Oznaczanie aktywności surowic

odpornościowych

Odczyn precypitacji, aglutynacji i

immunodyfuzji

Antygen (Ag) - makrocząsteczka obca w stosunku do organizmu, do którego wnika, pobudzająca układ immunologiczny do odpowiedzi:

• humoralnej - swoiste przeciwciała

• komórkowej - swoiste komórki efektorowe

Cechy Ag:

- immunogenność: zdolność do wzbudzania odpowiedzi organizmu

- antygenowość: zdolność do reagowania ze wzbudzonymi przez siebie komórkami lub przeciwciałami

Podział Ag:

1.

- grasicozależne - wymagają obecności limfocytów T dla aktywacji limfocytów B do produkcji Ab. Powstają głównie Ab IgG (wysoka swoistość), wzbudzają dobrą pamięć immunologiczną,

- grasiconiezależne - bezpośrednio aktywują limfocyty B, powstają Ab IgM (niska swoistość), wzbudzają słabą pamięć immunologiczną. Superantygeny.

2.

- cząstkowe (korpuskularne) - silnie immunogenne, całe komórki, wirusy

- rozpuszczalne - słabo immunogenne, toksyny, białka, LPS, DNA/RNA

Przeciwciała (Ab) - białka należące do frakcji gammaglobulin syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty B) w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla rozpoznawanego Ag.

Schemat przeciwciała:

1. fragment wiążący antygen

2. region Fab

3. region Fc

Powinowactwo (ang. affinity) cecha, która określa siłę wiązania pomiędzy pojedynczym epitopem a pojedynczym miejscem wiązania przeciwciała.

Zachłanność (ang. avidity ) wiązanie się Ab z całą cząsteczką Ag wielodeterminantowego.

Przeciwciała monoklonalne (mAb) - skierowane przeciwko jednej determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce wiązania Ag z Ab)

Zastosowanie mAb

W nauce pozwalają:

1. precyzyjnie badać i poznawać nowe struktury na komórkach np. określanie fenotypu

2. badać udział i rozmieszczenie różnych Ag np. Ag glikoproteinowych i glikolipidowych będących regulatorami proliferacji komórek

3. śledzić i poznawać mechanizmy komórkowe i procesy immunologiczne oraz ich zaburzenia np. w transformacji nowotworów

4. badać różne substancje wydzielane przez komórki np. cytokiny, hormony i wykrywać nieprawidłowości w ich produkcji

5. analizować determinanty antygenowe

6. badać strukturę Ab i ich reakcje z Ag

W diagnostyce pozwalają:

1. na bardzo szybkie wykrycie i określenie przynależności gatunkowej szczepów Ag różnych drobnoustrojów w tkance, płynach ustrojowych lub produktach żywnościowych

2. na neutralizację różnych toksyn, blokowania rozpuszczalnych i strukturalnych Ag bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych

3. typować Ag drobnoustrojów

4. typować Ag zgodności tkankowej

5. określać grupy krwi

6. precyzyjnie rozpoznawać niedobory immunologiczne

7. diagnozować choroby nowotworowe

8. mogą być stosowane jako środek immunosupresyjny w przebiegu reakcji transplantacyjnych czy procesów autoimmunologicznych

IZOLOWANIE IMMUNOGLOBULIN Z SUROWICY

• W celu otrzymania immunoglobulin (gł. γ i β-globulin) z pełnej surowicy należy ją umiescic w lazni lodowej i strącac za pomocą powietrzno-suchego, utartego w możdzierzu siarczanu amonowego (NH4)2SO4, dodawanego powoli, małymi porcjami ciągle mieszając.

• W celu uzyskania frakcji IgG (40% nasycenia) do 10ml surowice należy dodać 2,43g (NH4)2SO4, natomiast w celu uzyskania IgM (50%nasycenia) dodać 3,13g (NH4)2SO4 i mieszać aż do wytrącenia osadu.

• Powstały osad wirować przy 6000obr/min. przez 25min., przemyć dwukrotnie odpowiednio 40% lub 50% roztworem (NH4)2SO4 w wodzie destylowanej za kazdym razem wirujac.

• Ostatnie wirowanie przeprowadzic przy 10000obr/min. Osad

• rozpuscic w 2,5ml PBS i oznaczyc zawartośc białka.

Plazma - frakcja krwi pozbawiona elementów morfotycznych (krwinek i płytek krwi), ale zawierająca fibrynogen.

Surowica - frakcja krwi pozbawiona zarówno elementów morfotycznych oraz fibrynogenu (pozostałość po oddzieleniu się skrzepu).

Otrzymywanie surowicy:

1. Krew pobrać do jałowych probówek i pozostawić w temp. 37°C na okres 1h w celu utworzenia się skrzepu.

2. Skrzep okroić jałową pipetą od ścianki probówki i pozostawić w temp. 4°C na czas 0,5-24h w celu ściśnięcia się skrzepu i uwolnienia z niego surowicy.

3. Wirować przy 2500 obr/min. w temp. 4°C przez 10 minut.

4. Surowicę wyjałowić przez sączenie jej przez filtry bakteriologiczne o średnicy 2,5um.

5. Surowicę z dodatkiem lub bez środków konserwujących porcjować, zamrozić i przechowywać w temp. -20°C lub -70°C.

Surowica odpornościowa - surowica o dużej zawartości swoistych przeciwciał otrzymana w wyniku naturalnego lub sztucznego uodpornienia określonym antygenem (wirusy, bakterie, toksyny, komórki, fragmenty tkanek antygeny rozpuszczalne, takie jak białka, polisacharydy itp.)

Surowice odpornościowe dzielimy na:

• Surowice monowalentne - zawierają jeden rodzaj przeciwciał o określonej swoistości względem jednego określonego antygenu.

• Surowice poliwalentne - zawierają wiele przeciwciał o różnej swoistości, czyli skierowanych przeciwko różnych antygenom.

Powstawanie odporności jest długotrwałe, dlatego aby uzyskać surowicę odpornościową należy wykonać szczepienie 2-3 miesiące wcześniej.

Surowicę odpornościową wykorzystujemy:

- w celach leczniczych (np. tężec, błonica), powstaje odporność nabyta, która może być czynna (podajemy szczepionkę odpornościową i zmuszamy organizm do produkcji Ab) lub bierna (podajemy gotowe Ab np.w celu zablokowania toksyny, gdy nie ma czasu uodparniać organizmu)

- w diagnostyce chorób: zakaźnych (wykrywanie Ag cząstkowych w materiale badanym, toksyn, określanie serotypów drobnoustrojów itp.), niezakaźnych (testy immunologiczne służące do wykrywania Ag, niedoborów immunologicznych, chorób alergicznych, nowotworów itp.)

- podając osobom z różnymi niedoborami lub defektami odporności

- w kontroli żywności, leków i kosmetyków

- w preparatyce materiałów biologicznych np.surowice odpornościowe skierowane przeciwko Ag komórek, które chcemy wyizolować z danego materiału

Otrzymywanie surowicy odpornościowej przeciw pełnym kom. bakteryjnym:

1. Wybór zwierząt do immunizacji.

2. Pierwsze szczepienie dożylne: 0,25 ml zawiesiny bakteryjnej o gęstości 1x1010 kom/ml.

3. Tygodniowa przerwa.

4. Drugie szczepienie dożylne: 0,5ml zawiesiny bakteryjnej o gęstości 1x1010 kom/ml.

5. Tygodniowa przerwa.

6. Trzecie szczepienie dożylne: 1ml zawiesiny bakteryjnej o gęstości 1x1010 kom/ml.

7. Pięć dni później sprawdzenie miana aglutynacyjnego surowicy. Jeśli miano jest wysokie w 7 dniu od ostatniego szczepienia skrwawienie zwierzęcia.

Przed immunizacją należy zwrócić uwagę na:

- kinetykę powstawania Ab - odpowiedź pierwotna i wtórna

- naturę Ag - Ag cząstkowe i rozpuszczalne

- Ag grasicozależne i grasiconiezależne

- dawkę i czystość Ag - dla Ag białkowych jednorazowa dawka to 50-200ug

białka

- schemat immunizacji:

• wybór zwierzęcia

• droga wprowadzania Ag - Ag cząstkowe podajemy dożylnie, a Ag rozpuszczalne podskórnie, śródskórnie, dootrzewnowo i domięśniowo

• ilość dawek

• zastosowanie adiuwantu

Wybór zwierząt do immunizacji

• należy wybrać co najmniej 3 sztuki, ponieważ nie każde musi jednakowo odpowiedzieć na zastosowany Ag

• zwierzęta muszą być zdrowe i nigdy wcześniej nie szczepione, ponieważ może dojść do zahamowania reakcji immunologicznej

• zwierzęta muszą być hodowane i przetrzymywane w dobrych warunkach, bez stresów, ponieważ wydzielane hormony i inne czynniki mogą hamować odpowiedź immunologiczną

• zwierzęta muszą być dojrzałe immunologicznie i we wczesnym etapie dojrzałości płciowej, ponieważ wtedy najefektywniej wytwarza Ab

Adiuwanty: związki chemiczne lub ich mieszaniny, które podane łącznie z Ag nasilają jego immunogenność, czyli stymulują do szybszej odpowiedzi na ten Ag

• kompletny adiuwant Freuda - zawiera oleje mineralne, emulgator, prątki gruźlicy

• niekompletny adiuwant Freuda - zawiera oleje mineralne i emulgator

• najczęściej stosowane u ludzi:

- wodorotlenek glinu

- polistyren

- toksoidy (gł. błoniczy i tężcowy) - toksyny pozbawione właściwości toksycznych

- liposomy (kulki lipidowe opłaszczające czynnik, który chcemy wprowadzić)

- cytokiny

TESTY DO BADAŃ SUROWIC ODPORNOŚCIOWYCH

1. Precypitacja

- reakcja między cząsteczką Ab swoistego a Ag rozpuszczalnym (o masie cząsteczkowej 40-160kDa) zachodząca w środowisku płynnym

- 1 faza: Ag reaguje z Ab i powstają kompleksy immunologiczne (KI)

- 2 faza: powstałe KI w środowisku elektrolitów wypadają w postaci precypitatów widocznych gołym okiem

- Ag i Ab łączą się ze sobą w różnych stosunkach ilościowych, do powstania kompleksów widocznych gołym okiem dochodzi w strefie ekwiwalencji, czyli strefie równowagi stężeń obu reagentów

Na przebieg tej reakcji wpływają:

• stosunki ilościowe Ab i Ag

• stężenie elektrolitów w środowisku reakcji (optymalne 0,85%NaCl)

• pH środowiska (6,5-8,5)

• temperatura (zależenie od gatunku zwierząt, od których pochodzi surowica odpornościowa, np.. Ab królicze precypitują w temp. 37°C, 20°C i 4°C, a Ab końskie w temp. 37°C

Przed nastawieniem reakcji precypitacji należy pamiętać o inaktywacji surowicy, ze względu na obecność dopełniacza, który może rozpuszczać KI.

Inaktywacja zachodzi w temp. 56°C przez 30 min.

2. Immunodyfuzja

- reakcja precypitacji zachodząca w środowisku żelowym

- oparta jest na zjawisku dyfuzji cząsteczki Ag i Ab w żelu

- precypitat powstaje w strefie ekwiwalencji w miejscu zetknięcia się obu reagentów, widoczny w postaci linii, łuków lub pierścienia precypitacyjnego

- szybkość dyfuzji reagentów w żelu jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki i wprostproporcjonalna do stężenia reagentów

- stosuje się zwykle 1-2% żel agarowy lub agarozowy jako środ. reakcji, który pozwala na swobodną dyfuzję

- zależy od takich samych czynników co precypitacja probówkowa

Dwa typy immunodyfuzji:

• pojedyńcza - dyfunduje tylko jeden z reagentów (zwykle Ag), a drugi z nich (Ab) występują w żelu w jednakowym stężęniu

• podwójna - zarówno Ag i Ab dyfundują w żelu

- można wykonywać w probówkach i na płytkach

Reakcja dyfuzji radialnej wg Manciniego

- służy do ilościowej oceny Ag

- Ab unieruchomione są w żelu agarozowym, a Ag dyfunduje

Podwójna reakcja dyfuzji wg Ouchterlony'ego

- dyfundują cząsteczki Ab i Ab

- pozwala określić czy badane Ag zawierają identyczne, wspólne czy też różne determinanty antygenowe

Podwójna reakcja dyfuzji wg Ouchterlony'ego

Zastosowanie metod precypitacji i immunodyfuzji:

• do oznaczeń ilościowych, czyli oceny poziomu Ab w surowicy odpornościowej przez określenie miana precypitacyjnego

Miano precypitacyjne jest to najmniejsze stężenie Ag, przy którym powstaje jeszcze pierścień precypitacyjny.

• do oznaczeń jakościowych, czyli wykrywania Ag przy użyciu wzorcowych Ab lub wykrywania Ab w surowicach badanych przy użyciu wzorcowego Ag

• do oceny identyczności i złożoności Ag Zastosowanie metod precypitacji i immunodyfuzji

3. Aglutynacja

- reakcja zachodząca pomiędzy swoistymi Ab a Ag cząstkowymi (wchodzącymi w skład otoczek komórek bakteryjnych, grzybów, erytrocytów, komórek ludzkich i zwierzęcych)

- może zachodzić między swoistymi Ab a Ag rozpuszczalnym opłaszczonym na cząsteczkach lateksu

- komórki z przyłączonymi Ab tworzą przestrzenne agregaty wypadające z roztworu w postaci aglutynatu

Test aglutynacji bezpośredniej:

• Wykrywa obecność antygenu w surowicy, plwocinie, wymazie pacjenta

• Kuleczki opłaszczone są przeciwciałami swoistymi wobec wykrywanego Ag

• Wynik pozytywny: aglutynacja

• Wynik negatywny: brak antygenu = brak aglutynacji

Test aglutynacji pośredniej:

• Wykrywa obecność swoistych przeciwciał w surowicy, plwocinie, wymazie pacjenta

• Kuleczki opłaszczone są określonym antygenem

• Wynik pozytywny: aglutynacja

• Wynik negatywny: brak swoistych przeciwciał = brak aglutynacji

Przebieg aglutynacji zależy od:

• pH

• temperatury (aglutyniny "zimne" to przeciwciała klasy IgM, które najlepiej wiążą aglutynogen w zakresie 4-22 stopni Celsjusza, aglutyniny "ciepłe" natomiast są przeciwciałami IgG i wiążą one najlepiej antygeny w temperaturze zbliżonej do naturalnej ciepłoty ciała)

• czasu (zwykle zawiera się w przedziale 15-60 minut)

• siła jonowa (zazwyczaj im mniejsza siła jonowa, tym lepiej aglutyniny łączą się z aglutynogenami)

Aglutynogenami nazywamy cząstki zlepiane podczas aglutynacji przez aglutyniny.

Aglutyniny to przeciwciała biorące udział w zlepianiu aglutynogenów podczas aglutynacji.

• Aglutynacja jest odczynem stosowanym w chorobach zakaźnych, wywoływanych przez bakterie, nie ma natomiast zastosowania w chorobach wirusowych.

• Z najbardziej znanych odczynów należy wymienić odczyn Widala w durze brzusznym, odczyn Weila-Felixa w durze plamistym, odczyn Wrighta w tularemii i w szeregu innych chorób.

• Teoretycznie można go stosować wszędzie tam, gdzie wyhoduje się drobnoustrój, z którego można sporządzić antygen.

• Zaletą odczynu jest prostota jego wykonania, szybkość wystąpienia reakcji, łatwość odczytania wyników i stosunkowo wysoka czułość.

Zastosowanie metody aglutynacji

• w identyfikacji Ag powierzchniowych komórek

• do wykrywania Ag w badanych surowicach

• do oznaczania poziomu Ab w surowicy przez wyznaczenie miana aglutynacyjnego

Miano aglutynacyjne jest to największe rozcieńczenie surowicy badanej (lub najmniejsze stężenie Ag), przy którym widoczne są jeszcze aglutynaty.

4. Hemaglutynacja

• aglutynacja czerwonych krwinek

hemaglutynacja bezpośrednia, czyli czynna, w której zlepianie erytrocytów wywoływane jest przez różne drobnoustroje. To zjawisko może zostać zahamowane działaniem surowicy zawierającej swoiste przeciwciała skierowane przeciwko drobnoustrojom zlepiającym krwinki

hemaglutynacja pośrednia, czyli bierna, zachodzi wówczas, gdy na erytrocyty opłaszczone jakimś antygenem zadziałamy surowicą odpornościową, zawierającą przeciwciała swoiste dla antygenu zaadsorbowanego na powierzchni krwinki.

• odczyn biernej hemaglutynacji wykorzystuje się do określania miana przeciwciał. Wyznacza je dodatnia reakcja antygen - przeciwciało uzyskana z najwyższym rozcieńczeniem surowicy. Może mieć to wartość diagnostyczną w przypadku niektórych choró np. podwyższenie miana może wskazywać na aktywny proces chorobowy.

Test zahamowania hemaglutynacji

Białka niektórych wirusów mają zdolność do zlepiania erytrocytów - jest to wykorzystywane w diagnostyce

Hemaglutyniny - glikoproteiny o wł. antygenowych znajdujące się na powierzchni wirusów i bakterii. Ich funkcją jest przyłączenie cząsteczki drobnoustroju do powierzchni infekowanej komórki (np. hemaglutyniny wirusa grypy, odry, świnki, różyczki)

REAKCJE KRZYŻOWE Ag POLISACHARYDOWYCH I BIAŁKOWYCH OZNACZANE METODĄ AGLUTYNACJI ILOŚCIOWEJ

• W naturze większość Ag to polisacharydy i białka. Są to Ag strukturalne wielodeterminantowe wzbudzające w organizmie produkcję Ab wieloswoistych.

• Błona zewnętrzna wszystkich drobnoustrojów posiada różne białka wchodzące w skład otoczek, fimbrii i rzęsek. Są one bardzo silnymi aktywatorami związków prozapalnych i bardzo silnymi immunogenami wzbudzającymi produkcję Ab. Ag pobudza immunokompetentne komórki organizmu do produkcji Ab lub komórki efektorowe do dalszego różnicowania się, a następnie komórki różnicujące się rozpoznają dany Ag, łączą się z nim, przetwarzają go i niszczą.

• Swoiste Ab i aktywowane komórki efektorowe wiążą się z Ag przez paratop (czyli ten fragment przeciwciała, który wiąże się bezpośrednio z epitopem na danym antygenie).

• Determinanty (epitopy) dzielimy na:

liniowe - ich immunogenność zależy od kolejności ułożenia aminokwasów (AA) w peptydzie, a wzbudzane przez nie Ab są monoswoiste

strukturalne - mogą wzbudzać produkcję różnych Ab o podobnej swoistości, więc bardzo często podczas reakcji takich Ab z Ag strukturalnymi dochodzi do reakcji krzyżowych

• Przy wykonywaniu odczynu aglutynacji bakteryjnej należy wziąć pod uwagę możliwość wystąpienia reakcji:

- współaglutynacji - zlepiania się drobnoustrojów posiadających wspólne determinanty antygenowe w obecności tej samej surowicy

- paraaglutynacji - zlepiania się drobnoustrojów, które poprzez przebywanie w tych samych warunkach hodowlanych nabywają podobieństw antygenowych

- pseudoaglutynacji - zlepiania się drobnoustrojów w samym elektrolicie (aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich, należy nastawić próbę kontrolną z samym elektrolitem)

• Współaglutynacja- odczyn Castellaniego

Zachodzi w obecności jednej surowicy odpornościowej w wyniku występowania w zawiesinie bakteryjnej wspólnych Ag jednego rodzaju.Obserwuje się głównie w serodiagnostyce pałeczek z rodz. Salmonella Aby odróżnić swoisty i nieswoisty odczyn aglutynacji wykorzystuje się tu zjawisko swoistej absorpcji aglutynin (Ab aglutynujących) zwane odczynem Castellaniego .

- wykorzystywany do uzyskiwania wysokospecyficznych grupowych surowic monowalentnych

- odczyn polega na kolejnym dodawaniu do surowicy heterologicznych szczepów bakterii

- w wyniku zjawiska współaglutynacji Ab surowicy wiążą swoiste aglutyniny surowica staje się bardziej monoswoista

• Przykład:

Aby wyeliminować reakcje współaglutynacji w odczynie aglutynacji z surowicą przeciwko Salmonella typhi należy absorbować tę surowicę kolejno zawiesinami bakterii:

- S.typhi O

- S.pratyphi Bo

- S. typhimurium

- S. enteritidis

o gęstości 1x1010 kom/ml, pozostawiając za każdym razem na 1 h w temp. 37°C a następnie na 1 h w 4°C, wirując po każdej absorpcji (4000 obr/min, 20 min)

• Wyróżnia się:

- Aglutynina H - przeciwko antygenom rzęskowym. Tworzy się tu delikatny, wątły strąt, który łatwo ulega rozbiciu przy wstrząśnięciu. AGLUTYNACJA OBŁOCZKOWA

- Aglutynina O - przeciwko antygenom somatycznym. Tworzy ona na dnie probówki trwały osad grudkowy. AGLUTYNACJA GRUDKOWA

Salmonella enterica typhi (dur brzuszny= tyfus)

- obligatoryjny patogen, charakterystyczny tylko dla człowieka

- należy do rodziny pałeczek jelitowych Enterobacteriaceae

- Gram- ujemna, względny beztlenowiec

- wykazuje zdolność ruchu

- zakażenie odbywa się drogą pokarmową, z kropelkami śliny

Czynniki chorobotwórczości:

-Ag polisacharydowy, somatyczny(Ag O) - endotoksyna

-Ag wirulencji (Ag Vi) - antyfagocytarny

-Ag rzęskowy (Ag H)

-białka powodujące przyleganie i penetrację komórek nabłonkowych jelita

- czynniki uodparniające bakterie na fagocytozę (neutralizujące aktywne rodniki tlenowe): katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa

Przebieg choroby:

1 tydzień- okres bezobjawowy (zajęcie jelita cienkiego i przedostanie się z

limfą do krwiobiegu)

2 tydzień- bardzo wysoka gorączka, bóle mięśni, głowy, brzucha, stan

odurzenia aż do utraty przytomności, obniżenie ciśnienia krwi, brak łaknienia,

pojawia się wysypka durowa w dolnej części klatki piersiowej, brzuchu, czasem

kończynach dolnych

3 tydzień- powstają głębokie owrzodzenia jelita, prowadzące często do jego

perforacji, zakażenia otrzewnej, a nawet śmierci (bakterie z krwią dostają się do

wątroby, woreczka żółciowego i z żółcią ponownie spływają do jelita)

4-5 tydzień- następuje zdrowienie, ale drobnoustroje nadal są w woreczku i

drogach moczowych

Proteus vulgaris

- Gram- ujemne pałeczki

- charakteryzują się zdolnością do aktywnego ruchu

- występują w przewodzie pokarmowym ludzi jako naturalna

mikroflora

- to patogen oportunistyczny, wywołujący w sprzyjających

warunkach zakażenia ran, infekcje dróg moczowych, często

przewlekłe, trudne do leczenia, z powikłaniami, z tworzeniem się

kamieni moczowych

---