25. Co to jest metoda PCR i do czego służy.
Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) to łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika została wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.
Zaletą tej metody jest możliwość:
-analizy DNA wyizolowanego w bardzo małej ilości, np. z pojedynczej komórki zarodka
-namnażanie tylko wybranego fragmentu DNA -analiza całego genu lub jego fragmentu
-zwielokrotnienie DNA w krótkim czasie
Aby przeprowadzić reakcję PCR, musimy przygotować mieszaninę reakcyjną, umieścić ją w małych probówkach i wstawić do specjalnego urządzenia zwanego termocyklerem, który zaopatrzony jest w blok grzejny kontrolowany mikroprocesorem.
Skład mieszaniny reakcyjnej:
Matrycowy DNA- zazwyczaj jest to jednoniciowe DNA, które możemy uzyskać na drodze denaturacji 2-niciowego DNA, zazwyczaj wykorzystuje się genomowe DNA, ale można użyć także RNA, jednak wcześniej należy przepisać je na DNA za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy.
Startery- krótki jednoniciowy fragment DNA(10-13 nukleotydów, -lepi 20)Startery projektujemy tak, aby był komplementarny do jednego końca docelowego fragmentu DNA, powinny zawierać zbliżoną liczbę par C-G i mieć podobną temp łączenia. Ważne dlatego jest, aby znać końcówki docelowego fragmentu DNA , który chcemy amplifikować.
polimerazy DNA - rodzaj enzymu, który syntetyzuje nowe nici DNA komplementarnych do sekwencji docelowej. Pierwszym i najbardziej powszechnie używanym jest Taq polimeraza DNA (aquaticus Thermis ),
wolne trifosforany deoksyrybonukleotydów(dNTP) - każda reakcja PCR wymaga wszystkich 4 (dATP, dGTP, dTTP, cCTP). Cząsteczki te są substratem dla polimerazy DNA, która na zasadach komplementarności wbudowuje je do nowo syntetyzowanej nici DNA
Bufor reakcyjny- zapewnia odpowiednie pH reakcji, zawiera również jony metali( magnezu) bez których polimeraza byłaby nieaktywna
W reakcji pcr namnażamy sekwencje DNA poprzez powtarzające się cykle, każda nowa nić służy jako matryca w następnym cyklu, w rezultacie liczba kopii rośnie wykładniczo 2n, gdzie n to liczba cykli.
Każdy cykl składa się z następujących etapów:
Denaturacja- zachodzi w temperaturze 95' i trwa 60 sekund, polega na rozdzieleniu dwuniciowego DNA pod wpływem podwyższonej temperatury, która powoduje rozerwanie wiązań wodorowych, destabilizację helisy i rozpad cząsteczki DNA na pojedyncze nici, które mogą być kopiowane przez polimerazę DNA
Przyłączanie starterów- etap ten trwa 30 sekund i zachodzi w niższej temperaturze - 40-60' , temperatura tu jest obliczana indywidualnie dla każdego startera, zależy od długości i sekwencji( od ilości par G-C)
Elongacja- ten proces zachodzi w temperaturze 72' i trwa od 60 do 90 sekund. Polimeraza dobudowuje nić, w wyższej niż temp. przyłaczania starterów gdyż w tej temperaturze polimeraza wykazuje największa aktywność. W pierwszym cyklu replikacyjnym synteza nowych nici prowadzona jest z każdego startera w kierunku drugiego startera, powstające nowe nici wykraczają poza sekwencję docelową, ponieważ nic nie zapobiega kopiowaniu matrycy. Aby proces ten zatrzymać należy zwiększyć temperature do 95'C.W 2 cyklu starter po związaniu z nicia syntetyzowaną w 1 cyklu kopiuje ją do miejsca, w którym znajdował się pierwszy starter, w następnych cyklach otrzymujemy już docelowy odcinek DNA.
Czas reakcji PCR dobierany jest do długości startera.
PCR ma szerokie zastosowanie:
klonowania,
inżynierii genetycznej,
sekwencjonowania,
w kryminalistyce,
do wykrywania określonych genów lub odcinków genów,
do wykrywania nosicielstwa mutacji powodujących choroby genetyczne,
do określania płci,
wykrywania ojcostwa,
genotypowania zgodności tkankowej,
identyfikacji ofiar,
w badaniach nad genomem,
charakterystyce ekspresji genów,
paleontologii.
1