowych w zależności od rodzaju siły napędowej

Różnica ciśnień	Różnica stężeń	Różnica potencjału elektrycznego
Mikrofiltracja	Dializa	elektrodializa
ultrafiltracja	perwaporacja
Nanofiltracja	pertrakcja
Osmoza odwrócona	Permeacja gazów

Ultrafiltracja

• Charakteryzuje się zastosowaniem membran, w których średnice porów zawierają się w przedziale 1 -50 mikro metrów. Umożliwia to rozdzielanie składników na poziomie molekularnym.

Dializa i elektrodializa

• Efekt rozdzielania w dializie jest spowodowany różnicami w szybkości dyfuzji molekularnej składników roztworu membranie, Stosowana jest do rozdzielania makrocząsteczek lub cząstek koloidalnych od związków małocząsteczkowych

• W elektrodializie składniki jonowe roztworu przenikają pod wpływem zewnętrznego pola elektrycznego przez membrany jonitowe, mające zdolność selektywnego przenoszenia jonów. W elektrolicie umieszczonym w polu elektrycznym kationy i aniony poruszają się do odpowiednich elektrod.

Perwaporacja

• Perwaporacja (permeacja z odparowaniem) jest procesem separacji roztworów ciekłych zachodzącym z częściowym odparowaniem cieczy w membranie nieporowatej i prowadzącym do otrzymania permeatu w postaci pary; jej realizacja wiąże się z koniecznością doprowadzenia cieczy ciepła parowanie

• Perwaporacja jest stosowana w separacji składników, w których konwencjonalne procesy rozdzielania są niekorzystne energetycznie albo wymagają dużych nakładów inwestycyjny np. odwadnianie etanolu lub usuwanie związków organicznych z wody.

Techniki chromatograficzne

• Chromatografia jest metodą rozdzielania jednorodnych mieszanin na składniki lub ich frakcje na skutek różnic w zachowaniu się składników roztworu w układzie faz. Jedna z tych faz nie zmienia położenia (stacjonarna), druga porusza się względem pierwszej w określonym kierunku (ruchoma).

Chromatografia adsorpcyjna i podziałowa

• Chromatografia adsorpcyjna zachodzi w układzie, w którym fazą stacjonarną jest rozdrobniony stały adsorbent i rozdzielanie składników zachodzi w układzie ciecz - ciało stałe.

• W chromatografii podziałowej rozdzielanie zachodzi w układzie ciecz - ciecz, jedna fa =za ciekła jest fazą stacjonarną, unieruchomioną na stałym nośniku. Składniki rozdzielanego roztworu muszą rozpuszczać się w nieruchomej cieczy.

Rodzaj rozdzielanych związków	Faza ciekła
		Stacjonarna	Ruchoma
Związki polarne	polarna	małopolarna
Związki niepolarne	niepolarna	polarna

Chromatografia jonowymienna

• Faza stacjonarna jest obdarzona ładunkiem, a proces jest procesem wymiany jonowej

• Wymiana jonowa to proces fizykochemiczny, w którym jony określonego znaku, będące częścią nierozpuszczalnej w wodzie fazy stałej - jonitu po zdysocjowaniu ulegają wymianie na inne jony tego samego znaku, obecne w roztworze wodnym. W wymianie kationowej między jonitem i roztworem wymieniane są równoważne ilości jonów dodatnich, w wymianie anionowej - jonów ujemnych.

Chromatografia żelowa

• Polega na użyciu fazy stacjonarnej w postaci żelu, Najmniejsze cząsteczki penetrują do wnętrza cząstek żelu i dzięki temu są dłużej zatrzymywane w fazie stacjonarnej niż cząsteczki większe. Te ostatnie pojawiają się jako pierwsze w wycieku z kolumny, Składniki roztworu są podzielone między fazę żelu i roztworu w zależności od rozmiaru cząsteczek.

• W chromatografii żelowej najczęściej są wykorzystywane żele polisacharydowe (polidekstranowe) i żele poliakryloamidowe.

Chromatografia powinowactwa

• Technika zależy od wysoce specyficznych oddziaływań między parami związków biologicznych takimi jak: enzym - substrat, enzym - inhibitor, antygen - przeciwciało itp.

• Cząsteczka związku jest wybiórczo adsorbowana przez substancję wiążącą (ligand), która jest unieruchomiona na nierozpuszczalnym podkładzie (matrycy). Ligand jest przyłączony do matrycy w wyniku adsorpcji fizycznej lub wiązaniem chemicznym. Po przyłączeniu składnika do liganiu, wymywanie tego składnika przeprowadza się zmieniając pH lub siłę jonową roztworu w kolumnie.

Elektroforeza

• Pole elektryczne działające w roztworze na naładowane cząstki wywołuje ich ruch. Rodzaj i wielkość ładunku powierzchniowego cząsteczek i cząstek mogą być różne w przypadku białek, wypadkowy ładunek elektryczny zależy od wartości pH roztworu.

• Elektroforeza umożliwia uzyskanie czystych związków chemicznych pochodzenia biologicznego bardzo nietrwałych, Rozdzielane za pomocą tej metody w niskiej temperaturze w roztworach buforowych białka, enzymy i hormony zachowują swe właściwości biologiczne.

Precypitacja

• To inaczej wytrącanie osadu. Metody precypitacji związane są ze zmianą warunków skutkującą zmniejszeniem rozpuszczalności składnika poprzez:

- zwiększenie stężenia soli, prowadzące do wytrącenia składnika na skutek tzw. „wysolenia”

- zmniejszenie przenikalności elektrycznej

- zmianę pH

- zmianę temperatury

- dodatek polimerów niejonowych i polielektrolitów

• Przejście składnika do osadu oznacza, że jego wyodrębnienie i zatężenie następuje w jednej operacji.

Krystalizacja

• To tworzenie się cząstek ciała stałego o zdefiniowanym kształcie i rozmiarze z homogenicznej fazy ciekłej

• Warunkiem zapoczątkowanie i podtrzymania procesu krystalizacji jest osiągnięcie stanu termodynamicznej niestabilności roztworu, z którego tworzą się kryształy. Stan ten wywołuje powstanie siły napędowej, którą przybliżoną miarą jest tzw. przesycenie.

• Krystalizację z roztworu prowadzi się zwykle w przedziale stosunkowo niewysokich temperatur, co umożliwia oczyszczanie substancji nieodpornych na działanie podwyższonej temperatury.