LABORATORIUM Z BIOCHEMII ćwiczenie nr 1

Temat: AMINOKWASY

Wtorek 8¹⁵-12⁰⁰

Opiekun grupy :

Dr inż. A. Bujacz Marta Wujek

Aleksandra Kosiorek

Przemysław Woiński

1.Wstęp.

Aminokwasy to związki organiczne , które są aminowymi pochodnymi niższych kwasów tłuszczowych. Cząsteczki aminokwasów zawierają przynajmniej jedną grupę karboksylową - COOH oraz przynajmniej jedną grupę aminową - NH₂.

Naturalnie występuje około 20 aminokwasów, które budują wszystkie białka. Są to tak zwane α-aminokwasy białkowe (naturalne), czyli aminokwasy, w których grupa aminowa i grupa karboksylowa jest związana z tym samym atomem węgla.

Wszystkie aminokwasy proteinogenne (oprócz proliny) mają jednolitą strukturę chemiczną, którą opisuje wzór:

Aminokwasy możemy podzielić:

1. Z punktu widzenia wartości pokarmowych:

-aminokwasy endogenne- aminokwasy, które organizm może sobie sam wytworzyć z innych związków,

-aminokwasy egzogenne- muszą być dostarczane do organizmu,

- aminokwasy względnie egzogenne- aminokwasy, które mogą być produkowane wewnątrz ustroju, jednak w wyniku niektórych stanów fizjologicznych zapotrzebowanie na nie znacznie wzrasta i konieczna jest ich podaż z zewnątrz.

2. Ze względu na budowę łańcucha bocznego:

- aminokwasy aromatyczne- posiadają w łańcuchu bocznym pierścienie aromatyczne,

-aminokwasy alifatyczne- łańcuch boczny stanowi łańcuch alifatyczny, który może być rozgałęziony lub nierozgałęziony.

3. Ze względu na liczbę grup aminowych i karboksylowych w cząsteczce:

-aminokwasy obojętne - gdy liczba grup aminowych i karboksylowych jest taka sama,

-aminokwasy kwaśne - gdy liczba grup karboksylowych przeważa nad liczbą grup aminowych,

-aminokwasy zasadowe - gdy liczba grup aminowych przeważa nad liczbą grup karboksylowych.

Aminokwasy mają charakter amfoteryczny, ponieważ zachowują się jak kwas i jak zasada, pod warunkiem, że w cząsteczce obecna jest grupa kwasowa i zasadowa. Tak wiec aminokwasy występują w postaci cząsteczek naładowanych oraz dobrze rozpuszczają się w wodzie, natomiast trudno rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych (można je wytrąć z roztworu wodnego alkoholem).

Najlepszą rozpuszczalność mają w środowisku kwasowym lub zasadowym, najsłabszą w punkcie izoelektrycznym (pI) - jest to wartość pH , w którym aminokwas w roztworze występuje głównie w formie jonu obojnaczego - stężenia molowe form kationowych i anionowych są sobie równe.

Wartości pI;

• aminokwasy obojętne pI przy pH = 5 - 6,

• aminokwasy zasadowe pI przy pH = ok. 10,

• aminokwasy kwasowe pI przy pH = ok. 3.

2.Cel ćwiczenia.

Celem naszego ćwiczenie było zbadanie właściwości poszczególnych aminokwasów oraz reakcji dla nich charakterystycznych.

3.Przebieg ćwiczenia.

> Amfoteryczne właściwości aminokwasów.

a) Opis wykonywanych czynności:

W probówce rozpuściliśmy na ciepło szczyptę L-tyrozyny w kwasie solnym. Następnie dodawaliśmy kroplami roztwór NaOH, do momentu aż powstał wyraźny osad. Osad ten zobojętniliśmy roztworem mocniejszej zasady.

b) Obserwacje:

Podczas doświadczenia w probówce wytworzył się osad, który rozpuścił się po zalkalizowaniu.

c) Wnioski:

Reakcja zaszła prawidłowo. Tyrozyna wykazała właściwości amfoteryczne, co zaobserwowaliśmy przy zmianie pH roztworu aminokwasu.

> Odczyn ninhydrynowy.

a)Opis wykonywanych czynności:

Do probówki, w której znajdował się roztwór glicyny dodaliśmy taką samą objętość odczynnika ninhydrynowego. Mieszaninę ogrzewaliśmy w łaźni 5 minut. Wykonaliśmy to doświadczenie także dla tyrozyny, białka kurzego i wody.

b) Obserwacje:

Podczas doświadczenia w probówce z glicyną roztwór zabarwił się na granatowo, tyrozyna na żółto, białko kurze uległo denaturacji i miało atramentowy kolor, zaś dla wody reakcja nie zaszła.

c) Wnioski:

Reakcję ninhydrynową przeprowadza się w celu wykrycia aminokwasów. Dla glicyny i tyrozyny wynik próby jest pozytywny, białko kurze również wykazało charakter aminokwasowy, ponieważ białko zbudowane jest z aminokwasów. Dla wody wyszła próba negatywna.

Równanie opisujące przebieg reakcji:

> Reakcja z kwasem azotawym (wg. Van Slyke'a).

a) Opis wykonywanych czynności:

W probówce wymieszaliśmy roztwór NaNO₂ i CH₃COOH, a następnie dodaliśmy nasz badany aminokwas. Doświadczenie wykonaliśmy dla glicyny, tryptofanu, białka kurzego i wody.

b) Obserwacje:

W glicynie , tryptofanie i białku po przebiegu reakcji wydzieliły się pęcherzyki gazu, ponadto białko uległo częściowej denaturacji. Tyrozyna dodatkowo zabarwiła się na żółto. Dla wody reakcja nie zaszła.

c) Wnioski:

W wyniku reakcji aminokwasy uległy deaminacji z wydzieleniem gazowego azotu. Reakcja Van Slyke'a jest dobrą i szybką metodą do oceny czy pracujemy z aminokwasem czy też nie.

Równanie opisujące przebieg reakcji:

> Reakcja ksantoproteinowa (dla aminokwasów aromatycznych).

a) Opis wykonywanych czynności:

Do aminokwasu znajdującego się w probówce dodaliśmy stężonego kwasu HNO₃ i ogrzewaliśmy w łaźni przez 30 sekund. Po schłodzeniu do próbek dodaliśmy roztwór NaOH. Doświadczenie wykonaliśmy dla tyrozyny, tryptofanu, glicyny, białka kurzego o wody.

b) Obserwacje:

Po dodaniu HNO₃ i ogrzaniu tyrozyna zabarwiła się na kolor żółty, tryptofan na bursztynowy, białko na żółty oraz uległo denaturacji. Dla glicyny o wody reakcja nie zaszła.

Po zalkalizowaniu próbek tyrozyna zmieniła barwę na pomarańczową, tryptofan na czerwono-brunatną, białko miało galaretowatą konsystencję o żółtym odcieniu. W przypadku wody i glicyny nic się nie zmieniło.

c) Wnioski:

Tryptofan, tyrozyna i białko wykazują właściwości aminokwasów aromatycznych, ponieważ w wyniku reakcji ze stężonym kwasem pierścień aromatyczny ich łańcucha bocznego iległ nitrowaniu.

Równanie opisujące przebieg reakcji:

> Reakcja Millon'a (tylko dla tyrozyny).

a) Opis wykonywanych czynności:

Do L-tyrozyny znajdującej się w probówce dodaliśmy odczynnik Millon'a i ogrzewaliśmy w gorącej łaźni, aż do momentu uzyskania zabarwienia. Doświadczenie wykonaliśmy także dla wody.

b) Obserwacje:

Podczas doświadczenia w probówce z tyrozyną roztwór zabarwił się na pomarańczowo. Dla wody reakcja nie zaszła.

c) Wnioski:

W wyniku reakcji nitrowania tyrozyny w obecności jonów rtęci powstaje sól rtęciowa jej nitrowej pochodnej.

Reakcja ta jest charakterystyczna dla tyrozyny, co ułatwia jej wykrycie.

Równanie opisujące przebieg reakcji:

> Reakcje charakterystyczne dla tryptofanu.

a) Opis wykonywanych czynności:

A

Do roztworu tryptofanu znajdującego się w probówce dodaliśmy kilka kropel aldehydu mrówkowego, stężony kwas siarkowy oraz nienasycony roztwór siarczanu rtęci, a następnie wymieszaliśmy całość. Próby wykonaliśmy również dla białka kurzego i wody.

B

Do probówki z roztworem tryptofanu dodaliśmy kwasu glioksalowego i wymieszaliśmy. Następnie dodawaliśmy po ściance stężonego kwasu siarkowego (IV). Próby wykonaliśmy również dla białka kurzego i wody.

b) Obserwacje:

A

W tryptofanie podczas reakcji wytrąciły się fazy oraz ciemna obrączka. Faza nad obrączką była bezbarwna, a pod obrączką miała mleczno-biały kolor. Po wymieszaniu roztwór miał ciemnobrunatne zabarwienie. Białko kurze zabarwiło się na biało-fioletowy odcień. Dla wody reakcja nie zaszła.

B

W tryptofanie po dodaniu kwasu pojawiła się granica faz w postaci fioletowej obrączki. Górna faza miała kolor żółty, a dolna błękitny. W białku oddzieliły się fazy i uległo denaturacji. Dla wody reakcja nie zaszła.

c) Wnioski:

Pierścień indolowy , charakterystyczny dla łańcucha bocznego tryptofanu, tworzy, w obecności czynnika utleniającego, barwne produkty kondensacji, powstające za pośrednictwem reszty aldehydu mrówkowego lub kwasu glioksalowego.

Równanie opisujące przebieg reakcji:

> Odczyn Pauly'ego dla histydyny.

a) Opis wykonywanych czynności:

Do probówki z roztworem L-histydyny dodaliśmy kwasu sulfanilowego oraz azotynu sodu. Wymieszaliśmy, a następnie wlaliśmy roztworu NaOH. Próbę przeprowadziliśmy także dla glicyny.

b) Obserwacje:

Podczas doświadczenia w probówce z histydyną roztwór zabarwił się na kolor ciemnoczerwony. Reakcja z glicyną nie zaszła.

c) Wnioski:

pierścień imidazolowy histydyny w środowisku zasadowym ulega reakcji sprzęgania z jonem p-sulfobenzenodiazoniowym, której produktem jest czerwona pochodna diazowa.

Równanie opisujące przebieg reakcji:

> Reakcja cystynowa.

a) Opis wykonywanych czynności:

Znajdującą się w probówce L-cysteinę rozpuściliśmy w wodzie, a następnie dodaliśmy kilka kropel octanu ołowiawego i wodorotlenku sodu. Probówkę wstawiliśmy do łaźni na pół godziny. Próbę porównawczą wykonaliśmy dla białka kurzego.

b) Obserwacje:

Po upływie podanego czasu w probówce powstał szary osad. Dla białka reakcja nie zaszła.

c) Wnioski:

W środowiskach zasadowych z ugrupowania tiulowego cysteiny oraz disiarczkowego ugrupowania cystyny wytrąca się siarka w postaci anionu S^2-. Obecność tych jonów wykryć można przez dodanie do roztworu octanu ołowiu w wyniku czego powstaje siarczek ołowiu, który wytrąca się w postaci czarnego osadu.

Równanie opisujące przebieg reakcji: