Biologia molekularna 7.05.11

Struktura i działanie

Całe RNA

↙ ↘

RNA kodujący RNA niekodujący

↓ ↙ ↙ ↙ ↓ ↓ ↘

pre- mRNA pre-tRNA pre- rRNA sinRNA snoRNA scRNA inRNA

↓ ↓ ↓ oraz różne inne

mRNA tRNA rRNA

snRNa biorą udział w dojrzewaniu innych cząsteczek RNA, często tworzy kompleksy z białkami (snRNP)

snoRNA- mały jąderkowy, bierze udział w dojrzewaniu innych RNA

tmRNA (transportuje informacje)- przypina etykietki peptydowe do białek nieprawidłowo zsyntetyzowanych, wyznacza je do degradacji

rRNA- rybosomalny (80% całego RNA)

tRNA- transportujący, bierze udział w syntezie

hnRNA- heterogenny, jądrowy

Tylko jedna nić dla danego genu jest transkrybowana (nić sensowna)- kierunek translacji 5'-3', gdy druga nić nonsensowna

Geny są na obu niciach….

Polimeraza RNA I- znajduje się w jąderku, odpowiada za syntezę większości prekursorów rRNA

Polimeraza RNA II- znajduje się w nuklepolazmie, odpowiada za syntezę prekursorów mRNA i niektórych małych jąderkowych RNA

Polimeraza RNA III- znajduje się w nukleoplazmie, odpowiada za syntezę prekursorów 5S rRNA, tRNA i innych małych jąderkowych i cytoplazmatycznych RNA

Polimerazy wiążą się z mniejszym rowkiem, a strukturą rozpoznającą jest β-harmonijka.

Charakterystyczne/…….

Enhancery- wzmacniacze transkrypcji, hiperacetylacja N-końców histonów

Silencery- wyciszacze transkrypcji, deacetylacja N-końców histonów

Metylacja DNA hamuje transkrypcję genów. Metylowana jest cytozyna dzięki metylotransferazie DNA w niektórych sekwencjach 5'CG3' (wyspy CpG)- przykład chromatyny nieaktywnej transkrypcyjnie: ciałko Barra.

CPSF- czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji

CstF- czynnik stymulacji cięcia

PAP- polimeraza Poli(A), polimeraza RNA niezależna od DNA

Geny HOUSEKEEPING- utrzymujące porządek w domu

• Nie podlegają regulacji

• Nie zawierają sekwencji TATA, tylko ok. 30pz obszar bogaty w GC i zawierają miejsca wiązania dla czynnika transkrypcyjnego

• Wyspy CpG, w pobliżu których się znajdują kiedy nie są etylowane

• Należą tu geny kodujące białka rybosomalne, enzymy cyklu Krebsa

Elongacja

Czynnik elongacyjny	funkcja
P-TEFb TFTIS	Przeciwdziałają pauzowaniu polimerazy RNAIII, która może nastąpić wówczas, gdy enzym przeprowadza transkrypcję regionu, gdzie kompatybilne zasady mogą łączyć się ze sobą w obrębie jednej nici
ELL TFIT Elongine	Zapobiegają zatrzymywaniu się polimerazy RNA, która następuje wówczas, gdy polimeraza RNA przedwcześnie uwalnia koniec 3' transkrypcyjny, co może być skutkiem pauzowania

TERMINACJA:

Polimeraza I- udział białek typu Reblp/TF-1 i PIRF (czynnik uwalniający polimerazę i transkrypt)

Polimeraza II- ciąg reszt Da np. dla genu 5S reszt (????)

Homeodomena- przykład domeny typu helisa-skrypt- helisa (HTH)

Czynniki transkrypcyjne składają się z domeny wiążącej (rozpoznającej) DNA oraz….

• Zazwyczaj α-helisa jest domeną rozpoznającą

• Przeważnie oddziałują z większym rowkiem

• Wyjątek: domena TBP

Niektóre czynniki transkrypcyjne mogą tworzyć dimery, mogą powstawać różne rodzaje homodimerów.

Introny mogą ulegać samo wycinaniu- jest to przykład enzymu RNA, czyli rybozymu (introny w rRNA….., w genomie mitochondrialnym i chloroplastowym w pre-mRNA i rRNA)

Rybozym- cząsteczka RNA wykonująca funkcje katalityczne

Splicing

Wycinanie różnych fragmentów i powstają różne efekty końcowe, czyli białka. Umożliwia zaoszczędzenie miejsca w genomie.

AMPLIFIKACJA

Enzymy i białka biorące udział w replikacji:

• Polimeraza DNA

• Helikaza DNA

• Topoizomerazy

• Białka destabilizujące heliks

Synteza DnA rozpoczyna się od starterów RNA

Tm- temperatura w której 50% cząsteczek posiada przyłączone startery

Ta niższa od Tm o 5-10 ͦC

Termostabilne polimerazy DNA są wyszukiwane przez izolację i klonowane. Są również mutanty charakteryzujące się odmiennymi właściwościami, odmiana polimerazy Vent, która nie posiada aktywności egzoimzomerazy 3'-5'

Polimeraza	Aktywność	Źródło
Taq	-	Thermus aquaticus T1/2 w 95 ͦC - 1,6h
Pfm	+	Pyroceus furiosus
Vent	+

Termo stabilne polimerazy charakteryzują się dużą częstością błędu. Polimerazy nie posiadające egzonukleazy 3'-5' charakteryzują się większym błędem.

PCR- rozwiązywanie problemów metodycznych

• Brak produktu PCR lub jego małe stężenie

• Sekwencje startera

• Sprawdź komplementarność startera względem matrycy

• Starter powinien mieć zbliżoną T_m

• Sprawdź możliwość tworzenia struktur szpilki do włosów w sekwencji startera

• Unikać komplementarności sekwencji startera na 3'

• Stężenie substratów

• Optymalne 0,1-0,5 mM

• Zmniejszyc stężenie

• Jakość ekstraktu

• Inhibitory tj, DMSO, heparyna, EDTA, zalecana precypitacja etanolem

• Pary GC w matrycy

• Jeśli matryca zawiera >50% GC należy użyć….

• Stężenie matrycy

• By uzyskać produkt po 25-30 cyklach PCR należy zastosować (?) 104 kopie DNA

• Za dużo powoduje inhibicję PCR

• Stężenie Mg²⁺- wiązane przez startery, matrycę, polimerazę i DTP- dokładnośc reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów Mg, zastosowanie stężenia przewyższającego stężenie dNTP zwiększa dokładność polimerazy. Zalecana jest optymalizacja stężenia

• Temperatura anilingu

• Wartość kalkulacyjna

• Optymalizacja: zacząć od 5 ͦ C

• Profil termiczny

• Za krótki czas denaturacji

• Nieprecyzyjny produkt PCR

• Sekwencja starterów

• Stężenie starterów

• Obniżyć stężenie

• Zweryfikować stężenie wyjściowe

• Jakość ekstraktu

• Możliwa kontaminacja egzogennym DNA

• Stężenie Mg²⁺

• Obniżyć stężenie

• Profil termiczny

• Zwiększyć temperaturę przyłączania starterów

• Zredukować czas przyłączania starterów

• Zredukować liczbe cykli

• Zastosować metodę „hot-start”

• Aktywność polimerazy

• Za duzo jednostek

Ważne w reakcji PCR:

• Jakość i czystość odczynników

• Czystość podczas pracy- sterylne końcówki

• Fizyczne oddzielenie amplifikacji i izolacji

• Dokładność opisu próbek (pomyłki podczas izolacji)

• Błędy podczas rozpipetowania matrycy do probówek reakcyjnych

• Błędne rozcieńczenie matrycy

• Błędy w protokole