Ćwiczenie E. Wpływ temperatury na aktywność enzymów

Cele ćwiczenia:

Poznawczy: Zbadanie wpływu temperatury na aktywność enzymów na przykładzie reakcji hydrolizy sacharozy przez inwertazę zawartą w wyciągu drożdżowym.

Metodyczny: Zapoznanie się z jedną z metod oznaczania stężenia cukrów redukujących - metodą Nelsona.

Nr	V odczynnika miedziowego [ml]	V standardu glukozy [ml]	V H2O [ml]	Próby E+S przygot. wg Tabeli 2.		V odczynnika arseno-molibdenowego [ml]	A660	A660/kor/
próbki
1	0,5	-	0,5					0,5	0	-
2	0,5	0,1	0,4					0,5	0,197	-
3	0,5	0,2	0,3					0,5	0,329	-
4	0,5	0,3	0,2					0,5	0,415	-
5	0,5	0,4	0,1					0,5	0,615	-
6	0,5	0,5	-	Nr	V [ml]	0,5	0,788	-
7	0,5	-	0,4	12	0,1	0,5	0,343	0,212
7'	0,5	-	0,4	12'	0,1	0,5	0,131	-
8	0,5	-	0,4	13	0,1	0,5	0,802	0,646
8'	0,5	-	0,4	13'	0,1	0,5	0,156	-
9	0,5	-	0,4	14	0,1	0,5	1,141	0,945
9'	0,5	-	0,4	14'	0,1	0,5	0,196	-
10	0,5	-	0,4	15	0,1	0,5	1,439	1,312
10'	0,5	-	0,4	15'	0,1	0,5	0,127	-
11	0,5	-	0,4	16	0,1	0,5	0,149	-0,005
11'	0,5	-	0,4	16'	0,1	0,5	0,154	-

TABELA 1

Opracowanie wyników

1). Obliczenie stężenia masowego standardu glukozy C_G,stand.[mg/ml]. Zakładamy, że jego gęstość jest równa gęstości wody.

Dla próbki numer 2:

gdzie

2). Obliczenie masy glukozy m_G,stand. [μg] w próbkach 1-6 służących do wykonania krzywej standardowej.

Dla próbki numer 2:

Wychodzimy ze wzoru z punktu 1). i liczymy dalej

[μg]

3). Wykres 1: Zależność absorbancji A₆₆₀ w funkcji masy glukozy m_G,stand.

Równanie linii trendu: y=0,3091x a stąd wynika, że: A=0,3091*m

4). Obliczenie absorbancji opisującej ilość glukozy powstałej w reakcji enzymatycznej ΔA₆₆₀/kor/ dla próbek 7-11.

Korzystamy z równania: ΔA₆₆₀/kor/ = A₆₆₀ - A'₆₆₀

A₆₆₀ - pomiar absorbancji roztworów „nieprimowanych”

A'₆₆₀ - pomiar absorbancji roztworów „primowanych” - absorbancja wynikająca z nieenzymatycznej hydrolizy sacharozy

Np. dla próbki 7 i 7': ΔA₆₆₀/kor/ = 0,343 - 0,131 = 0,212

5). Obliczenie masy glukozy m_G,P [μg]powstałej w reakcji enzymatycznej w próbkach 7-11.

A=0,3091*m m = A / 0,3091

Np. dla próbek 7 (7'):

6). Obliczenie masy glukozy
zawartej w 6 ml mieszaniny reakcyjnej (próbki 12-16).

V_M = 6 ml V_MP = 0,1 ml

[μg]

7). Obliczenie liczności glukozy n_G,M [μmol] w mieszaninach reakcyjnych.

M_G = 180 g/mol = 180 μg/μmol

n = m/M n_G,M = 41,125 / 180 = 0,229 μmol

8). Obliczenie aktywności inwertazy Akt_inwertazy[U/ml].

Miarą aktywności enzymu jest liczność substratu, jaka zostaje przekształcona przez enzym w produkt w ciągu 1 minuty

Jednostką aktywności enzymatycznej jest U (unit) podawana jako ilość enzymu, która w optymalnych warunkach pH i temperatury oraz przy wysycającym stężeniu substratu przekształca 1 μmol substratu w produkt w ciągu 1 minuty.

W przeliczeniu na 1 ml enzymu, aktywność enzymatyczna liczona była zgodnie ze wzorem:

gdzie V_E - objętość enzymu dodana do mieszaniny reakcyjnej (0,5ml)\

Czas reakcji - 10 minut

n_substratu - z poprzedniego punktu

dla próbki 12

9). Wyniki obliczeń - Tabela 2

Treakcji [st.C]	A660/kor/	mG,P [μg]	mG,M [μg]	nG,M [μmol]	Aktinwertazy [U/ml]
4	0,212	0,686	41,152	0,229	0,0457
20	0,646	2,090	125,396	0,697	0,1393
40	0,945	3,057	183,436	1,019	0,2038
55	1,312	4,245	254,675	1,415	0,2830
100	-	-	-	-	0

10). Wykres 2: Zależność aktywności enzymu inwertazy od temperatury

11). i 12). Interpretacja wyników i wnioski

Wyniki doświadczenia wskazują na to, iż optymalna temperatura działania badanego roztworu inwertazy z wyciągu drożdżowego wynosi blisko 55 st.C. Według danych literaturowych temperatura ta wynosi ok.60 st.C.

Najniższa aktywność w temp. 4 st.C.

13). Inwertaza sacharozy cechuje się wysoką aktywnością w przedziale temperatur 48-56 st.C. Zakres ten można ocenić jako typowy dla enzymów glikolitycznych. W podobnym zakresie temperatur dużą aktywność wykazują inne enzymy amylolityczne (np.alfa-amylaza najaktywniejsza w temp. między 45-55 st.C).

14). Krzywa standardowa określa zależność pomiędzy masą substratu cukrowego, powstałego podczas enzymatycznej inwersji sacharozy, a jego zdolnością do pochłaniania światła. Szybkość zamiany absorbancji jest wprost proporcjonalna do aktywności enzymu, wyrażonej w molach substratu (lub produktu).

Krzywą standardową wyznaczono na podstawie pomiaru absorbancji prób zawierających znaną ilość glukozy. Dzięki temu możliwe było wyznaczenie ilości wytworzonego produktu (glukozy) podczas reakcji enzymatycznej zachodzącej w różnych temperaturach.

15). Wykonanie doświadczenia pozwoliło na zbadanie wpływu temperatury na aktywność inwertazy (z wyciągu drożdżowego) oraz poznanie metody Nelsona, wykorzystywanej do oznaczania stężenia cukrów redukujących.

---