Mikrobiologia

Temat:Metody oznaczania w próbkach spożywczych ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych

Metoda 1 => bezpośrednie liczenie (mikroskopowe)

Metoda 2 => pośrednie liczenie (hodowlane)

Liczbę drobnoustrojów podaje się w przeliczeniu na:

- jednostkę masy (1g)

-jednostkę objętości (1cm3)

Metody bezpośredniego liczenia obejmują żywe i martwe drobnoustroje

1. Przy użyciu Komor Thoma , Howarda , Burkera , Fuchsa , Rosenthala (są to grubo ścienne szkiełka przedmiotowe z wgłębieniem o znanej głębokości i powierzchni podzielonej na kwadraty lub prostokąty. Liczymy tylko większe komórki drobnoustrojów (drożdże zarodniki pleśni , duże komórki bakterii)

2. Metoda Breeda:

Na znanej powierzchni szkiełka przedmiotowego (1cm²) rozprowadza się znana objętość zawiesiny pipetka Breeda 0,01 cm² lub kalibrowaną ezą. Po wykonaniu rozmazu utrwalenie i zabarwienie preparatu liczy się drobnoustroje pod mikroskopem z użyciem obiektywu imersyjnego. Przygotowuje się trzy preparaty z tej samej zawiesiny w każdym liczy się średnia z 20 pól widzenia a następnie średnią z trzech preparatów.

3. Metody liczenia drobnoustrojów w preparacie mokrym:

Krople zawiesiny umieszcza się pod szkiełkiem przykrywkowym i liczy średnią liczbę Komorek z 20 pól widzenia

4. Metoda filtrów membranowych:

Polega ona na przesączeniu przez odpowiedni filtr określonej objętości próby , wybarwieniu bakterii znajdujących się na filtrze i liczeniu ich pod mikroskopem przy użyciu obiektywu immersyjnego określonej liczbie pól widzenia.

Cel - wychwycenie bakterii z możliwie jak największej V materialu

• Pozwala badac material nierozpuszczalny w tle lub zawierajacy > 1 fazy tlustą

• Pozwala na wyizolowanie nawet niewielkiej liczby drobnoustrojow, wystepujacym w V płynów

• Okresla rzeczywisty stopien zanieczyszczenia

- z fazą tłustą trzeba wczesniej homogenizowac + rozpuszczalnik .wody mineralne , stolowe, gazowane. produktu nie sączymy bezpośrednio

- nie nadaje się do badania płynów mętnych

- materialu zanieczyszczonego rozną mikroflorą

S. oznaczenie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojow (NP2 met. Oparta na statystyce , do oznaczania roznych grup bakterii na podlozach plynnych

Metodę ta można wykorzystywać przy ocenie produktow spożywczych , w których badanie drobnoustrojow nie przekracza 100 / g.

Uwaga:

• Stosujemy pożywkę agarową PCA , zawierajaca enzymatyczny hydrolizator kazeiny, ekstrakt drożdżowy i glukoze.

• Jeżeli badamy produkty mleczarskie to do pożywki PCA dodajemy 18 g odtłuszczonego mleka w proszku

Metodę te poleca się dla:

- preparatów w postaci suchej i nie rozpuszczalnych w wodzie

- lęków olejowych i preparatów zawierających fazę tłustą , wymagających przed posiewem homogenizacji

- wszystkich form lęków bakteriostatycznych oraz zawierających związki konserwujące mogące wpływać hamująco na wzrost drobnoustrojów

- do badan wód mineralnych stołowych i napojów gazowanych ubogich w drobnoustroje

Zalety:

-pozwala badać materiał nierozpuszczalny w wodzie lub zawierających więcej niż 1 fazę tłustą

-pozwala na wyizolowanie nawet nie wielkiej liczby drobnoustrojów występujących w dużych objętościach płynów

- określa rzeczywisty stopień zanieczyszczenia

Wady:

- nie nadaje się do badania płynów mętnych , materiału zanieczyszczonego różną mikroflorą

Pośrednie metody liczenia ,oparte są na:

1. Metody płytkowe

-posiewie metoda zalewową i liczeniu kolonii

- posiewie powierzchniowym i liczeniu kolonii

2. Oznaczeniu najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPR?)

Próbkę żywności do oznaczę ilościowych należy rozcieńczyć a w wypadku produktów stałych najpierw rozdrobnić następnie przygotowuje się szereg 10-krotnych rozcieńczeń badanego materiału i posiewa na płytkę.

Metody płytkowe:

-polegają na posiewie określonej objętości próbki na podłoże stale a po okresie inkubacji stwierdzeniu liczby wyrosłych kolonii. Przyjmując ze z 1 komórki wyrasta 1 kolonia można obliczyć ilość drobnoustrojów w 1cm³ lub 1g produktu.

Błędy pomiarowe:

- bierzemy pod uwagę tylko komórki żywe

-bakterie występujące np. w skupiskach wyrastają jako 1 kolonia

-uwzględniamy tylko te bakterie które rozwijają się w danych warunkach

Metoda płytek zalewowych

- z przygotowanych rozcieńczeń badanego produktu posiewa się na płytki po 1cm³ zawiesiny , następnie wlewa się około 15cm³ podłoża i miesza ruchem kolistym po zakrzepnięciu pożywki , płytki inkubuje się a następnie liczy wyrośle kolonie.

Zasada obliczeń

-do liczenia wybiera się próbki tych rozcieńczeń z których liczba wyrosłych kolonii jest mniejsza niż 300. Aby otrzymać liczbę drobnoustrojów w 1g/1cm³ średnią wartość z 3 płytek należy pomnożyć przez odwrotność odpowiedniego rozcieńczenia. Wynik należy przedstawić jako liczbę miedzy 1,0 a 9,9 pomnożona przez 10^x

Przykład:

W 100 krotnym rozcieńczeniu wyrosło na płytkach 53 , 56 , 62 koloni

Odpowiedz 5,7 x 10³

Wady:

- materialo-,praco-,czasochłonność i przy z byt dużej ilości bakterii na płytce następuje utrata liniowości (zlewanie się koloni)

Metoda płytek spiralnych

-liczenie za pomocą tej metody odbywa się przy pomocy specjalnej siatki

Metoda posiewu powierzchniowego

- polega na przesiewaniu 0,1-0,5mml kolejnych rozcieńczeń badanej próby na podloza uprzednio rozlane i zestalone w płytkach i rozprowadzeniu na ich powierzchni posianego materiału

Zalety:

-uzyskanie koloni o wyraźnej morfologii

- widoczność koloni ułatwia liczenie.

- nie stosujemy tej metody w przypadku produktów zawierających powyżej 500 drobnoustrojów w 1g.

Oznaczenie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów

-metoda oparta na statystyce stosowana do oznaczenia liczby rożnych grup bakterii na podłożach selektywnych które umożliwiają namnożenie drobnoustrojów występujących w nie wielkiej liczbie w produkcie spożywczym (nie więcej niż 100 na 1g.)

Jeżeli oznaczamy ogólną liczbę przetrwalników badamy produkty przed posiewem, poddajemy 10 min , ogrzewamy w temp. 80 st. C

Jeżeli oznaczamy liczbę drozdzy i plesni wykorzystujemy pożywkę agarową z glukozą, ekstraktem drożdżowym i chloramfenikolem.

Czas temp. Inkubacji:

- mezofile 30 C 72 h

- psychrofile 0 C 10 dni

- drozdze i plesnie , 25 C odczyt po 3 - 5 dniach

Metody wskaźnikowe

-metodami tymi określa się obecność drobnoustrojów które nawet w nie wielkich ilościach wskazują na stan sanitarny produktu

• Próba reduktazowa => pozwala na ocenę jakości i ilości bakterii zwartych w mleku oparta jest na oznaczeniu momentu wyczerpania tlenu rozpuszczonego w mleku przez bakterie. Po zużyciu tlenu funkcje akceptora wodru pełni dodany barwnik np. błękit metylenowy który przechodzi w formę bezbarwną. Im więcej bakterii rozwija się w mleku tym szybciej jest odbarwiany błękit.

• Oznaczenie miana coli , enterococów i beztlenowców

Miano => to najmniejsza ilość produktu w którym stwierdza się obecność danego drobnoustroju. W celu oznaczenia miana do rzędu próbówek z podłożem płynnym posiewa się po 1cm³ odpowiednich rozcieńczeń badanego produktu. Ostatnie rozcieńczenie w którym stwierdzono jeszcze reakcje dodatnią przyjmuje się jako miano

• Inne metody oznaczania zanieczyszczenia mikrobiologicznego żywności:

• Pomiar wolnych kom. Tluszczowych|: amoniaku, estrosterydu, pirogronianiu , met. immunoenzymatyczne , genetyczne

W 1 Stwierdza się obecność mikroorganizmu wskaźnikowego 0,01g produktu

W 2 miano mniejsze 10^-3 mikroorganizmy wskaźnikowe SA obecne w 0,001g

W 3 większa od 10^-1 brak mikroorganizmu wskaźnikowego w 0,1g produktu

Metody oznaczania w produktach spożywczych ogolniej liczby droboustrojow proteolitycznych, amylolitycznych i lipolitycznych.

Drobnoustroje proteolityczne - wydzielaja enzymy proteolityczne rozkładające bialko do środowiska:

• Miroccocus, streptococcus , enteroccocus

• Bacillus

• Pseudomonas , proteus

• Clostrisum, C. botulinum, Aspergillus, Penicillum

Negatywne: np. Gorzknienie mleka pod wplywem Pseudomonas

Pozytywne wykorzystanie niekotrych gatunkow z rodzaju Aspergillus , Rizhopus dla smakowych hydrolizatow białkowych , bialek serwatkowych mleka, konserwantow aminokwasowych

Substraty i podloza stosowane do wykrywania drobnoustrojow proteolitycznych zalezy od tego jak preparat jest badany lub z jakiej grupy produktow zostaly wyizolowane szczepy mikroorganizmow.

Do oznaczania liczby d. proteolitycznych służą dwa podstawowe substraty : KAZEINA I ZELATYNA.

Prod. Mleczarskie, miesne :

• Podloze z zelatyna wg Freziera

• Agarowe przygotowane z wyciągiem z ryb najlepiej z dorsza

• Podloze z kazeina

• Froziera i Ruppa , agar ze sproszkowanym mlekiem

Kolonie bakterii proteolitycznych otoczone są jasną strefą przezroczystego podloza.

Posiew 1 ml , met. Z roznych rozcieńczeń ,

1. Po inkubacji zalewamy czynnikiem Froziera zastosowany chlorek rtęciowy ,

2. Zalanie jednym z wymienionych podlozy

Drobnoustroje lipolityczne - wydzielaja enzymy lipolityczne do środowiska katalizujące hydrolize tłuszczowca.

• Microccocus, Bacillus

• Pseudomonas , sarralia, Proteus, Enterobacter

• Aspergillus, Penicillum, Fusarium , Rizhopus, Mucor

• Candida, Torula , Geotrichium

Np. jałczenie żywności

Dojrzewanie w serowarstwie , produkowanie stabilizatorow i emulgatorow w przemysle cukierniczym .

Podłoże:

- z tributtą: wynik dodatni , przezroczysta obwodka wokół kolonii

- z dodatkiem tseen ( 40 , 60 , 80 ):mętna obwodka wokół kolonii , w tle kom.tluszczowe

- z tłuszczem masła :niebieski strąt wokół posiewu kolonii

- z błękitem Victora : met. Stos. Do wykrywana d. lipo w masle

- z zoltkiem jaj kurzego: mętna strefa wokół kolonii , pozwala wykryc bakterie wydzielajce podloza enzymu i lecytyne

Tributryna iTseen nie nadają się do tluszczu rybnego , ale można zastosowac , ale i wyekstarktowac z ryb .

Drobnoustroje amylolityczne - rozkładają skrobie i wiele innych węglowodanów

Niektóre z rodzaju Bacillus lub Clostridum

Acetobacter, Glucorobacter , Pseudomonas, Enterobacterie

Aspergillus, Penicillum , Rizhopus, Mucor I drozdze

Do wykrywania drobnoustrojow amylolitycznych stosuje sie podloza agarowe z ekstraktem miesnym , drożdżowym i dodatkiem skrobi.

Negatywne np. choroba ziemniaczana, śluzowacenie pieczywa ( wyjatek pieczywa wytwarzane w zakwasie chlebowym )

Pozytywne: do wytwarzania enzymow mających za zadanie upłynnienie i scukrzenie surowcow skrobiowych - glukozowych uzywane w produkcji wyrobow cukierniczych.

Podłoże:

- Waksona: stos. Do oznaczania liczby przetrwalnikow amylolitycznych w mące. Po 24 - 48 h hodowli , kolonie zalewamy plynem Lugola. Wyniki dodatni: jasne strefy przejasnienia wokół kolonii , podloza w brunatnym tle.

- Agarowym , po 24 - 48 h plyn Lugola, wynik dodatni: sfera przejasniennia

- 1 - 5 % skrobią wokół kolonii