INHIBITORY KARIOKINEZY

Ocena potencjału mitodepresyjnego i mutagennego związku

* populację trzeba zsynchronizować

* liczenie cytometrem komórek o zawartości 2c lub 4c, przyporządkowanie do faz: G1, S, G2/M.

np. CKBM - zahamowanie przejścia G2/M (efekt: spadła ilość komórek 2c, wzrosła ilość 4c)

* hamowanie kinazy cdk -> hamowanie MPF -> brak mitozy !

* same liczby nie wystarczą do określenia działania związku, porównując populacje kontrolną i traktowaną trzeba jeszcze zbadać je pod mikroskopem:

Jeśli nie ma dzielących się komórek, to nie wchodzą one w mitozę (cytometr nie rozróżnia G2/M)

* INDEKS MITOTYCZNY - % dzielących się komórek (w 1000 komórkach populacji)

* INDEKS FAZOWY - % komórek w określonej fazie mitozy

Porównanie tych dwóch indeksów pozwala określić, czy związek zadziałał przed mitozą, czy w jej trakcie.

* INDEKS MIKROJĄDER - % komórek z mikrojądrami

mikrojądra - grudki chromatyny poza jądrem, występują wskutek błędów

Uszkodzenia DNA spowodowane przez mutageny

* MIEJSCE APURYNOWE (w miejscu zasady: grupa -OH; jeśli uszkodzenie DNA nie zostanie usunięte, podczas replikacji DNA może dojść do mutacji - podczas syntezy nici komplementarnej w pustym miejscu może pojawić się losowy nukleotyd)

* WIĄZANIE MIĘDZYNICIOWE

ZWIĄZKI ALKILUJĄCE (związki elektrofilowe, podstawiające grupę etylową lub metylową)
* reakcja z resztami kwasowymi - wytworzenie wiązań, co osłabia oddziaływanie między zasadami a deoksyrybozą, zerwanie nici -> przerwa dwuniciowa
* reakcja z zasadami - zmetylowanie zasady- źródło błędów w cyklu replikacyjnym

MUTAGENNE ANALOGI ZASAD AZOTOWYCH
(np. adenina -> merkaptopuryna, guanina -> tioguanina)
1) hamowanie aktywności syntaz deoksyrybonukleotydów
2) inkorporacja do DNA i podstawianie podczas replikacji niekomplementarnych zasad
3) tworzenie międzyniciowych wiązań w DNA

Miejsca DNA najbardziej podatne na uszkodzenia

1) DNA łącznikowe. Odcinek nukleosomowego DNA nawinięty na histony jest silniej chroniony przed dostępem związków mutagennych (silniejszy skręt spirali i zwiększenie bruzdy mniejszej DNA utrudniają interkalację). DNA łącznikowe (między histonami) jest łatwiej dostępne.

2) preferencyjne sekwencje regulatorowe leżące w rejonach promotorów wzmacniaczy i miejsc startu replikacji (sekwencje S/MAR)

3) DNA w stanie replikacji. Replikacja jest stanem zwiększającym podatność DNA na działanie mutagenów.spowodowane to jest: dekondensacją chromatyny, brakiem struktury nukleosomowej lub zmienioną formą nukleosomów. W widełkach replikacyjnych zasady są odsłonięte na atak.

4) PURYNY. Puryny są 20x bardziej podatne na mutacje (zwłaszcza guanina - ma najwięcej reaktywnych miejsc, podatnych na atak). Depirymidynacja zachodzi o wiele rzadziej (cytozyna jest najbardziej odporna).

Aberracje

1) Delecja - oderwanie fragmentu chromosomu
* terminalna - na końcu chromosomu
* interkalarna - w środku
2) Duplikacja - powtórzenie fragmentu sekwencji
3) Inwersja - przyłączenie fragmentu odwróconego o 180 stopni
4) Translokacja- przemieszczenie fragmentu chromosomu wewnątrz lub na inny chromosom

Skutki aberracji chromosomowej w mitozie

Chromosom acentryczny
nie został przyczepiony do mikrotubul,
chromosom pozostał po środku

Chromosom dicentryczny
z dwoma centromerami,
może zostać rozerwany lub utworzyć most chromosomowy

Inhibitory wrzeciona

* powodujące degradację MT przez hamowanie ich polimeryzacji: kolchicyna, alkaloidy Vinca
* hamujące dynamikę MT i stabilizujące ich strukturę: taksol

	typ zakłóceń	mechanizm działania	efekty
trucizny preprofazowe	efekt mitodepresyjny (podziały zachodzą rzadziej), efekt mitostatyczny (brak podziałów)	inhibicja syntezy DNA, RNA, białek; inhibicja metabolizmu oddechowego i innych szlaków metabolicznych; inhibicja specyficznych kinaz	zmniejszenie wartości indeksu mitotycznego; jeśli mitoza zajdzie: brak widocznych zakłóceń; często nie dochodzi do mitozy, komórka dzieli się rzadziej.
związki mutagenne (genotoksyczne)	efekt chromatoklastyczny (uszkodzenia chromosomów, nieprawidłowe ich zachowanie)	zmiany w strukturze DNA (np. zmiana sekwencji nukleotydów)	aberracje chromosomowe, zakłócenia w przebiegu mitozy, mitodepresja
inhibitory wrzeciona	efekt mitoklastyczny	depolimeryzacja lub stabilizacja mikrotubul wrzeciona	C-mitozy, poliploidyzacja komórek (u roślin)