Metody stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej:

BAKTERIOLOGICZNE, IMMUNOLOGICZNE, MOLEKULARNE

⇓

badanie: mikroskopowe, hodowlane, metabolizmu drobnoustrojów (identyfikacja do gatunku)

Jak badamy drobnoustroje?

• wstępna obserwacja mikroskopowa - morfologia komórki

• izolacja drobnoustroju w czystej hodowli

• izolacja czystych kultur (czysta hodowla)

• metoda bezpośrednia - mikromanipulator, metoda rozcieńczeń

• metoda płytkowa - posiew redukcyjny პ kolonia = cfu (colony forming units - jednostki tworzące kolonie, j.t.k.)

• wybór odpowiedniego podłoża

• dobór warunków hodowli

• ocena morfologii drobnoustroju - morfologia kolonii, typ wzrostu na podłożu płynnym

• zbadanie jego właściwości fizjologicznych

• zbadanie udziału izolowanego drobnoustroju

• ocena antybiotykowrażliwości drobnoustroju (antybiogram)

CECHY POŻYWKI:

• odpowiednie pH (7,0 - 7,4), skład, stężenie soli mineralnych

• izotoniczność, potencjał oksydo-redukcyjny, klarowność, sterylność

PODŁOŻA HODOWLANE:

Podział ze względu na stan skupieniu (zawartość agaru)

• płynne

• półpłynne (0,5% - 1% agaru) - ocena zdolności ruchu Ⴍ

• stałe (1,5% - 3% agaru) - płytki Petri'ego, skosy

Podział ze względu na skład

• naturalne (o nieokreślonym składzie chemicznym) np.: mleko, krew, surowica

• sztuczne (o nieokreślonym składzie chemicznym)

• syntetyczne (o określonym składzie chemicznym)

Podział ze względu na funkcje i skład

• proste (agar tryptozowo-sojowy, woda peptononowa)

• wzbogacone (agar z krwią baranią, bulion mózgowo-sercowy)

• wybiórczo-namnażające (agar Sabourauda, p. z cetrimidem)

• wybiórczo-różnicujące (p. McConkey'a, p. Chapmana)

• różnicujące (ocena fermentacji cukrów, wytwarzania ureazy)

• specjalne (p. czekoladowe, Loefflera, Loewensteina-Jensena)

• chromogenne (MRSA agar, RLM - Rapid Listeria monocytogenes)

• transportowe, transportowo-namnażające (Uromedium)

DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - SKŁADNIKI ODŻYWCZE

• Bakterie wybredne: Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae

• Bakterie niewybredne: E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - DOSTĘP TLENU:

• bezwzględne (ścisłe) tlenowce - Bacillus spp.

• mikroaerofile (O₂ 2-8%) - Helicobacter pylori

• fakultatywne (względne) beztlenowce - E. coli, S. aureus

• bezwzględne beztlenowce (O₂<0,5%, E_h <0,2 V) - Bacteroides fragilis, Clostridium spp.

• hodowla - anaerostat, GAsPak, p. z tioglikolanem sodowym

• kapnofile (~10% CO₂) - Haemophilus influenzae

• hodowla - cieplarki z przepływem CO₂

DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - TEMPERATURA

• psychrofile np.: Alcaligenes spp. temperatura optymalna 15-20°C, min.10°C, max. 45°C

• mezofile np.: Escherichia coli temperatura optymalna 37°C

• termofile np.:Thermus aquaticus temperatura optymalna 60°C

• ekstremo termofile np.: Thermococcus spp. temperatura optymalna 85-90°C

DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - pH

• Acidofile - pH 2-5, optimum pH 3-4, np.: Candida albicans

• Neutrofile - pH 6-7,5, optimum pH ~7, np.: E. coli, S. aureus

• Alkalofile - pH 8-11, optimum pH 9, np.: Vibrio cholerae

Kolonia - „skupisko komórek”, „klon”, zespół komórek tego samego gatunku (pochodzący z jednej komórki) na podłożu stałym

Opis kolonii (hodowla na podłożach stałych!)

• kształt, wielkość, brzeg, powierzchnia, „wyniosłość”, kolor, konsystencja, zawieszalność, zapach,

• inne: np.: typ hemolizy na podłożach z krwią:

• beta - całkowita liza erytrocytów np.: S. aureus

• alfa - niecałkowita liza erytrocytów np.: S. pneumoniae

• gamma - brak hemolizy np.: Staphylococcus epidermidis

Typ wzrostu na podłożach płynnych

• bezwzględne tlenowce - kożuszek

• fakultatywne (względne) beztlenowce- wzrost dyfuzyjny

• bezwzględne beztlenowce - osad

METODY IDENTYFIKACJI - identyfikacja do gatunku

I. Identyfikacja (z użyciem hodowli drobnoustrojów)

• testy biochemiczne

• metody molekularne

• metody chemiczne

• profile kwasów tłuszczowych / białek

• metody immunologiczne

II. Identyfikacja (bez użycia hodowli drobnoustrojów) w przypadku drobnoustrojów wolnorosnących, trudno hodowlanych lub niehodowlanych

• metody molekularne

• metody serologiczne (wykrywanie antygenów /przeciwciał)