Ćwiczenie 13

Restrykcja i modyfikacja DNA

Jednym z systemów ochrony DNA bakteryjnego jest system restrykcji i modyfikacji. W jego skład wchodzą endonukleazy restrykcyjne oraz metylazy, których zadaniem jest ochrona przed wniknięciem obcego DNA do komórki.

Dołączone materiały:

1. Przykłady enzymów restrykcyjnych typu II z uwzględnieniem rozpoznawanej sekwencji i sposobu cięcia DNA (rys. 1, 2).

2. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA otrzymanych w wyniku cięcia restryktazą (rys. 3).

3. Przykłady zastosowań enzymów restrykcyjnych typu II:
   a)    RFLP (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) jako kluczowe narzędzie w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych alleli u osobników (rys. 4);
   b)    klonowanie genów (rys.5).

Plan doświadczenia:
Na przykładzie systemu restrykcji i modyfikacji Escherichia coli typu B i typu K12 wykazać zjawisko restrykcji i modyfikacji, namnażając faga λ naprzemiennie na tych szczepach bakterii.

Materiały:

• nocne hodowle szczepów E. coli B i K12 w płynnym LB;

• podłoże stałe LB, płynne podłoże LB, podłoże LB 0,7% (agar miękki), chloroform, końcówki do pipet, krótkie probówki szklane, pipety pasterowskie, łaźnia wodna o temperaturze 42°C i 37°C.

Wykonanie:

• wylać 3 płytki z podłożem LB, a po zastygnięciu podłoża suszyć płytki przez 30 minut w suszarce;

• rozpuścić 0,7% agar na łaźni wodnej i rozlać po 3 ml do krótkich probówek;

• pozostawić probówki z agarem w łaźni wodnej w temperaturze 42°C, aby nie dopuścić do jego zestalenia;

• zrobić rozcieńczenia faga λ 10^-2, 10^-4, 10^-6 w podłożu LB;

• dodać po 100 μl faga z każdego rozcieńczenia i po 200 μl nocnej hodowli szczepu E. coli B do 3 ml rozpuszczonego agaru miękkiego LB, a następnie wylać jako drugą warstwę na płytkę z LB;

• inkubować przez 24h w 37°C;

• płytkę z rozcieńczeniem faga 10^-2 zalać 3 ml podłoża LB i odstawić na 20 min;

• po tym czasie zebrać podłoże z fagiem do krótkiej probówki, dodać 0,5 ml chloroformu i wirować 15 min przy 4000 obr/min;

• zebrać fazę górną do nowej probówki i powtórzyć chloroformowanie;

• zebrać fazę górną do nowej probówki i dodać 2 krople chloroformu, przechowywać w 4°C;

• z uzyskanego supernatantu zawierającego cząstki fagowe zrobić szereg rozcieńczeń (10^-2, 10^-4, 10^-6);

• wylać 6 płytek z podłożem LB, a po zastygnięciu podłoża suszyć płytki przez 30 minut;

• pobrać po 100 μl faga z każdego rozcieńczenia i dodać do kolejnych probówek z 3 ml rozpuszczonego agaru LB oraz dodać do wszystkich 3 probówek po 200 μl nocnej hodowli szczepu E. coli B;

• po energicznym zmieszaniu wylać szybko na płytkę z LB tworząc drugą warstwę, nie dopuścić do powstawania grudek zestalonego agaru;

• podobnie pobrać po 100 μl z rozcieńczeń: 10^-2, 10^-4, 10^-6 i dodać do kolejnych probówek z 3 ml rozpuszczonego agaru LB oraz dodać do każdej z trzech probówek po 200 μl nocnej hodowli szczepu E. coli K12;

• energicznie zmieszać i szybko wylać na płytkę z LB tworząc drugą warstwę;

• inkubować płytki w 37°C przez 24h, po tym czasie odczytać wyniki.

Opracowanie wyników:
Policzyć ilość otrzymanych łysinek faga na dwu różnych szczepach bakterii E. coli. Wyjaśnić na czym polega restrykcja DNA, a na czym modyfikacja zabezpieczająca przed zniszczeniem własnego DNA.

 

rys. 1

 

rys. 2

 

rys. 3

 

rys. 4

 

rys. 5