ZADANIE PCR

Zaprojektuj reakcję PCR, w której otrzymasz fragment białka EcR z Bombyx mori, obejmujący aminokwasy: Val6 - Arg74. Pamiętaj, że produkt reakcji będzie w kolejnym etapie wklonowany do wektora ekspresyjnego pTS-2. Wybierz odpowiednie miejsce/miejsca restrykcyjne. Ogranicz liczbę aminokwasów pochodzących z wektora.

A. Zaprojektuj „startery” posiadające odpowiednie miejsca restrykcyjne.

B. Podaj składniki mieszaniny reakcyjnej - załóż, że zaprojektowane przez Ciebie „startery” zakupiłeś(aś) w firmie, która przysłała je podając następujące stężenia: C_R=15,0 pmol/μl; C_F=0,2 μg/μl. Matryca z wklonowanym genem całego białka (plazmid BS SK(+)/BmEcR) ma stężenie: cDNA = 7,5 ng/μl.

C. Zaprojektuj poszczególne kroki programu PCR. Załóż, że dysponujesz polimerazą Vent (4U/μl) o procesywności 500 nukleotydów/30s, optimum aktywności (synteza DNA) enzym wykazuje w temperaturze 75°C; optymalne stężenie dNTP wynosi 0,2mM (probówka dostarczona przez producenta zawiera dNTP w stężeniu 1,4mM), optymalna liczba jednostek enzymu na jedną reakcję wynosi 2U.

Sekwencja cDNA (nić kodująca) EcR z Bombyx mori obejmująca reszty: Met1-Ser80:

1 atgagagtcgagaacgtggataacgtatcgtttgctttgaacggacgcgctgacgagtgg 60

1 M R V E N V D N V S F A L N G R A D E W 20

61 tgtatgtctgtagagacgcgtttagatagtttagtgcgagaaaaaagtgaagtgaaagcc 120

21 C M S V E T R L D S L V R E K S E V K A 40

121 tacgtcggaggatgtccctcggtaatcacggatgctggagcgtatgacgcgctcttcgac 180

41 Y V G G C P S V I T D A G A Y D A L F D 60

181 atgagacgccgctggtctaataacggtggcttcccgctgcgaatgcttgaagagagctct 240

61 M R R R W S N N G G F P L R M L E E S S 80

Polilinker (MCS) wektora pTS-2:

kodon startu

... ATG GTT TGG AAT TCT CCG GAT CCT GTC TGA GAA GCT TAT GGC TGA AGT GA...

EcoRI BamHI STOP HindIII STOP STOP

POWODZENIA

TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

---