reakcja Feulgena, charakterystyczna dla kwasu deoksyrybonukleinowego; DNA ogrzewa się z kwasem solnym, a po dodaniu roztworu fuksyny uzyskuje się barwę fioletowoczerwoną; r

reakcja Feulgena, charakterystyczna dla kwasu deoksyrybonukleinowego; DNA ogrzewa się z kwasem solnym, a po dodaniu roztworu fuksyny uzyskuje się barwę fioletowoczerwoną; r. F. uwarunkowana jest obecnością deoksyrybozy; stosuje się m.in. do wybarwiania preparatów histologicznych.

Metoda Feulgena - wynaleziona przez Roberta Feulgena, pozwala na selektywne barwienie DNA lub materiału chromosomowego. Oparta na kwasowej hydrolizie DNA, które barwi się na czerwono. W określonych warunkach, może być wykorzystywana do kolorymetrycznego zwykle półilościowego (możliwe jest też ilościowe) oznaczania DNA w tkankach.

Reakcja przebiega w dwóch etapach. Najpierw badaną próbkę poddaje się działaniu HCl przez 8-10 min. w podwyższonej temperaturze. Następnie natychmiast traktuje się ją odczynnikiem Schiffa w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min., aż do momentu gdy tkanka nabierze purpurowego zabarwienia. Dalej materiał jest ugniatany w obecności acetoorceiny. Barwienie jest trwałe i preparat można przechowywać w obniżonej temperaturze, jakkolwiek zalecane jest wykonywanie analizy zaraz po barwieniu.

Kwasowa hydroliza pozwala usunąć zasady purynowe z DNA powodując odsłonięcie grup aldehydowych, które mogą wówczas reagować z odczynnikiem Schiffa, w wyniku czego pojawia się purpurowe zabarwienie. Jeśli aldehydy w próbie pochodzą wyłącznie z DNA, wtedy możliwe jest jego oznaczenie ilościowe. RNA nie ulega hydrolizie dzięki czemu metoda Feulgena jest DNA-selektywna.

* pozwala na specyficzne wykazania (w reakcji barwnej) obecności DNA w chromatynie jąder interfazowych i w chromosomach zarówno w komórkach roślinnych i zwierzęcych

* jedyna specyficzna metoda !!! (np. metoda Unny niespecyficzna-zieleń ma pownowactwo do DNA)

* jest to metoda ilościowa i jakościowa >> Mierzenie ilości DNA w cyklu komórkowym >> RNA się nie barwi, bo jest wypłukiwane w czasie hydrolicy

1 - hydroliza - w zależności od temp. Odpowiednia molalność kwasu > temp. Pokojowa 5m. Kwas solny > powoduje odszczepienie zasad purynowych i pirymidynowych przy węglu C1 >> hydroliza Feulgenowska - hydroliza wiązania n-glikozydowego przy węglu C1 deoksyrybozy w DNA

>> hydroliza nie może zajść za daleko>> stop zanim zaczną być usuwane histony

>powstaje apurynowe DNA a później odczepiają się zasady pirymidynowe

* hydroliza kwaśna (HCL, kwas cytrynowy lub octowy)>> By uwolnić grupy aldehydowe z deoksyrybozy

* połączenie grup aldehydowych z odczynnikiem Schiffa > Kompleks ten ma barwę czerwono-fioletową

* HCl>> Rozpuszcza pektyny, które są w blaszce środkowej (w kom. roślinnych) dzięki czemu łatwo uzyskać rozmaz

* produkt o barwie czerwonofioletowej>> Leukofuksyna łączy się i odtwarza się pierścień chinonowy > po przedłużeniu hydrolizy kwas apurynowy wypełznie do cytoplazmy

* Odczynnik Schiffa - otrzymuje się z fuksyny poprzez redukcje w ciemności >> Sulfonowa pochodna barwnika- fuksyny zasadowej lub pararozanieliny>> w stanie podstawowym ma kolor czerwony >> redukujemy fuksynę >> bezbarwna to odczynnik Schiffa>> środowisko uwalnia grupy aldehydowe które łączą się z odczynnikiem >> za barwę odpowiedzialne są wiązania sprzężone >> pierścień chinonowy

Fuksyna>> roztwór wodny, przy dostępie tlenu barwna>> po zredukowaniu jest bezbarwna (leukofuksyna = odczynnik Schiffa) Barwna dzięki pierścieniowi chinonowemu

[edytuj] Leukofuksyna>> przechowujemy w ciemności bez dostępu tlenu

* Produkt reakcji Feulgena>> powstały kompleks pomiędzy DNA a leukofuksyną jest barwny, ponieważ odtwarza się w nim pierścień chinonowy

6. przenieść korzenie na szkiełka podstawowe z wodą - preparat gnieciony- rozmazowy

* dobre przygotowanie odczynnika Schiffa (musi być bezbarwny);łatwo się utlenia

* eksperymentalne ustalenie optymalnego czasu reakcji z odczynnikiem Schiffa

* >> Czas utlenienia>> gdy zbyt długi będą się uwalniały grupy z lipidów i będą się barwić błony

* w roślinnym materiale pracujemy tylko na skrawkach>> Kwas nie penetruje organów

* * do diagnostyki chorób układu immunologicznego - choroby szpiku