II Spektrofotometria absorpcyjna.

Spektrofotometria wykorzystuje absorpcję promieniowania nadfioletowego (UV), widzialnego (VIS) i podczerwonego (IR), zachodzącą podczas przechodzenia jednego z tych rodzajów promieniowania przez badaną substancję.

Widmo promieniowania elektromagnetycznego - zbiór wszystkich fal elektromagnetycznych, uporządkowanych wg rosnącej długości fali.

Zakres nadfioletu UV - 200 - 380 nm

Zakres widzialny VIS - 380 - 780 nm

Absorpcja - przekształcenie energii promienistej w inne formy energii wskutek oddziaływania z materią.

Promieniowanie monochromatyczne - wiązka promieniowania elektromagnetycznego o jednakowych kwantach energii, to jest o jednakowej długości fali.

Roztwór odniesienia - roztwór stosowany do napełniania kuwety odniesienia podczas spektrofotometrycznego pomiaru próbek roztworowych. Najczęściej jest to rozpuszczalnik, a może to być ślepa próba.

Ślepa próba - roztwór przygotowany w ten sposób, aby kompensował absorbancję pochodzącą od czynników lub też składników różnych od oznaczanego.

Transmitancja T - stosunek natężenia wiązki promieniowania przepuszczonego przez próbkę do natężenia wiązki padającej:

Absorbancja A - logarytm dziesiętny odwrotności transmisji.

Współczynnik absorpcji a - stosunek absorbancji do grubości warstwy absorbującej (b) i stężenia substancji absorbującej (c).Jednostka:dm³cm^-1mol^-1

Współczynnik absorpcji molowy ε - grubość warstwy absorpcyjnej (b) wyrażona jest w cm, a stężenie (Cm) w molach substancji absorbującej na dm³;

Widmo absorpcji - widmo, które powstaje w wyniku przejścia promieniowania elektromagnetycznego przez ośrodek absorbujący.

Krzywa absorpcji - wykres zależności absorbancji od długości fali.

Krzywa wzorcowa - wykres zależności pomiędzy mierzoną wielkością a stężeniem oznaczanej substancji.

Bezpośrednia metoda spektrofotometryczna - metoda analityczna, w której podstawą oznaczeń jest selektywna absorpcja oznaczanego składnika.

Punkt izoabsorpcyjny - długość fali, przy którejwspółczynnik absorpcji dwóch lub więcej substancji są sobie równe.

Punkt izozbestyczny - punkt przecięcia szeregu krzywych absorpcji przy zmianie jednego z parametrów układu będącego w równowadze.

Prawo absorpcji - jeśli wiązka promieniowania monochromatycznego o natężeniu I₀ pada na warstwę substancji lub jej roztworu znajdującą się w kuwecie, to promieniowanie zostanie częściowo pochłonięte, częściowo odbite od ścianek kuwety lub rozproszone, a reszta przechodzi przez próbkę:

I₀=I_a+I_r+I_t

Pomiary absorpcji promieniowania wykonuje sie zawsze w zestawieniu z substancją lub roztworem porownawczym, używając możliwie identycznych kuwet.

Prawo Bouguera - Lamberta - natężenie promieniowania przechodzącego przez ośrodek absorbujący zmniejsza się w stosunku geometrycznym, gdy grubość warstwy rośnie w stosunku arytmetycznym:

I=I₀ e^-kl

Powyższą zależność przedstawia się w formie logarytmicznej:

A=ln I₀/I = kl

Do określenia ilości zaabsoorbanego promieniowania używa się także wielkości zwanej transmitancją (T), zdefiniowaną jako:

T = I/I₀

Prawo Beera - uzależnia ono natężenie promieniowania zaabsorbowanego od stężenia (c) substancji absorbującej.

I=I₀ e^-kc

Zestawiając te dwa prawa otrzymujemy:

I=I₀ 10^-εl

Ε- molowy współczynnik absorpcji

Prawo addytywności absorpcji - absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:

A=A₁+A₂+A₃+A₄+…+A_n

Prawo absorpcji w odniesieniu do roztworów są spełnione wtedy, gdy w roztworach tych nie zachodzą żadne reakcje między substancją absorbującą a rozpuszczalnikiem oraz między cząsteczkami substancji absorbującej.

Prawo absorpcji- podstawa oznaczeń spektrofotometrycznych:

A = ε c l= k c

A - absorbancja

Ε - współczynnik molowy absorpcji

C - stężenie substancji absorbującej

l - grubość warstwy ośrodka absorbującego

k - współczynnik zastępujący iloczyn ε l

2.Przyczyny występowania odstępstw od praw absorpcji:

-czynniki chemiczne - wynikają z reakcji przebiegających w roztworze absorbującym w miarę wzrostu stężenia składnika oznaczanego. Zachodzą wtedy reakcje polimeryzacji albo kondensacji cząsteczek lub jonów absorbujących, reakcje między jonem absorbującym i rozpuszczalnikiem.

-czynniki aparaturowe - które powodują odchylenie od praw absorpcji, są najczęściej związane z brakiem monochromatyczności wiązki promieniowania.

Błąd pomiaru zależy w dużym stopniu od jakości przyrządu.

3.Metody spektrofotometryczne.

a)metoda krzywej wzorcowej

Polega ona na ustaleniu zależności pomiędzy stężeniem substancji oznaczonej w roztworze a absorbancją. Jeżeli roztwór zachowuje się zgodnie z prawem Lamberta - Beera, zależność ta jest prostoliniowa. Absorbancję uzyskuje się przez porównanie pomiarów wykonanych dla roztworu substancji oznaczanej i odnośnika, to jest roztworu identycznego z badanym, nie zawierajacego tylko substancji oznaczanej. Stężenie substancji oznaczanej odczytuje się wprost z krzywej wzorcowej. Przy wykonywaniu krzywej absorpcji badanej substancji, w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku, ustala się położenie max absorpcji i odpowiadajacą mu długość fali. To max absorpcji przyjmuje się jako analityczną długość fali. Po ustaleniu analitycznej długości fali przygotowuje się serię roztworów oznaczanej substancji w tym samym rozpuszczalniku o różnych stopniowo wzrastających stężeniach. Absorbancje tych roztworów mierzy się przy analitycznej długości fali wobec odnośnika.

b)metoda spektrofotometrii różnicowej - stosuje się ją wtedy gdy T < 20%. Zaklada się że najmniej stężony wzorzec C₁ ma transmitancję T=100%. Zerowa przepuszczalność pozostaje taka, jak w normalnym pomiarze dla zaciemnionego detektora promieniowania. W ten sposób znacznie rozszerza się skalę pomiaru, a zatem zwiększa się czułość pomiaru w danym zakresie.W tej metodzie przez roztwory musi przechodzić intensywniejszy strumień świetlny, który uzyskuje się przez rozszerzenie szczeliny.

c)metoda analizy śladowej - mierzy się bardzo rozcieńczone roztwory (T<80%). Polega ona na zasadzie odwrotnej niż metoda różnicowa. Zerową transmitancję ustala się dla najbardziej stężonego roztworu c, a t=100% dla czystego rozpuszczalnika.

d)metoda rozciągniętej skali łączy cechy obu poprzednich metod.

e) miareczkowanie spektrofotometryczne - wykonuje się przy stałej długości fali. Do próbki dodaje się czynnik miareczkujący i bada się zależność absorbancji od objętości dodanego titrantu. Konieczne jest spełnienie prawa Lamberta - Beera. Titrant musi być dostatecznie stężony.

4.Analiza ilościowa.

Spektrofotometryczną analizę ilościową prowadzi się z zastosowaniem metod bezpośrednich i pośrednich.

-metoda bezpośrednia - podstawą oznaczeń jest selektywna absorpcja oznaczanego składnika.Tą metodą oznacza się głównie związki organiczne.

-metoda pośrednia - to ta w której pomiary absorbancji prowadzi się dopiero po przeprowadzeniu działań wywołujących absorpcję, której wartość jest proporcjonalna do stężenia oznaczanego składnika.Tą metodą oznacza się pierwiastki i związki nieorganiczne.

5. Wykonanie oznaczenia spektrofotometrycznego.

a)roztwory wzorcowe oznaczanego składnika.

Podstawowe roztwory substancji wzorcowej o stężeniu 1 mg/cm³ lub 10mg/cm³ przygotowuje się wychodząc przynajmniej z 2 odważek. Podczas oznaczeń, zależnie od czułości metody, korzysta się bezpośrednio z roboczych roztworów wzorcowych o stężeniach 0,1 mg/cm³ lub 0,01 mg/dm³. Przygotowuje się je przez odpowiednie rozcieńczenie roztworu podstawowego odpowiednim rozpuszczalnikiem.

b)przygotowanie krzywej wzorcowej

Krzywa wzorcowa określa zależność między mierzoną absorbancją, a stężeniem oznaczanego składnika w badanym roztworze. W celu sporządzenia krzywej przygotowuje się szereg roztworów roboczych substancji wzorcowej o różnych stężeniach. Zwykle przygotowuje się dwie serie roztworów, wychodzc z dwóch różnych podstawowych roztworów wzorcowych.Krzywą wzorcową przygotowuje się dla stężeń substancji, dla których absorbancje są nie większe niż 0,9 - 1,0.

c)wykonanie pomiaru

Należy unikać stosowania długości fal odpowiadających stromym częściom krzywej absorpcji, ponieważ drobne nieścisłości ustawienia długości fali powodują duże błędy.Podczas wyboru analitycznej dlugości fali trzeba uwzględniać absorpcję własną rozpuszczalnika i nie oznaczanych składników próbki.Pomiary absorbancji roztworów badanych i roztworów do krzywej wzorcowej wykonuje się w kuwetach takiej samej grubości. Należy tak manipulować kuwetami, aby nigdy nie dotykać powierzchni optycznej kuwet.

W czasie wykonywania oznaczenia spektrofotometrycznego należy pamiętać o addytywności absorpcji. Uzyskiwane widma są wynikiem sumowania absorbancji układu. Zastosowanie ślepej próby powoduje najczęściej, że mierzy się absorbancję tylko oznaczanego skladnika. Bardzo istotnym zagadnieniem jest stosowanie odpowiedniego rozpuszczalnika i kwasowości (pH) badanej próbki gdyż wpływają na widmo.