1.Regulacja replikacji u procariota.

Tylko na poziome inicjacji

Regulowana jest na dwa sposoby w komórkach bakterii:

-istnieje ścisła zależność między replikacją i masą komórki, sygnałem do startu replikacji może być nagromadzenie białka w komórce- inicjatora. Jeśli jego ilość przekroczy wielkość krytyczną, to replikacja się rozpoczyna. Rola ta jest przypisywana białkowi DnaA

(ponadto białko DnaA stanowi łącznik miedzy inicjacją replikacji i podziałem komórkowym)

-w sekwencjo oriC stwierdza się obecność sygnałów sterujących inicjacją bezpośrednio, dzięki możliwości rozróżnienia DNA zreplikowanego od nie zreplikowanego. Sygnałami tymi są sekwencje -GATC-, które są specyficznie metylowane przez metylazę Dam, metylujące A w pozycji N-6. W obszarze oriC jest tych sekwencji 11. Przed replikacją - sekwencje zmetylowane, po replikacji jedna tak, a druga nie:-) Inicjacja wymaga obecności całkowicie zmetylowanego DNA, ulega zahamowaniu aż do czasu wstawienia brakujących grup metylowych do DNA

2.Metody wprowadzenia transgenu do kom

Fragment DNA połączony z wektorem wprowadza się do komórki, w celu jego powielenia.

- do komórek bakterii za pomocą transformacji, transformacji ulegają tylko nieliczne komórki bakterii, jest to proces aktywnego pobierania DNA o charakterze enzymatycznym. Transformowanie E.coli -pasywne przenikanie DNA przez destabilizowane błony komórkowe . Destabilizacja= inkubacja kom. w niskiej temp. w obecności CaCl₂. Jeśli DNA wniknie, to są komórki kompetentne.

-do kom. zwierzęcych transfekcja:

• Wprowadzając DNA w obecności fosforanu wapnia lub dekstranu

• Wykorzystując zjawisko elektroporacji - utworzenie porów w błonie komórkowej pod wpływem wysokonapięciowych pól elektrycznych

• Bombardowanie komórek kulkami ze złota lub wolframu opłaszczonych przez DNA i rozpędzonych w polu elektrycznym

• Metoda Mikroiniekcja DNA służy do wpr. DNA do zarodków zwierząt, w celu otrzymania zwierząt transgenicznych

-do kom.. roślinnych

• Tak jak wyżej, jednak pamiętać należy o ścianie komórkowej- poprzedzenie etapem protoplastyzacji- częściowe usuniecie ścian komórkowych

3. Modele replikacji

Model dyspersyjny - Max Delbrucka - zakłada, że każda z syntetyzowanych nici składa się częściowo z łańcucha DNA rodzicielskiego a w części z nowo syntetyzowanego.

Model semikonserwatywny - Watsona i Cricka - zakłada, że każda z nici podwójnej helisy może po rozwinięciu stać się matrycą do syntezy nowej nici

Widełki replikacyjny mogą przyjmować rozmaite kształty:

-typu theta

-wg modelu obracającego się koła

-wg modelu przemieszczającej się pętli

- model replikacji jednoniciowego DNA

DNA bakeriofaga (nić +) wnika do komórki bakteryjnej, gdzie zostaje pokryta białkami SSB. Jednak miejsce ori tej nici ma charakter palindromowy i tworzy strukturę szpilki do włosów, uniemożliwiając przyłaczenie białek SSB mających powinowactwo tylko do jednosniciowego DNA. Do miejsca tego przyłacza sie polimeraza RNA lub primaza i syntetyzuje starery. Enzymy te oddysocjowują po zetknięciu się z białkami SSB i przyłacza się polimeraza DNA III która przeprowadza syntezę komplementarnej nici (-) zwanej formą replikacyjną (RF). Jest ona matrycą do powstawania nici +

Model konserwatywny - cząsteczki pochodne zbudowane są w ten sposób że jedna ma tylko nici rodzicielskie a druga tylko nowo zsyntetyzowane

4. Mechanizmy rekombinacji genetycznej

Rekombinacja-zdolność do wymiany odcinków miedzy homologicznymi cząsteczkami DNA

-podstawowy proces wymiany genów, wieszający różnorodność genetyczną komórek

-umożliwia przeżycie organizmów w sytuacjach, gdy na skutek licznych uszkodzeń w obu łańcuchach heliksu DNA ich reperacja i resynteza staje się niemożliwa.

• Rekombinacja homologiczna zachodzi między homologicznymi cząsteczkami DNA (crossing over w mejozie); u eukariontów wymianie podlega fragment chromosomu, w procariotów -odcinki homologiczne cząsteczek DNA. Zakłada się istnienie pęknięć łańcuchów DNA, biorą udział liczne ukł. Enzymatyczne przeprowadzające wymianę odcinków miedzy cząsteczkami DNA. Mechanizmy te zostały bliżej poznane u E.coli

• U bakterii rekom. Zachodzi w trakcie koniugacji po wprowadzeniu DNA z jednej komórki do drugiej, a także w procesach transformacji i transdukcji. Enzymem przeprowadzającym rekombinację jest białko recA. Brak tego białka- niezdolność do rekombinacji. RecA wiąże się z jednoniciowym DNA w sposób niezależny od sekwencji nukleotydowej -1 polipeptyd na 5 nukleotydów. Kompleks DNA- białko recA atakuje dwuniciowy heliks drugiej cząsteczki DNA w różnych losowo miejscach, powodując lokalne rozplecenie obu nici heliksu. W momencie odnalezienia komplementarnej sekwencji powoduje dalsze rozkręcanie heliksu i wydłużanie powstałego mieszańcowego DNA. Powstaje przejściowy produkt wymiany nici między rekombinującymi, homologicznymi cząsteczkami DNA. W wyniku przecinania i ponownego łączenia się nici na krzyż powstaje figura krzyżowa- Hollidaya. Gdy fig. Hollidaya zostanie przecięta, powstają oddzielne zrekombinowane cząsteczki DNA

• Rekombinacja zlokalizowana, której biorą udział cząsteczki o różnych sekwencjach nukleotydowych, mające jedynie niewielkie odcinki homologiczne, miedzy którymi zachodzi rekombinacja ( cykl lizogeniczny faga E. coli)

Rekombinacja zachodzi miedzy specyficznymi miejscami przyczepu, zwanymi attB w DNA bakterii i attB w DNA faga. Miejsca te mają wspólną nukleotydową sekwencję, zwaną O. w procesie tym biorą udział 2 enzymy- integraza- kodowana przez gen fagowy, i IHF, kodowany przez gen bakteryjny. Enzymy te przecinają obszar O faga i bakterii w dwóch miejscach, przesuniętych w stosunku do siebie o 7 nukleotydów. Powstające wolne końce są łączone ze sobą. Tak wiec rekombinacja zlokalizowana zachodzi w ściśle określonym obszarze DNA rozpoznawanym przez specyficzne enzymy.

• Transpozycja nie jest rodzajem rekombinacji jednak wykorzystuje rekombinację do przeniesienia fragmentu DNA z jednego miejsca w drugie w obszarze genomu.

Rekombinacje zwiększają różnorodność genetyczną i dają duży potencjał ewolucyjny. Rekombinacja może być w skrajnych przypadkach forma naprawy uszkodzonego DNA. Każdy Transpozon koduje transpozazy, która katalizuje proces inercji. Retrotranspozony replikują poprzez intermedia RNA i są spokrewnione z retrowirusami

5.Podklony

6.Kolejne poziomy organizacji genowej u eukariota

Cząsteczka DNA + białka histonowe= chromatyna (różne stopnie kondensacji w zależności od fazy cyklu

Nukleonom składa się z białkowego oktameru, zawierającego po dwa histony rdzeniowe każdego typu oraz owijającego go lewoskrętnie 1,8 razy odcinka DNA. Nukleosomy łączy łącznikowy DNA , a w miejscach w którym DNA wychodzi z nukleosomu znajduje się histon H1. Chromatyna jest zorganizowana w strukturę wyższego rzędu zwaną włóknem 30nm lub solenoidem. Włókna zbudowane są z lewoskrętnej helisy nukleosomów, z której na 1 obrót przypada ok. 6 nukleosomów. W tej formie występuje większość chromatyny. W większej skali DNA zorganizowany jest w pętle dochodzące do 100kpz, występujące w formie włókien 30nm, utrzymywane przez białkowe rusztowanie matriks jądrowej.

na czym polega upakowanie DNA???

                        -nawinięcie na oktamery histonowe

                                    -DNA jest nawinięty na szpulki złożone z białek histonowych

                                    -po dwie cząsteczki H2A, H2B, H3 i H4

                                    -około 150 bp nawinięte na rdzeń, 50 bp łącznika

                                    -około dwa owinięcia DNA na rdzeniu

                                    -obraz z mikroskopu elektronowego - koraliki

                                    -struktura nukleosomu

                                    -w miejscu gdzie jest nukleosom nie ma dostępu do DNA

                                                -trawienie nukleazą Micrococcus

                                                -powstają fragmenty o długości 200, 400, 600 etc.

                                                -nie jest w stanie strawić na nukleosomie

                        -struktury wyższego rzędu

                                    -koraliki zwijają się w grubsze włókno 30 nm - solenoid czy zygzak

                                    -włókno 30 nm zwija się w pętle

                                    -pętle w czasie mitozy zwijają się w chromosom

                                    -słabo poznane, brak dobrych technik ich badania

7.Charakterystyka DNA mitochondrialnego

-większość to cząsteczki koliste, ale genom mitach. niektórych mikroorg euk. są zawsze liniowe

-każde mitochondrium człowieka zawiera ok. 10 identycznych cząsteczek

-na jedno mitochondrium u S. cereviseae może przypadać ponad 100 genomów

wielkość zróżnicowana i niepowiązana ze stopniem zł. organizmu, większość zwierząt wioelokom. ma małe genomy mitach. o zwartej organizacji genetycznej

- geny leżą blisko siebie, odstępy miedzy nimi są niewielkie, zawierają introny (u niższych eukariontów i u roślin kwiatowych), bardzo mało par CG, jedynie 40% to sekwencje kodujące,, sekwencje intronowe kodują kilka białek odpowiedzialnych za procesy rekombinacji,a także Maturazy, wycinające kodujące je introny

-geny RNA rybosomowego, gen białka rybosomowego, kompleks genów oddechowych, gen tRNA

-istnieje kilka białek kodowanych przez mit., są one niezwykle hydrofobowe i nie mogą być transportowane przez błony

8.Omów składniki aparatu transkrypcyjnego  u eukariota

- enzymy katalizujące syntezę RNA na matrycy DNA to polimerazy RNA I, II, III

- sekwencje istotne w procesie inicjacji transkrypcji to promotory, wystepuje podstawowy, położony w miejscu składania kompleksu inicjacyjnego oraz położone powyżej elementy promotorowe

Promotory polimerazy RNA I-promotor podstawowy obejmujący miejsce startu transkrypcji (-45 a +20) oraz elementu kontrolnego położonego powyżej

Promotory polimerazy RNA II - blok -25 TATAoraz sekwencji inicjatorowej Inr obejmująca nukleotyd +1.

Promotory polimerazy RNA III znajdują się wewnątrz genów

-W komórkach eukariotycznych istotą procesu aktywacji transkrypcji są interakcje promotora i sekwencji regulatorowych w DNA z czynnikami białkowymi, które oddziałują z polimerazami RNA. Wyróżnia się 3 kategorie tych czynników: 1) podstawowe czynniki transkrypcyjne niezbędne do inicjacji syntezy RNA na wszystkich typach promotorów, np. TFIID składający się z białka wiążącego sekwencję TATA oraz z przynajmniej 12 białek oddziałująch z TBP-TAF, TFIIA, TFIIB, TFIIF/polimerazaRNAII, FITIE, TFIIH- działa jak helikaza 2) czynniki transkrypcyjne, upstream (ang. upstream factors) rozpoznające krótkie specyficzne sekwencje cis położone przed miejscem startu (ang. upstream) syntezy RNA i zwiększające tempo inicjacji transkrypcji oraz 3) czynniki indukowalne (ang. inducible factors) analogiczne do czynników upstream, lecz syntetyzowane tylko w określonych tkankach i w określonym czasie, wiążące się specyficznie do sekwencji RE (ang. response elements). W rezultacie oddziaływań czynników trans z sekwencjami regulatorowymi możliwe staje się przyłączenie polimerazy RNA i utworzenie kompleksu transkrypcyjnego. Czynniki transkrypcyjne odgrywają kluczową rolę w procesie inicjacji transkrypcji, nie są natomiast niezbędne do elongacji łańcucha RNA

-terminatory

9. Metylacja DNA

• -bardzo istotne zjawisko kontrolujące dostępność do DNA,

• przyłączenie grupy metylowej do cytozyny

• nie zmienia właściwości fizycznych DNA.

• zmienia wzór grup chemicznych w dużej bruździe

• niektóre czynniki transkrypcyjne nie mogą się wiązać do swojej sekwencji w DNA

• białka rozpoznające metylowane DN-wiążą się,ściągają inne białka i powodują zamknięcie chromatyny w danym obszarze, wyłączenie ekspresji genów, wyspy CpG w promotorach genów ssaków

• możliwość podtrzymywania podczas podziałów komórkowych, metyltransferazy de novo, stan chromatyny może być podtrzymany pomimo zachodzących podziałów, możliwość stałego wyciszenia sekwencji szkodliwych (transpozony, wirusy etc.)

• znaczenie w chorobach

10.Czy regulacja transkrypcji jest mozliwa, jesli tak to jak?? Ale nie wiem czy dobrze to opisałam…

Kontrola inicjacji transkrypcji u Bakterii:

-u bakterii decydującą rolę gra czynnik sigma

-operator regulujący proces inicjacji transkrypcji operonu laktozowego- allolaktoza jest induktorem operonu laktozowego, w operonie tryptofanowym cząsteczką regulatorową jest tryptofan sam

-atenuacja

-niektóre białka wiążące się z DNA są aktywatorami, np. białko CAP, które wiąze się z sekwencjami położonymi powyżej wielu operonów

-wzmacniacze i wyciszacze, przyłączające się do sekwencji, które nie są ściśle sprzężone z regulowanym genem, niepowszechne u bakterii

Kontrola u eukariota przez receptory hormonów sterydowych

-hormon sterydowy łączy się w białkiem receptorowym

-receptory zmieniają strukturę, tworzą dimery i przemieszczają się do jądra komórkowego

-receptory wiążą się ze specyficznymi sekwencjami w promotorach wybranych genów i je aktywują

-istnieje klasa genów- housekeeping genes- których ekspresja nie podlega regulacji, w genach tych nie wystepuje sekwencja TATA

11. Budowa genów rRNA

W skład rybosomów Eukariota wchodzą 4 klasy rRNA -26S, 18S, 5,8S i 5S rRNA Tylko 5S rRNA geny są transkrybowane przez polimerazę III, natomiast geny kodujące trzy pozostałe klasy rRNA tworzą wspólną jednostkę transkrypcyjną. U większości Eukariota jednostki te są powtórzone tandemowo w genomie. W komórkach ludzkich znajduje się 5 zespołow genow rRNA, każdy zawiera po 50 kopii tych genów. Pierwotny transkrypt zawiera sekwencję poprzedzające gen 18S rRNA (ETS), krótki odcinek za 3` koncem genu 26 rRNA i oczywiście sekwencje 3 rRNA oraz dwie krótkie sekwencje ITS położone miedzy nimi.

12.Co sie dzieje z pierwotnym transkryptem genu?

Pierwotny transkrypt prokariotyczny mRNA nie ulega żadnym procesom dojrzewania, a translacja może rozpocząć się jeszcze zanim zakończy się synteza mRNA.

Eukariotyczny transkrypt nazywamy heterogennym jądrowym (cała ich populacja), swoiste białka łączą się so snrna i powstaje snrnp, a następnie małe jądrowe RNP 9snRNP) oddziałują z snrnp w celu przeprowadzenia niektórych etapów dojrzewania:

-kapowanie konca 5`

-cięcie i poliadenylacja końca 3`

-splicing -wycinanie intronów

-metylacja

13. Funkcje ubikwityny i jej cykl

Ubikwityna - małe białko obecne we wszystkich komórkach eukariotycznych, odgrywa ważną rolę w pracesie kontrolowanej degradacji białek.

Znaczenie jej w procesie degradacji polaga na naznaczaniu białek przeznaczonych do zniszczenia - poprzez kowalencyjne łączenie się z nimi.
Białko mające ulec zniszczeniu ma zwykle kilka przyczepionych cząsteczek ubikwityny. Następnie zostaje rozpoznane przez odpowiednie proteazy (kompleks proteazy 26S) - proteasom, które dagradują białko, a ubywkitynę przywracają do wtórnego obiegu.

Ubikwityna przyłąca się kowalencyjnie poprzez glicynę z C-końca z grupą aminową lizyny białka przeznaczonego do degradacji. Proces ten jest katalizowany enzymatycznie przy wykorzystaniu ATP. W procesie "opieczętowania" białek bierze udział kilka enzymów.

Białko naznaczone ubikwityną nie ma szans na "przeżycie", musi zostać zdegradowane.
Po przyłączeniu z ubikwityną jest kierowane do proteasomu, gdzie odbywa się proteoliza.
Proteasom to wielkocząsteczkowy kompleks białek (10 i więcej) tworzących cylinder, przez który z jednej strony jest wprowadzane białko, z drugiej - po proteolizie - uwalniane są krótkie polipeptydy oraz ubikwityna.

Ubikwityna nie jest wrażliwa na działanie proteaz budujących proteasom. Jest ona wolna, i może przyłączać się do kolejnych białek, które mają ulec degradacji.

14. Reagenty translacji

Substraty: mRNA, duża i mała jednostka rybosomy, , inicjatorowi aminoacylo-tRNA, inne aminoacylo-tRNA, aminokwasy, GTP i 3 czynniki inicjujące IF1, IF2, IF3 i maja zdolność wiązania się z GTP, 3 czynniki elongacyjne EF-Tu, EF-Ts, EF-Gzdolne do wiązania się z GTP, peptydylotransferaza tworząca wiązania peptydowe bez dostarczania dodatkowej energii, czynniki uwalniające RF powodujące uwolnienie gotowego łańcucha polipeptydowego

Produkty: łańcuch polipeptydowy, GDP

15. Omów dwa modele replikacji

Modele replikacji ustanowiono ze zgledu na rozmaite kształty widełek replikacyjnych

- replikacyjny „oczko” lub forma thera. Jeżeli replikacja DNA rozpoczyna się wewnątrz dwuniciowej struktury chromosomów liniowych lub kolistych, widełki replikacyjny tworza charakterystyczną strukturę „oczka replikacyjnego”, powiększającego się w miare rozsuwania się widełek. Gdy chromosom jest kolisty, powiększające się oczko przyjmuje charakterystyczna forme przypominającą grecka litere teta.

-wg modelu obracającego się koła- synteza rozpoczyna się od przecięcia jednej nici w celu wytworzenia wolnej grupy 3`-miejsce startu syntezy DNA, stąd polimeraza DNA wydłuża przeciętą nić, wędrując po kolistej drugiej nici- matrycy- jak po obwodzie koła. Ponieważ powstająca coraz dłuższa cząsteczka jednoniciowego DNA jest połaczona kowalencyjnie z nicią macierzystą, może ona zawierać wiele powtórzeń replikowanego genomu.

Regulacja ekspresji genow na pozniomie translacji 16

Inicjacja translacji jest ważnym pktem kontrolnym w procesie syntezy białka. Dwa poziomy:

-Regulacja ogólna-dotyczy zasadniczych zmian w ilości syntetyzowanych białek i oddziałuje na wszystkie mRNA w podobnym stopniu. U eukariontów zachodzi to gł. Przez fosforylcje czynnika eIF-2, co powoduje represję inicjacji translacji, ponieważ czynnik ten nie może wiązać cząsteczki GTP. Fosforylacje EIF-2 obserwuje się w czasie szoku cieplnego, kiedy ogolnie obniża się pozim syntezy białek

-regulacja specyficzna dotyczy tylko mechanizmow działających na konkretny transkrypt lub na małą grupe transkryptów, kodujących pokrewne białka, przykładem jest operon kodujący białko rybosomowe E.coli lub specyficzna regulacja translacji u ssaków dotycząca mRNA ferrytyny, białka magazynującego żelazo. W warunkach braku żelaza synteza ferrytyny jest hamowana przez białka wiążące się z sekwencjami nazwanymi elementami odpowiedzi na żelazo. Sekwencje te umieszczone są w liderze mRNA ferrytyny. Związane białka hamuja przesuwanie się wzdłuż mRNA rybosomy, gdyż szuka on kodonu inicjacyjnego. Gdy żelazo jest obecne, białka odłączaja się i mRNA może ulegać translacji

17. Cechy genow kodujacych bialka histonowe??

18. Podaj funkcje bialek szoku cieplengo w dojrzewaniu

Chaperony wiążą się w sposób odwracalny z nie pofałdowanym odcinkiem polipeptydu, który w innym przypadku mógłby służyć jako ośrodek agregacji lub błędnego fałdowania. Chaperony wiążą się z częściowo zwiniętymi łańcuchami umożliwiając im kontynuację zwijania się w sposób najbardziej korzystny energetycznie. Pomagają białkom w uporządkowanym tworzeniu ich struktury przestrzennej. Jedna z rodzin chaperonów nazywana jest białkami szoku cieplnego

19. Jaka jest rola rekombinacji genow?

-wymiana odcinków miedzy homologicznymi odcinkami

-zwiekszenie różnorodności genetycznej komórek

- umożliwia przeżycie organizmów w sytuacjach, gdy na skutek licznych uszkodzeń w obu łańcuchach heliksu DNA ich reperacja i resynteza staje się niemożliwa

-udział w procesach replikacji DNA

20. Co to jest multiplex PCR

Równoczesne zastosowanie w mieszanienie reakcyjnej kilki par starterów- umożliwia badanie na obecność paru patogenów jednocześnie. Produkty muszą róznić się dlugością, aby każdy mógł być zauważony podczas elektroforezy.

21. Cecha charakteryzujaca helise DNA (zal)

-dwuniciowa, łańcuchy owinięte wokół siebie w sposób heliakalny, tworząc dwuniciowy prawoskretną helisę.

-ujemnie naładowane rdzenie cukrowo- fosforanowe DNA znajdują się na zewnątrz, a płaszczyzny zasad każdej nici są ułożone jedna na drugą w centrum helisy

-pomiedzy rdzeniami c-f przebiegają dwa rowki - duży i mały, które także układaja się heliakalnie

-lancuchy połaczone wiązaniami wodorowymi

-lancuchy biegnaą antyrównolegle

22. Kontrola inicjacji transkrybcji u bakterii

-u bakterii decydującą rolę gra czynnik sigma- odpowiedzialny za rozpoznawanie sekwencji zgodnej promotora i potrzebny jest tylko do inicjacji transkrypcji, wiele bakterii wytwarza zestaw alternatywnych czynników sigma

-operator regulujący proces inicjacji transkrypcji operonu laktozowego- allolaktoza jest induktorem operonu laktozowego, wiąząc się z represorem pozwala polimerazie szybko rozpocząć transkrypcje genów lacZYA; w operonie tryptofanowym cząsteczką regulatorową jest tryptofan, operon trp zawiera pieć genów struktury uczestniczących w biosyntezie tryptofanu. Gdyy tryptofan jest w odpowiedniej ilości, wiąze się z represorem i wtedy blokują transkrypcję.

-atenuacja

-niektóre białka wiążące się z DNA są aktywatorami, np. białko CAP, które wiąze się z sekwencjami położonymi powyżej wielu operonów

-wzmacniacze i wyciszacze, przyłączające się do sekwencji, które nie są ściśle sprzężone z regulowanym genem, niepowszechne u bakterii

23. Jak przebiega dojrzewanie pre tRNA?

U prokariotów: dojrzałe rRNA powstaja z dłuższych transkryptów pre- tRNA. Procesy dojrzewania pre-tRNA obejmują egzo i Endonukleolityczne cięciaprzeprowadzane przez RNazy D, E, F i P oraz modyfikacje zasad. Niektóre z modyfikacji są swoiste dla określonych rodzajów tRNA. Po początkowym rozcięciu pre-tRNA od konca3` czasteczlki (kiedy już przyjmnie chartka strukturę) przez RNazy E i F,RNaza D przycina dodatkowo koniec 3`, pozostawiając na nim tylko o 2 nukleotydy wiecej niż w dojrzałej cząsteczce tRNA. Następnie Rnaza P tnie prekursor, formując dojrzały koniec 5` tRNA. W dalszej kolejności RNaza D odcina dwa dodatkowe nukleotydy z końca 3` i zachodzi modyfikacja zasad

U eukariontów: licze eukariotyczne tRNA są syntetyzowane z 14 nukleotydowym intronem oraz z dodatkowymi nukleotydami na koncach 3`i sekwencją liderową 5`. Wszystkie te dodatkowe sekwencje są usuwane w procesie dojrzewania, które rozpoczyna się po przyjęciu przez transkrypt charakterystycznej struktury. W przeciwieństwie do prok tRNA, kończąca od strony 3` cząsteczkę tRNA sekwencja 5`-CCA-3` jest dodawana do eukariotow enzymatycznie przez tRNA nukleotydylotransferazę.następnie usuniecie intronu-endonukleolityczne rozciecie pre-tRNA z obu końców intronu ligacji połowek cząsteczek tRNA Występują liczne modyfikacje zasad.

24. Inhibitory syntezy bialek i mechanizmy ich dzialania

-tetracykliny -blokuje wiązanie tRNA z rybosomem

-makrolidy, aminoglikozydy-jak wyzej kom. prokariotyczne

-chloramfenikol- blokuje transferazę peptydową

Proces wrażliwy na dzialanie cykloheksyamidu, który blokuje transferazę peptydową-u eukariotów

25. translacja mitochondrialna- cechy

-Kodon inicjacyjny AUG w mRNA koduje N- formylometioninę

-kodon inicjacyjny w mRNA jest sygnalizowany jednym z kodonów nonsensownych, występujących w mRNA przed kodonem AUG

-bark sekwencji poli(A) na końcu 3` mRNA

-Rybosomy mniejsze wystepują wolno (brak reticulum )

- kompleks inicjacyjny u bakterii jest składany bezpośrednio przed kodonem inicjacyjnym

-W rybosomie wystepują 3 miejsca -P, A, E

-proces terminacji nie wymaga energii

32. Funkcji ogonka poliA

istnieje wiele hipotez, żadna nie ma przekonywujących dowodów

-wpływ na stabilność mRNA, jednak nie wydaje się to być prawdopodobne bo niektóre transkrypty maja krotkie ogonki

- inicjacja translacji, poparcie dowodami pokazującymi, ze polimeraza poli (A) podlega represji w czasie tych okresów cyklu komórkowego, w których poziom syntezy białka jest stosunkowo niski

-ważna rola regulacyjna, ponieważ jego długość koreluje z wydajnością inicjacji różnych cząsteczek mRNA

34. Cechy DNA kodującego RNA

rRNA

W skład rybosomów Eukariota wchodzą 4 klasy rRNA -26S, 18S, 5,8S i 5S rRNA Tylko 5S rRNA geny są transkrybowane przez polimerazę III, natomiast geny kodujące trzy pozostałe klasy rRNA tworzą wspólną jednostkę transkrypcyjną transkrybowaną przez polimeraze I. U większości Eukariota jednostki te są powtórzone tandemowo w genomie. W komórkach ludzkich znajduje się 5 zespołow genow rRNA, każdy zawiera po 50 kopii tych genów. Pierwotny transkrypt zawiera sekwencję poprzedzające gen 18S rRNA (ETS), krótki odcinek za 3` koncem genu 26 rRNA i oczywiście sekwencje 3 rRNA oraz dwie krótkie sekwencje ITS położone miedzy nimi

tRNA

Polimeraza III odpowiedzialna jest za transkrypcję wielu genów, których produktami są małe cząsteczki RNA -tRNA( 75 nukleotydów), 5S rRNA (120 nukleotydów) i wiele innych RNA, w tym także kodowanych przez niektóre wirusy

Promotor polimerazyIII jest dla genów 5S rRNA i tRNA położony w ośrodku samego genu. Dla genów 5S jest to obszar od 50 do 80 nukleotydów, a dla genów rRNA dwa obszawy- od 9 do 20 i od 50 do 70 nukleotydu. W przypadku genów rRNA odległość między dwoma blokami mogła być zmieniana o ok. 30 nukleotydów bez wpływu na transkrypcję, a dwa konserwatywne bloki odpowiadały konserwatywnym pętlom tRNA

-do transkrypcji genów tRNA konieczne są TFIIIB i TFIIIC, a do syntezy 5S rRNA wymagany jest dodatkowo czynnik TFIIIA

33. Definicja i typy splicingu

Splicing jest to wycinanie intronów z pierwotnych powstających transkryptów pre-mRNA. Jest to proces dwuetapowy, reakcja przeprowadzana jest przez dwa enzymy, jeden z nich rozszczepia wiązania między egzonami i intronem, grugi zaś łączy ze sobą dwa egzony.wycinanie intronów z hn RNA przebiega z udziałem wielu małych RNA z grupy snRNA i wielu białek. RNA wraz z białkami tworzą spliceosom.

Wyróżnia się podstawowy, a także alternatywny, gdy z jednego pre-mRNA mogą tworzyć się różne mRNA. Dzieje się tak, jeżeli:

-używane są różne promotory

-używane są różne miejsca poli(A)

-pozostawione są pewne introny

-pozostawione są lub usuwane pewne eksony

26. Etapy translacji u eukariota - zw. Chemiczne, reagenty

a)inicjacja

-mała podjednostka rybosomy początkowo łączy się z końcem 5` mRNA i skanuje wzdłuż jego sekwencję,aż napotyka na kodon inicjacyjny. Kompleks inicjacyjny jest najpierw składany, w skład którego wchodzi podjednostka rybosomy 40S, inicjatorowi tRNA, eukariotyczny czynnik inicjacyjny eIF-2- trimer skladający się z 3 różnych białek oraz cząsteczka GTP. Gdy kompleks się złozy, łaczy się, za pomocą kompleksu wiążącego się z czapeczką eIF-4F, z końcem 5` mRNA.

-u eukariontów sekwencja AUG wchodzi w skład krótkiej konserwatywnej sekwencji KOZAK, dlatego tez tak łatwo następuje rozpoznanie kodonu inicjacyjnego

-w momencie przyłączenia kompleksu inicjacyjnego, przyłacza się duża podjednostka rybosomy, wymaga to hydrolizy GTP i prowadzi do odłaczenia czynników inicjujących, eIF-5 pomaga uwolnic pozostale czynniki inicjacyjne, natomiast eIF-6 połaczony jest z duża podjednostką rybosomy i zapobiega jej łączeniusie z małą podjednostka w cytoplazmie.

b) elongacja

-w rezultacie przyłączenia się dużej podjednostki rybosomy powstają dwa miejsca, z którymi może wiazać się aminoacylo-tRNA, P-miejsce peptydowe zajęte przez inicjatorowi tRNA naładowany metioniną połaczony z kodonem inicjacyjnym, A-miesce akceptorowe, drugi kodon otwartej ramki odczytu. Po wejściu aminoacylo-tRNA w miejsce A (co dzieje się za pomocą eEF-1)następuje połaczenie dwóch aminokwasów za pomocą wiaz peptydowego przez peptydylotransferazę

-rybosom przesuwa sę o 3 nukleotydy tak,że następny kodon wchodzi w miejsce A

-dipeptydylo-tRNA przesuwa się z miejsca A na miejsce P, z miejsca P usuwany z rybosomy

c) terminacja

-synteza białka kończy się w momencie napotkania jednego z 3 kodonów terminacyjnych

-w miesce A wchodzi nie cząsteczka tRNA, ale białkowy czynnik uwalniający eRF

-potrzebna jest energia z hydrolizy GTP

- w wyniku terminacji nastepuje odłączenie od tRNA kompletnego poli[peptydu, znajdującego się w miejscu P, oraz rozdysocjowanie kompleksu translacyjnego

28. Terminacja translacji -czynnik walniajacy eRF!!! Ale tylko u eukariotów, u prokariota 3 czynniki uwalniające RF-1, RF-2, RF-3, u bakterii proces terminacji nie wymaga nakładu energii

25. Co to jest i dlaczego zachodzi mitochondrialny splaising (splicing) ?

Jest to wycinanie intronowych sekwencji z mRNA mitochondrialnego. W roślinach kwiatowych genom mitochondrialny zawiera sekwencje intronowe, które mogą nie kodować informacji o białku, dlatego należy je wyciąc za pomocą maturazy.

27. Opisz sekwencje wystepujace w DNA

-Sekwencje unikatowe-odcinki o niepowtarzalnym układzie nukle­o­­tydów lub występujące w kilku kopiach, przeważnie dość długie, zazwyczaj kodujące info o białkach, odcinki regula­to­rowe DNA

-Tandemowe zespoly genow-geny występujące w wielokrotnie powtó­rzonych zespołach (10-10000 kopii), kodują ważne pro­du­k­ty potrzebne w dużej ilości (np. rRNA, histony)

-Powtórzenia rozproszone-odcinki występujące w wielu kopiach w różnych miejscach genomu, o funkcji nieznanej,powstające za pomocą transpozycji

-Powtórzenia tandemowe (satelitarny DNA)- odcinki powta­­rzające wielo­krotnie ten sam motyw, spoty­kane w różnych miejs­cach DNA, znacznie w centromerach , mikro i minisatelity o nieznanych funkcjach, zalicza się tez tu odcinki telomerowe

-Operony stanowią cechę charakterystyczna genomów prokariotycznych, są to grupy genów położonych obok siebie w genomie, z tylko jednym lub dwoma nukleotydami pomiedzy końcem jednego genu a początkiem drugiego. Wszystkie geny podklegają transkrypcji wspólnie, jako całość funkcjonalna

31. Budowa aparatu transkrypcyjnego u prokariota

-polimerazy RNA : składa się z 5 podjednostek, oznaczonych jako 2 podjednostki alfa, podj beta, i beta` oraz sigma. Polimeraza rozpoznaje sekwencje -35 i -10 promotora -bloki(a transkrypcja zaczyna się od nukleotydu +1). Specyficzność wiązania zapewnia czynnik σ (sigma).Polimeraz rozmopznaje blok -35, następuje przekształcenie się zamkniętego kompleksu promotorowego w otwarty, zapoczątkowane rozerwaniem wiązań łączących pary zasad wewnątrz bloku -10, bogate w pary AT. Jednostka sigma oddysocjowuje po zakończeniu procesu inicjacji transkrypcji, w wyniku czego holoenzym przekształca się w rdzeń enzymu, przeprowadzający elongacę

- w skład aparatu transk w operonach wchodzą także operatory-regiony sasiadujące z promotorem, represor, który łącząc się z operatorem uniemożliwia przyłączenie się polimerazy RNA, a także induktory i korepresory oddziaływujące na represor