Katarzyna Szyło
Inżynieria Środowiska
Ćwiczenie 4
Funkcje fizjologiczne organizmów. Biokataliza.
Badania wykonywane na osadzie czynnym z biologicznej oczyszczalni ścieków na Janówku we Wrocławiu.
Zad.1. Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej osadu czynnego testem TTC (chlorek trójfenylotatrazolowy ). Badanie wpływu czynników fizycznych fizycznych chemicznych na aktywność enzymatyczną.
Wpływ temperatury na aktywność dehydrogenazową
1ml Osad czynny + 1ml bufor Tris HCl o pH=8,4 + 0,4ml roztwór TTC
w temp. 10oC w temp. 37 oC
Intensywność barwy: ++ intensywność barwy: ++++
W temp. 45 oC w temp. 100 oC
Intensywność barwy: +++++ intensywność barwy: 0 (brak reakcji)
Czerwone zabarwienie próbek świadczy o aktywności enzymu. Bezbarwny TTC, akceptując atomy wodoru, uległ redukcji do czerwonego TF (trójfenylofurazonu-formazanu), zaś intensywność tej barwy świadczy o wzroście lub spadku aktywności enzymatycznej.
Wniosek: w temperaturze ok.45 oC aktywność enzymatyczna jest największa (optymalna).
Wpływ pH na aktywność dehydrogenazową
1ml osad czynny + 1ml bufor Tris HCl o pH 3, 8,4, 10 + 0,4ml TTC
pH=3 pH=8,4 pH=10
Intensywność barwy: + intensywność barwy: ++++ intensywność barwy: ++++
Wniosek: aktywność dehydrogenaz jest optymalna w pH ok. 9 (środowisko zasadowe)
Jednakże różne enzymy posiadają własne optima pH dla nich charakterystyczne.
Możemy stwierdzić, iż optimum aktywności większości enzymów zawiera się w przedziale temperaturowym 35-45 oC przy optymalnym odczynie środowiska pH=8-10
Wpływ substancji toksycznej na aktywność enzymatyczną
1ml osad czynny + 1ml 15% octan ołowiu + 1ml bufor Tris HCl + 0,4ml TTC
„Pb” „K”-kontrola
Intensywność barwy: 0 (brak reakcji) intensywność barwy: 0 (brak reakcji)
Zad.2. Wykrywanie aktywności katalazowej.
H2O2 + H2O2 (katalaza) -> 2H2O + O2
1) 1ml osad czynny + 0,5ml H2O2 2) „K”- próba po ogrzewaniu w temp. 100 oC
W próbie „K” (2) brak reakcji spowodowany denaturacją enzymu pod wpływem temperatury.
W próbie (1) zaszła burzliwa reakcja: pod wpływem nagłego uwalniania się gazu O2,, osad czynny został „wypchnięty” na powierzchnię roztworu.
Zad.3. Wykrywanie aktywności oksydazowej.
2ml osad czynny + 10 kropli 1% r-r pirokatechiny + temp. 40 oC (1h)
1) osad + enzym 2) osad + enzym + temp. 100 oC (5min.)
Po inkubacji w temp. 40 oC:
brunatne zabarwienie, świadczące o aktywności oksydazowej
brak odczynu barwnego - brak reakcji spowodowany denaturacją enzymu
Zad.4. Wykrywanie aktywności ureazowej na podłożu mocznikowym.
Osad czynny wprowadzamy ezą do pożywki zawierającej indykator.
Osad czynny + pożywka + temp. 37 oC (48h)
Po 48 godzinnej inkubacji w temp. 37 oC:
W wyniku alkalizacji środowiska uwalnianymi kationami amonowymi nastąpiła zmiana barwy pożywki (indykatora). Świadczy to o aktywności enzymatycznej (ureazowej).
Próba kontrolna nie dała reakcji barwnej- brak aktywności enzymatycznej.
Zad.5. Wykrywanie aktywności proteolitycznej.
Posiew metodą kłutą na słupek żelatynowy. Inkubacja w temp. 20 oC (7 dni)
Po inkubacji:
Żelatyna nie uległa w pełni upłynnieniu. U góry słupka żelatynowego powstał białawy osad.