Metody oznaczania lekowrażliwości izolowanych drobnoustrojów

Metody oznaczania lekowrażliwości izolowanych drobnoustrojów

Metoda dyfuzyjno-krążkowa wykonywana w Polsce zgodnie z zaleceniami National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS

Podłoże badanie wykonywane jest na podłożu agarowym Mueller-Hintona (M-H) wzbogaconym w zależności od przeznaczenia np. krwią (paciorkowce) lub Isovitalexem (Haemophilus spp.); podłoże powinno być wystandaryzowane (odpowiedni skład, pH, grubość)

Inokulum hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu lub zawiesina w soli fizjologicznej o gęstości 0,5 w skali McFarlanda (dla niektórych gatunków bakterii wyższa); zawiesinę należy równomiernie rozprowadzić na powierzchni podłoża

Krążki krążki bibułowe nasycone określonym stężeniem antybiotyku; dobór krążków

jest oparty na zaleceniach Krajowego Konsultanta w zakresie Mikrobiologii Klinicznej*

Inkubacja temperatura: 35⁰C; czas: 18 godzin

Odczyt pomiar średnicy stref zahamowania wzrostu badanego szczepu wokół krążków nasyconych antybiotykami lub chemioterapeutykami

Interpretacja na podstawie wielkości stref zahamowania wzrostu (uwaga! niekiedy,

w zależności od firm produkujących krążki, interpretacja wielkości stref dla tych samych antybiotyków jest różna)

(*) Zestaw polecanych krążków z antybiotykami umożliwia:

Metody umożliwiające określenie MIC (minimal inhibitory concentration)

E-testy bibułowe paski nasycone antybiotykami w gradiencie stężeń z podziałką umożliwiającą odczyt wartości MIC (wartość najbliższa miejscu, w którym

nie ma już strefy zahamowania wzrostu); podłoże, inokulum, warunki inkubacji - takie jak w metodzie dyfuzyjno-krążkowej

metoda rozcieńczeniowa na podłoża (płynne lub stałe) zawierające kolejne rozcieńczenia antybiotyku posiewane są badane szczepy; po 18 godzinnej inkubacji wartości MIC odczytywane są na podstawie obserwowanego zahamowania wzrostu

Metody półautomatyczne lub automatyczne

Panele zawierające graniczne rozcieńczenia antybiotyków - odczytywane w systemie ATB lub Sceptor

Wykrywanie mechanizmów oporności bakterii na antybiotyki

Cel: określenie epidemiologii szerzenia się mechanizmów oporności w szpitalu

Wykrywanie klasycznych -laktamaz:

test cefinazowy - z użyciem chromogennej cefalosporyny (nitrocefina) wrażliwej na -laktamazy zarówno bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych - cefalosporyna ta ulegając hydrolizie zmienia barwę z żółtej na różową

metoda jodometryczna - do wykrywania penicylinaz (obecnie rzadko stosowana)

Wykrywanie -laktamaz typu ESBL

Zasada testów oparta jest na synergistycznym działaniu antybiotyków oksyimino-beta-laktamowych (cefotaksym, ceftazydym, aztreonam) i inhibitorów beta-laktamowych (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam); testy wykonywane są na podłożu Mueller-Hintona z zastosowaniem inokulum o gęstości 0,5 w skali McFarlanda

Test dwóch krążków (double disk synergy test - DDT) według metody Jarliera i wsp.

w odległości 20 mm od siebie należy umieścić krążek nasycony inhibitorem -laktamaz (amoksycylina z kwasem klawulanowym) i ceftazydymem, cefotaksymem lub aztreonamem;

interpretacja: pojawienie się dodatkowej, "dyskowatej" strefy zahamowania wzrostu między krążkami lub powiększenie strefy wokół krążka nasyconego antybiotykiem oksyimino--laktamowym od strony krążka z inhibitorem jest dowodem ekspresji ESBL.

E-test - pasek nasączony gradientem stężeń - z jednej strony ceftazydymu (TZ), z drugiej ceftazydymu z kwasem klawulanowym (TZL);

interpretacja: szczep wytwarza ESBL jeżeli iloraz wartości MIC dla TZ i MIC dla TZL jest wyższy od czterech (np. MIC dla TZ = 32; MIC dla TZL = 4;

iloraz = 8; wniosek: szczep ESBL-dodatni)

Metody automatyczne

ATB BLSE - w metodzie zastosowano: aztreonam ( stężenia: 0,5 - 8 mg/l)

aztreonam + sulbaktam ( stężenia: 0,06 - 1 mg/l)

ceftazydym ( stężenia: 0,5 - 32 mg/l)

ceftazydym + sulbaktam ( stężenia: 0,6 - 4 mg/l)

interpretacja: 4 - krotne zmniejszenie wartości MIC w obecności inhibitora jest dowodem ekspresji ESBL

Wykrywanie indukcyjnej -laktamazy

Test wykonywany jest na podłożu Mueller-Hintona z zastosowaniem inokulum o gęstości 0,5 w skali McFarlanda

Test dwóch krążków

w odległości 30 mm od siebie należy umieścić krążek nasycony silnym induktorem (imipenem, cefoksytyna) i krążek zawierający antybiotyk łatwo hydrolizowany przez

-laktamazy indukcyjne (ceftazydym);

interpretacja: "ugięcie" strefy zahamowania wzrostu wokół ceftazydymu od strony krążka z induktorem świadczy o zdolności szczepu do syntezy indukcyjnych -laktamaz

Wykrywanie metycylinooporności

Metoda dyfuzyjna - z zastosowaniem krążków zawierających metycylinę (5 g/ml) lub oksacylinę (g/ml); test wykonywany jest na standardowym podłożu M-H z inkubacją w temp. 30⁰C przez 24 godziny lub na podłożu M-H z 4,5% Na Cl w temp. 35⁰C przez 24 godziny

Metoda przesiewowa - posiew badanego szczepu na podłoże M-H zawierające metycylinę (25 mg/l) lub oksacylinę (6 mg/l)

ATB-OXA panel z oksacyliną; szczep zawieszany jest w specjalnym podłożu

ATB Na Medium zawierającym 5% NaCl

Cristal MRSA ID - panel z oksacyliną

Metody molekularne - wykrycie genu mec A z zastosowaniem techniki PCR

Wykrywanie opornych szczepów Enterococcus spp.

metoda dyfuzyjno-krążkowa z użyciem krążków zawierających wysokie stężenia gentamycyny (120 g) i streptomycyny (300 g)

metoda przesiewowa agar z wyciągiem sercowo-mózgowym (BHI) z dodatkiem gentamycyny (500 mg/l) lub streptomycyny (2 000 mg/l)

metoda dyfuzyjno-krążkowa z użyciem krążków zawierających wankomycynę

metoda przesiewowa podłoże BHI z dodatkiem wankomycyny (6 mg/l)

W każdym przypadku określania lekowrażliwości i mechanizmów oporności należy wykonywać kontrole stosowanych testów przy użyciu szczepów referencyjnych.

Oznaczenie poziomu antybiotyku w płynach ustrojowych

Powinno być określone w przypadku:

metody oznaczania lekowrazliwosci